一种亲水性整体材料及其制备和应用

本发明涉及一种亲水性整体材料的制备及应用，具体是在加热条件下，使带有环氧基团的单体异氰尿酸三缩水甘油酯(tgic)与带有仲胺基团的单体1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cyclen)发生环氧-胺开环聚合反应形成整体聚合材料，由于反应聚合过程中会产生大量的羟基，因此得到的材料具有良好的亲水性。可以作为亲水作用色谱的固定相，一方面用于毛细管液相色谱，用来分离极性小分子；另一方面，用作吸附剂，分离富集生物样品中的糖肽。

背景技术：

整体柱又称连续床，作为毛细管液相色谱的核心，可通过原位聚合制备，避免了填充柱复杂的填充制备过程，分离能力也高于开管柱，而且，整体柱具有连续的通孔结构和良好的渗透性，流动相可以快速通过其内部而不产生高背压，有利于实现快速分析。目前，整体柱已广泛用于高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)、毛细管电泳(capillaryelectrochromatography，cec)和毛细管液相色谱(capillaryliquidchromatography，clc)等方面(文献1.liul.h.,,et.al.,“methacrylate-bondedcovalent-organicframeworkmonolithiccolumnsforhighperformanceliquidchromatography”,journalofchromatographya,1479(2017)137-144；文献2.金灿等.“牛血清白蛋白修饰的有机-硅胶杂化整体柱的制备及电色谱研究”，分析化学，2018(10))文献3.linh.,et.al.“thiol-epoxyclickpolymerizationforpreparationofpolymericmonolithswithwell-defined3dframeworkforcapillaryliquidchromatography”,analyticalchemistry,87(2015)3476-3483)。整体材料分为无机整体材料、有机整体材料和有机-无机杂化整体材料。与无机整体材料和杂化整体材料相比，有机整体材料具有生物相容性好，ph值范围宽，制备工艺简单等优点。更为重要的是，可用于制备有机整体材料的单体种类丰富，可以根据不同的分离需求选择相应的制备单体种类，以满足特定的分离分析需求。因此有机整体材料一直是整体材料研究的一个热点。

蛋白质糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，在生物体众多的生命活动中起着十分关键的作用。人体中蛋白质的异常糖基化通常与某些疾病，如免疫缺陷、阿尔茨海默症、神经系统疾病和癌症等相关(文献4.ohtsubok；et.al.“glycosylationincellularmechanismsofhealthanddisease”.cell,126(2006)855-867)。因此，分析和鉴定糖基化蛋白质对疾病研究和疾病诊断具有重要意义。但是在生物样品中，糖基化肽段和糖基化蛋白质的丰度通常较低，对其分离和鉴定带来了很大的挑战。针对这一难题，目前已经发展出了多种糖肽富集方法，其中亲水相互作用色谱法(hydrophilicinteractionchromatography，hilic)因其可对糖肽进行无差别式富集且不破坏糖链结构等优点，得到越来越广泛的应用(文献5.muhammadsalmansajid,et.al.“taralouisepukala,fahmidajabeen,muhammadnajam-ul-haq.fabricationofpiperazinefunctionalizedpolymericmonolithictipforrapidenrichmentofglycopeptides/glycans”.analyticalchemistry,92(2020)683-689)。

目前已有多种整体材料被应用于hilic模式下的糖肽富集，但这些材料大多制备过程复杂，步骤繁琐，需要通过多步修饰来增加其亲水性。本发明通过“环氧-胺”开环聚合反应直接制备出了具有强亲水性的整体材料，整个过程仅需一歩即可完成，不需要任何后修饰过程。而且该方法即可用于制备毛细管亲水色谱的固定相，又可用于制备hilic的吸附剂，分离富集糖肽。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种“一步”制备亲水整体材料的方法及应用，具体是利用单体异氰尿酸三缩水甘油酯(triglycidylisocyanurate，tgic)中的环氧官能团与单体1,4,7,10-四氮杂环十二烷(1,4,7,10-tetraazacyclododecane，cyclen)中的仲胺基团在热引发的作用下发生环氧-胺开环聚合反应，在反应过程中会生成大量的羟基，因此所制备的整体具有很强的亲水性。该材料即可用作毛细管亲水色谱的固定相对极性小分子物质进行分离分析，同时还可用作亲水相互作用色谱的吸附剂对生物样品中的糖肽进行富集。

为实现上述目的，可按如下步骤操作，

1)向离心管中加入100～130mg异氰尿酸三缩水甘油酯；

2)向1)中加入1,4,7,10-四氮杂环十二烷，使仲胺基团与环氧丙基的摩尔(mol)比为2:3～3:2；

3)向2)中加入320～480μl的乙腈和220～260μl的聚乙二醇；

4)将3)中的混合体系在常温下超声使其完全溶解；

5)将步骤4)中所得到的混合溶液用注射器引入毛细管中，并用硅胶垫将两端密封，离心管中剩余的溶液用封口膜密封。

6)将5)中密封好的毛细管和离心管置于恒温水浴锅中，于40～60℃下反应12～15小时；

7)用乙醇洗涤6)得到的整体材料，除去致孔剂及未反应完全的物质，即可得到亲水性的整体毛细管柱/整体材料。

采用该方法制备亲水整体材料过程非常简单，仅需一歩加热反应即可，免去了传统亲水材料制备过程繁杂，需要多步修饰的缺憾，简化了制备过程。

本发明具有如下优点：

(1)制备过程简单，仅需一歩加热聚合反应即可完成亲水整体材料的制备，不需要任何后修饰步骤。

(2)所制备材料可直接用于亲水色谱固定相。

(3)所制备的材料可直接用于hilic模式下的糖肽富集。

附图说明

图1为亲水性整体材料的制备示意图。产物左侧柱状部分是整体产物的示意照片图；

图2为亲水性整体材料及其制备单体的傅里叶变换-红外光谱对比图。

图3为亲水整体材料(实施例1和2)的扫描电镜图。

图4为酰胺类化合物在毛细管亲水整体柱(实施例1)上的分离色谱图。

图5为亲水整体材料的水接触角图(实施例1)。

图6为苯酚类物质(a)和苯胺类物质(b)在毛细管亲水整体柱(实施例1)上的分离色谱图。

图7为实施例1中亲水性整体材料对人血清免疫球蛋白(igg)酶解液富集前(a)后(b，c)的质谱对比图。

图8为实施例2中的亲水整体材料对人血清免疫球蛋白(igg)酶解液富集后的质谱图。

具体实施方式

实施例1：

亲水整体柱的制备：

1)在离心管中，加入118.8mg异氰尿酸三缩水甘油酯；

2)向上述离心管中加入51.6mg的1,4,7,10-四氮杂环十二烷；

3)向上述离心管中加入418.4μl乙腈和222.4μl的聚乙二醇(平均分子量200)；

4)将上述混合体系常温下30min超声溶解混匀；

5)将步骤4)中得到的混合溶液用注射器引入到已预先经过3-氨丙基三乙氧基硅烷活化处理的毛细管(长25cm，内径75μm)中，随后毛细管两端用硅胶封口，然后将装有剩余混合液的离心管密封；

6)将步骤5)中的毛细管和离心管置于50℃水浴锅中反应12小时，反应结束后离心管中的混合液成白色的固体。

7)用乙醇冲毛细管，将其中的致孔剂及一些未参与反应的物质冲出即得到毛细管整体柱。对离心管中的则用乙醇反复浸泡洗涤24小时即得到亲水性整体材料。

实施例2：

.亲水整体柱的制备：

1)在离心管中，加入118.8mg异氰尿酸三缩水甘油酯；

2)向上述离心管中加入51.6mg的1,4,7,10-四氮杂环十二烷；

3)向上述离心管中加入386.4μl乙腈和255.2μl的聚乙二醇(平均分子量200)；

4)将上述混合体系常温下30min超声溶解混匀；

5)将步骤4)中得到的混合溶液用注射器引入到已预先经过氨丙基三乙氧基硅烷活化处理的毛细管(长25cm，内径75μm)中，随后毛细管两端用硅胶封口，然后将装有剩余混合液的离心管密封；

6)将步骤5)中的毛细管和离心管置于50℃水浴锅中反应12小时，反应结束后离心管中的混合液成白色的固体。

7)用乙醇冲毛细管，将其中的致孔剂及一些未参与反应的物质冲出即得到毛细管整体柱。对离心管中的则用乙醇反复浸泡洗涤24小时即得到亲水性整体材料。

igg酶解样品的制备：首先将2mg人血清免疫球蛋白(humanimmunoglobuling，igg)溶解于含终浓度8m尿素的100mm碳酸氢铵缓冲液(ph＝8.3)中，然后加入20μmoldtt在60℃时还原1h，再加入7.4mgiaa室温下避光反应40min。反应结束后，加入100mm碳酸氢铵缓冲液(ph＝8.3)将溶液中的尿素浓度稀释至1m，随后按照酶和底物的质量比为1:25的比例加入胰蛋白酶，37℃下反应16h。蛋白酶解液经tfa酸化(ph＝2)后用自制的c18-spe柱除盐，冷冻干燥后置于-20℃下保存。

标准糖蛋白酶解液的富集：首先5mg离心管中获得的亲水性整体材料用200μl上样液(acn/h2o/tfa，85/14/1，v/v/v)洗两次，固液分离后，于固体整体材料中加入200μl上样液(acn/h2o/tfa，85/14/1，v/v/v)和10μg的igg酶解液冻干粉；然后在室温下轻微振荡孵育30min，离心弃去上清，再用上样液(200μl×3次)洗去材料上的非特异性吸附，除去液体，最后用100μl洗脱液(acn/h2o/tfa，30/69/1，v/v/v)将材料上富集到的糖肽洗脱下来。所得洗脱液用maldi-tofms分析。

产物表征与应用

图2为实施例1亲水整体材料及其制备单体的傅里叶变换-红外光谱对比图。图中显示1,4,7,10-四氮杂环十二烷的红外谱中出现了明显的波数在3326cm^-1处的仲胺峰。在图2b中，波数在759和926cm^-1之间的峰对应于异氰尿酸三缩水甘油酯中环氧基的特征吸收(对称和不对称伸缩振动)。而在聚合反应后得到的整体材料中，759和926cm^-1之间的峰强度明显减弱(图2c)，表明大部分环氧基已被消耗。从图2c还可以看出，在波数在3380cm^-1附近出现了一个很强的特征吸收峰，其对应-oh基团的红外吸收峰，这些变化证明了整体材料是通过环氧-胺开环反应所制备，而且聚合物中含有大量的-oh基团。

图3为亲水整体材料(实施例1和2)的扫描电镜图：实施例1：a为放大1000倍，b为放大5000倍；图中可以清晰看到整体材料中存在不同尺寸的孔，且孔分布比较均匀，基质与毛细管内壁结合紧密，无脱壁现象。实施例2：c为放大1000倍，d为放大5000倍；致孔溶剂的配比会对整体材料的最终形貌产生很大的影响，与实施例1相比，实施例2中致孔剂中的良溶剂(聚乙二醇)含量过多，导致整体材料形貌较为致密，缺乏可使流动相自由出入的大孔，所制备的毛细管整体柱通透性较差，流动相阻力很高，不适用于液相色谱的分离分析。

图4为酰胺类化合物在毛细管亲水整体柱(实施例1)上的分离色谱图。实验条件：柱长，20cm；流动相为乙腈/水(v/v,95/5)，b为乙腈/水(v/v,60/40)；流速：a为100μl/min，b为200μl/min(分流前)。色谱图的出峰依次为1：甲苯，2：n,n-二甲基甲酰胺，3：丙烯酰胺，4：硫脲，出峰顺序按物质的亲水性从弱到强，为典型的亲水保留机理。

图5为亲水整体材料的水接触角图(实施例1)。材料的水接触角为18°，表明其具有良好的亲水性。

图6溶液中苯酚类物质混和物(a)和苯胺类物质混和物(b)在毛细管亲水整体柱(实施例1)上的分离色谱图。实验条件：柱长，20cm；流动相，乙腈/水(v/v,60/40)；流速：a，175μl/min；b，185μl/min(分流前)。

色谱图6a中的出峰顺序依次为：为对叔丁基苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚以及邻甲酚。五种苯酚类物质成功实现了基线分离，尤其是难以分离的苯二酚三种同分异构体得到了很好的分离；图6b中出峰顺序依次为：2,4-二氨基甲苯、4-氨基联苯、萘胺、2-氨基芴以及4-硝基-1,3-苯二胺。这五种碱性化合物的色谱峰峰型对称，没有出现拖尾现象，基本达到了基线分离，整个过程可在10分钟之内完成。这些实验结果说明，本发明所制备的毛细管亲水整体柱对极性小分子物质具有较高的分离分析能力。

图7为实施例1中亲水性整体材料对人血清免疫球蛋白igg)酶解液富集前(a)后(b)的质谱对比图。

采用标准蛋白(人血清免疫球蛋白，igg)评价材料的糖肽富集效果，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)进行检测。如图7a所示，富集前，谱图中强度较高的信号峰绝大多数为非糖肽峰，糖肽的信号收到严重抑制。用实施案例1制备的亲水材料富集后，如图7b所示，非糖肽信号明显降低，糖肽信号得到显著增强，可以检测到18条典型的n-连接糖肽，为了验证7b中富集到的都是糖肽，我们进一步采用pngasef酶对7b中的糖肽进行了去糖基化处理(图7c)。结果发现，图7b中的糖肽信号基本消失，中仅能见到两条明显的肽段信号(eeqfnstfr，m/z＝1157.92；eeqynstyr，m/z＝1189.87)，说明从igg中所富集的肽段均为糖肽。

表1亲水性整体材料(实施例1)富集到的igg酶解液中糖肽的分子量及糖型组成

n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。

图8为实施例2中的整体材料也应用于对人血清免疫球蛋白igg)酶解液的富集，结果仅可以检测到11条典型的n-连接糖肽，低于同等条件下实施案例1所制备的材料的糖肽富集效果。这可能是由于在整体材料的制备过程中，致孔溶剂的配比会对整体材料的最终形貌产生很大的影响，而在实施案例2中，致孔溶剂中良溶剂(聚乙二醇)的含量过多，导致合成的整体材料过于致密，缺乏可使液体自由流动的大孔结构，导致液体进入材料内部的阻力较大，因而可被利用的亲水活性位点较少，进而导致富集糖肽的效率下降。

表2亲水性整体材料(实施例2)富集到的igg酶解液中糖肽的分子量及糖型组成

n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。