一种多功能微流控芯片及其制备和应用的制作方法

本发明属于微流控生物芯片检测
技术领域：
，具体为一种多功能微流控芯片及其制备和应用。
背景技术：
：随着基因扩增反应与分析技术在检测方面的不断成熟，结合微流控生物芯片技术、恒温扩增反应与分析技术和共聚焦扫描检测技术方面研究成果的恒温扩增核酸分析仪在临床诊断中逐渐普及，该仪器实现了细菌感染病原学的快速诊断，解决传统细菌培养检测法存在的缺陷，对于疾病的诊断、防控有着重要意义。恒温扩增核酸分析仪作为一款集成光源、光路及信号采集系的精密仪器，对检测的灵敏度要求极高。使用时间延长产生的光源衰减，运输期间的光路漂移，使用过程中的pmt抖动等微小变化，都可能对结果的判读产生影响，因此采用合适的方法在样品检测的同时监测仪器的荧光波动情况是非常必要的。目前，仪器的监测方法主要是采用荧光纳米材料制作的校准芯片或者有机荧光染料制作的校准芯片进行校准。该校准芯片被定期用于恒温扩增仪器的荧光信号校准，但在两个校准间隔期内或在仪器使用过程中，可能会出现因pmt抖动带来的荧光波动，从而导致样品检测结果异常。另外，目前用于样品检测的微流控芯片因加工工艺的问题导致部分芯片机械定位豁口偏移，在原料检、过程检、成品检验过程中采用抽检的方式，不能很好的将问题芯片挑出，最终导致用户在使用芯片进行检测样品时，仪器检测的数据与孔位印制的信息不匹配，造成无法判读或判读失误的现象。技术实现要素：为解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种多功能微流控芯片及其制备和应用，本发明微流控芯片可以同时进行样品检测和仪器监测，以实现在样品检测的同时监测仪器的运行情况。本发明目的通过以下技术方案来实现：一种多功能微流控芯片的制备方法，所述多功能微流控芯片的制备方法为选择一个设置有n个反应池的微流控芯片，其正面的部分孔位已完成样品检测用引物的点制及盖片封装，在其背面反应池选择m个孔位，并在选择的孔位内点制荧光纳米混合液，将点制好的芯片晾干，并进行表面覆膜，得到多功能微流控芯片，其中，n>m≥1。进一步，所述m个孔位应为芯片正面反应池内未印制样品检测用引物的孔位。进一步，所述晾干为自然晾干20-30min，晾干后肉眼观察荧光纳米混合液形成的样品点呈乳白色且无裂痕为合格片。一种多功能微流控芯片，采用上述所述的制备方法制备得到。一种多功能微流控芯片的应用，所述多功能微流控芯片在同时实现样品检测和仪器监测中的应用。进一步，所述多功能微流控芯片同时实现样品检测和仪器监测，包括以下步骤：1)将多功能微流控芯片置于标准仪器上，用校准软件进行扫描，收集已点制荧光纳米混合液孔位反应池的荧光值，并记录为标准荧光值；2)将待测样品与扩增试剂混合后加入上述多功能芯片上，离心，置于检测仪器上，用样品检测软件进行扫描；3)收集已点制荧光纳米混合液孔位反应池的荧光值，并记录为反应荧光值，将已点制荧光纳米混合液孔位反应池的反应荧光值和标准荧光值进行比较，进而实现对仪器的监测；4)样品扫描过程中，在芯片的各个反应池中同时进行独立的恒温扩增反应并进行实时荧光检测，若检测到某反应池出现“s”形扩增曲线，则该反应池对应的检测指标为阳性。进一步，所述多功能微流控芯片在收集标准荧光值的过程中，可监测芯片机械定位的准确性，剔除掉因加工工艺导致的定位豁口失准的芯片，包括以下步骤：1)将多功能微流控芯片置于标准仪器上，用校准软件进行扫描，收集各个孔位的荧光值；2)根据点制过荧光纳米混合液的孔位的荧光值比其它未点制孔位的荧光值高的特点，可以得出仪器定位的点制荧光纳米混合液的孔位信息，将此孔位信息与实施点制的孔位信息作比较，即可判定该多功能微流控芯片机械定位的准确性。进一步，若仪器定位的点制荧光纳米混合液的孔位信息与实施点制的孔位信息一致，说明该芯片机械定位准确，反之，说明该芯片机械定位失准，应剔除为不合格芯片。进一步，每个已点制荧光纳米混合液孔位的反应荧光值/标准荧光值＝0.85～1.15，则认为仪器在进行样品检测时未发生或发生微小荧光波动，但不影响样品检测的结果，样品检测结果有效。进一步，任意一个已点制荧光纳米混合液孔位的反应荧光值/标准荧光值＞1.15或＜0.85，则认为仪器在进行样品检测时荧光波动较大，仪器出现问题，需要重新校准或维修，样品检测结果无效。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明多功能微流控芯片为集样品检测和仪器监测为一体的芯片，可以在收集标准荧光值的过程中，同时监测芯片机械定位的准确性；在使用本发明多功能微流控芯片进行样品检测时，即收集反应荧光值的过程中，可实时监测检测仪器的整体运行情况，包括仪器电机每一圈运行的平稳性，仪器光学系统是否存在光衰减或者热干扰问题，进而实现对仪器的监测，保证样品检测结果的有效性。附图说明图1为微流控芯片的结构示意图；图2为多功能微流控芯片同时实现样品检测和仪器监测的流程示意图；图3为点制荧光纳米样品孔和待测样品孔实时荧光值曲线图；附图标记：1-出样口ⅰ，2-进出样口ⅱ，3-反应池，4-主管道具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合具体原理及过程对本发明一种多功能微流控芯片的制备方法，多功能微流控芯片及其同时实现样品检测和仪器检测的应用进行详细说明。一种多功能微流控芯片的制备方法，所述多功能微流控芯片的制备方法为选择一个设置有n个反应池的微流控芯片，其正面的部分孔位已完成样品检测用引物的点制及盖片封装，在其背面反应池选择m个孔位，并在选择的孔位内点制荧光纳米混合液，将点制好的芯片晾干，并进行表面覆膜，得到多功能微流控芯片，其中，n>m≥1。微流控芯片的结构示意图如图1所示，其形状可以为圆形、扇形或其它结构，反应池的个数也可以根据实际需要进行设定或调整。微流控芯片的正面设有进出样口ⅰ1、进出样口ⅱ2反应池3及液体流通的主管道4，在其正面的反应池中点制样品检测用引物，检测样品时，将扩增试剂与待测样品核酸混合后通过进出样口ⅰ1、进出样口ⅱ2注入到芯片内的主管道4，主管道4中液体通过离心分配至各个反应池3，在芯片的各个反应池3中同时进行独立的扩增反应并进行实时荧光检测，实现对靶基因的扩增和检测。微流控芯片的背面为一个平面，选择在该平面反应池的位置点制荧光纳米混合液，一方面可以实现检测仪器对该混合物荧光信号的准确采集，另一方面可以有效的避免因扩增试剂和荧光纳米混合液混合，造成荧光纳米混合液发光不稳定性的现象。荧光纳米混合液点制后，需自然晾干20-30min，使荧光纳米混合液充分干燥呈乳白色且无裂痕的样品点，经表面覆膜隔离外部影响，保持样品点荧光信号的稳定性。进一步，所述荧光纳米混合液为琼脂糖溶液与荧光纳米配制成混合液，其中琼脂糖溶液的浓度为0.5％，荧光纳米的浓度为10％，其体积混合比例为3～5:1，取2微升点到芯片上。进一步，所述晾干为自然晾干20-30min，晾干后肉眼观察荧光纳米混合液形成的样品点呈乳白色且无裂痕为合格片。进一步，表面覆膜选择无色或淡黄色胶膜，一侧为基材，一侧为有离型纸，覆膜时，用镊子揭开离型纸，将基材覆盖到已干燥的荧光纳米样品点上，覆膜应平整无气泡产生。胶膜采用本领域常规，可以直接购买得到的即可。进一步，所述m个孔位应为芯片正面反应池内未印制样品检测用引物的孔位。要求正面对应的反应池未点制检测样品用引物，可以避免样品检测时同一孔位正面样品检测产生的荧光信号对荧光纳米混合液产生的荧光信号的干扰。一种多功能微流控芯片，采用上述所述的制备方法制备得到。一种多功能微流控芯片的应用，所述多功能微流控芯片在同时实现样品检测和仪器监测中的应用。进一步，所述多功能微流控芯片同时实现样品检测和仪器监测，如图2所示，包括以下步骤：1)将多功能微流控芯片置于标准仪器上，用校准软件进行扫描，收集已点制荧光纳米混合液孔位反应池的荧光值，并记录为标准荧光值；2)将待测样品与扩增试剂混合后加入上述多功能芯片上，离心，置于检测仪器上，用样品检测软件进行扫描；3)收集已点制荧光纳米混合液孔位反应池的荧光值，并记录为反应荧光值，将已点制荧光纳米混合液孔位反应池的反应荧光值和标准荧光值进行比较，进而实现对仪器的监测；4)样品扫描过程中，在芯片的各个反应池中同时进行独立的恒温扩增反应并进行实时荧光检测，若检测到某反应池出现“s”形扩增曲线，则该反应池对应的检测指标为阳性。进一步，所述多功能微流控芯片在收集标准荧光值的过程中，可监测芯片机械定位的准确性，剔除掉因加工工艺导致的定位豁口失准的芯片，包括以下步骤：1)将多功能微流控芯片置于标准仪器上，用校准软件进行扫描，收集各个孔位的荧光值；2)根据点制过荧光纳米混合液的孔位的荧光值比其它未点制孔位的荧光值高的特点，可以得出仪器定位的点制荧光纳米混合液的孔位信息，将此孔位信息与实施点制的孔位信息作比较，即可判定该多功能微流控芯片机械定位的准确性。进一步，若仪器定位的点制荧光纳米混合液的孔位信息与实施点制的孔位信息一致，说明该芯片机械定位准确，反之，说明该芯片机械定位失准，应剔除为不合格芯片。进一步，每个已点制荧光纳米混合液孔位的反应荧光值/标准荧光值＝0.85～1.15，则认为仪器在进行样品检测时未发生或发生微小荧光波动，但不影响样品检测的结果，样品检测结果有效。进一步，任意一个已点制荧光纳米混合液孔位的反应荧光值/标准荧光值＞1.15或＜0.85，则认为仪器在进行样品检测时荧光波动较大，仪器出现问题，需要重新校准或维修，样品检测结果无效。标准荧光值和反应荧光值是对一张芯片同一荧光纳米样品点的荧光信号采集，前者是出厂前在标准检测仪器上采集的数据，后者是在用户使用的检测仪器上采集的数据，两组数据做比较，即可反应出用户使用的仪器与标准仪器之间的差异。0.85～1.15这个合格范围是参考检测仪器出厂前与标准仪器一致性的标准制定，适合使用该校准芯片匹配的所有检测仪器。实施例1本实施例一种集样品检测和仪器监测为一体的多功能微流控芯片的制备方法如下：1、选择一个市售的呼吸道病原菌核酸检测芯片，该芯片仅具有对8种呼吸道病原菌进行检测的功能，该芯片为设置有24个反应池的微流控芯片，该微流控芯片通过pvc塑料材质加工而成，该芯片正面的反应池中对应的检测指标如表1所示：表1呼吸道病原菌核酸检测芯片正面的反应池中对应的检测指标2、用0.5％琼脂糖溶液与10％荧光纳米颗粒的体积按4:1的比例配制成混合液。3.在该芯片背面反应池选择1号孔位，1号孔位对应的芯片正面反应池内未印制检测样品用引物，在选择的孔位内点制2微升荧光纳米混合液；4.将上述点制好的芯片自然晾干25min，肉眼观察样品点呈乳白色且无裂痕；5.将上述点制荧光纳米混合液的孔位覆一层无色胶膜，并保持覆膜区域无气泡，即可得到本实施例多功能微流控芯片。多功能微流控芯片械定位准确性判定：将多功能微流控芯片置于恒温扩增标准仪器上，用校准软件进行扫描，收集仪器定位的各个孔位的荧光值，具体如表2所示：表2仪器定位的各个孔位的荧光值仪器定位的反应池编号标准荧光值仪器定位的反应池编号标准荧光值150119.213254822536.7142674.332603.9152516.942543.5162472.852556.4172484.662564.7182488.572567.5192464.782573.2202498.492563.3212477.4102567.8222477.3112567.4232542.7122569242475.4观察以上各个反应池的荧光信号值，仪器定位的1号反应池的荧光信号强度明显高出其他23个孔位，与芯片制备时荧光纳米混合液点制的孔位信息一致，故可判定此张芯片定位准确，反之，若不一致说明芯片定位失准；其中，芯片机械豁口对准的孔位可在芯片加工时任意选择，本实施例芯片机械豁口对准的孔位为1号孔位。在进行械定位准确性判定的过程中，收集到1号孔位反应池荧光值为50119.2，记录为标准荧光值。本实施例多功能微流控芯片进行样品检测与仪器监测的具体过程如下：1、按照呼吸道病原菌核酸检测试剂盒的说明书进行操作，取试剂盒中恒温扩增试剂20微升，加入34.5微升待测样品，待测样品选用已经过测序验证的参考品p1，p1的成分为肺炎链球菌基因组dna，混合均匀后，取50微升上述混合液加入上述多功能微流控芯片上，并将液体离心至反应池内(在离心的作用下平均分配到所有的反应池)，然后置于恒温扩增仪器上；2、运行样品检测的恒温扩增程序，待程序运行结束后，通过软件导出1号反应池的荧光信号值为53256.58，并记录为反应荧光值；3、将反应荧光值与标准荧光值进行比较，计算其比值53256.58/50119.2＝1.06，满足设定约束要求：1号孔位的反应荧光值/标准荧光值＝0.85～1.15，说明检测仪器较稳定，检测结果可靠；当比值不满足约束要求时，表明该仪器在运行过程中荧光信号有波动，且已偏离标准范围，本次样品检测的结果无参考意义，需在确保仪器正常的情况下重新检测该样本。本实施例多功能微流控芯片的样品检测结果如表3所示，从结果可看出，检测结果显示为肺炎链球菌阳性，与我们加入的核酸样本型别一致。表3样品检测结果同时，将样品检测的过程中点制荧光纳米混合物的孔1和待测样品检测孔2的实时荧光值进行作图，结果如图3所示。图3显示，在使用多功能芯片进行样品检测过程中，孔1实时监测数据稳定，孔2稳定的进行扩增并呈标准的s形曲线，互不干扰，实现在样品检测的同时进行仪器监测的功能。将待测样品替换为本实施例芯片能检测8种呼吸道病原菌中的其它菌种，也能实现和肺炎链球菌相同的技术效果。或者将本实施例芯片替换成能实现其它类型菌种检测的芯片，也能达到和本实施例芯片检测相同的技术效果，本发明多功能微流控芯片在同时实现样品检测和仪器监测具有普遍适用性。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12