基于3D纳米孔状结构的血液分离和分析器件的制备方法及应用与流程

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件的制备方法及应用。

背景技术：

用于快速体外检测(invitrodiagnostic(ivd)andpoint-of-care(poc))血液成分的基于比色法的纸芯片器件首先需要使用一些方法分离血浆和血细胞。随后对分离的血浆进行检验。这些分离方法需要使用额外的化学试剂或昂贵滤纸，这都增加了poc器件的制造成本和结构复杂程度。

目前用于poc/ivd纸基芯片的血液分离技术主要分成2大类，第一类是膜过滤法(membraneseparation)，膜过滤法的种类大致分为两小类：横向分离法(lateralseparation)和纵向分离法(verticalseparation)。横向分离法主要原理是通过血细胞和血浆在特定纸或者膜中的流速不同而产生的滞留时间(retentiontime)不同，从而分离血浆和血细胞。纵向分离法主要是通过使用低孔径过滤膜过滤除去血细胞。第二类主要是红血球凝聚法(separationbasedonhemagglutination)。该方法通过在纸上涂层红细胞凝聚素(hemagglutinin)来凝聚红细胞，从而分离红细胞和血浆。

横向膜过滤法(lateralseparation)：该方法主要通过使用薄膜或者滤纸(lf1,mf1,vf1和vf2等)过滤血细胞。原理是通过血细胞和血浆在该多孔材料中的流速不同从而过滤。血细胞由于体积大从而会被多孔材料捕获甚至停留在表面,而血浆则会持续流动到信号响应区域。该方法的poc/ivd芯片主要分为两大区域：(1)捕获区(trappingzone),(2)反应区(sensingzone)。捕获区和反应区相互平行并常使用不同的两种材料。此方法缺点：

(1)制作繁琐，需要最少2种基底材料通过特殊的粘合技术结合在一起，并且对于材料孔径挑剔。

(2)过滤效率低，对于高血球密度或者高血红蛋白浓度的样品无法做到良好过滤。

(3)反应区底物浓度需求大，由于并不能有效完全过滤血液中的大分子干扰，导致酶的效率低下，从而在反应区不得不使用高浓度反应物来提高信噪比。

(4)流速度缓慢，血液需要流动较长时间才能到达反应区域，从而影响后续的测试速度。

(5)保存时间短，由于酶直接附着在纸质基底上导致酶容易失活，从而导致产品保质期短。

纵向膜过滤法(verticalseparation)：该方法主要通过使用小孔径(小于红细胞直径)过滤薄膜(pallbloodseparationmembrane等)来过阻挡血液中的大体积血细胞流动从而分离血细胞和血浆。血浆可以通过重力作用穿过这种多孔结构达到下层区域。使用该方法的poc/ivd芯片主要分为两大层次(1)过滤层(trappinglayer),(2)反应层(sensinglayer).两层之间常常纵向堆叠。此方法缺点：

(1)制作繁琐，需要最少两层结构通过特殊的粘合技术结合在一起。

(2)造价昂贵，此种血液过滤薄膜技术被pall^tm垄断导致其价格及其昂贵。

(3)过滤速度缓慢，由于这种单方向的过滤结构导致过滤速度缓慢，从而影响后续的测试速度。

(4)保存时间短，由于酶直接附着在纸质基底上导致酶容易失活，从而导致产品保质期短。

红血球凝聚法(separationbasedonhemagglutination)：该方法主要通过在样品装载区(loadingzone)涂抹红血球凝聚素来凝聚并且沉淀红包，从而达到分离红细胞和血浆。被分离的血浆继续扩散到达反应区域。使用该方法的poc/ivd芯片主要分为两大区域(1)装载区(loadingzone),(2)反应层(sensingzone)。两大区域可以构建在同一基底上。对基地材料的物理性质孔径大小并无特殊要求。此方法缺点：

(1)过滤效果欠佳，由于红血球凝聚素的构建结构为2d，所以时常有底部血液沉淀而顶部血液未充分沉淀就已经流入反应区域的情况

(2)只沉淀红细胞，由于红血球凝聚素只结合并沉淀红细胞，对红细胞以外的细胞和大颗粒(如血小板和白细胞)并无过滤效果。因此并不能很好的降低后续分析测试干扰。

(3)保存时间短，由于酶直接附着在纸质基底上导致酶容易失活，从而导致产品保质期短。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供一种基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件的制备方法及应用，使用的3d纳米孔状结构材料可以同时实现分离和比色法检验且不需要提前分离血浆和血细胞。本发明使用一种水凝胶高分子材料：聚乙二醇二丙烯酸酯(peg-da)。此材料在含水时具有纳米孔结构，此结构能包裹包覆比色反应物，比色反应物包括但不限于葡萄糖氧化化酶(gox)，辣根过氧化物酶(hrp)，3,3'-二氨基联苯胺(dab)；且允许小于其孔径的物质渗透至材料内部:渗透小于孔径的物质比如葡萄糖；且阻拦大于孔径的物质比如血细胞。

一种基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件，由以下的制备方法所得，制备方法包括以下步骤：

(1)100mg/ml的聚乙二醇二丙烯酸酯作为前驱物；

100mg/ml安息香双甲醚溶解于1-乙烯基-2-吡咯烷酮作为光引发剂溶液；

前驱物和比色反应溶液按照1:1体积比混合；再按照1：10体积比加入光引发剂溶液至前驱物和比色反应混合溶液；

(2)将步骤(1)获得的材料溶液加入到聚二甲基矽氧烷制成的模组中，用365纳米紫外光照射1分钟完成胶体聚合反应，得到胶体；

(3)胶体从模组中取出，粘附在支撑材料上，支撑材料可以为透明膜，组装成器件。

优选的，所述的比色反应溶液为葡萄糖氧化化酶、辣根过氧化物酶、3,3'-二氨基联苯胺混合饱和溶液。

胶体的形状包括可以为圆形、三角形、长方形、正方形和椭圆形或者其他任意形状，大小(直径或长度)可以从1mm到10mm。

本发明利用胶形成的纳米孔径3d的结构包裹或者覆盖反应物，从而使得从大分子中分离小分子，可以用于血液分离，实现分离和反应能够在同一结构中完成，可以不需要多层构造。这种方法过滤效果优秀,成本低廉，制作简单。同时由于聚乙二醇二丙烯酸酯形成的3d结构有助于酶活性的保持，从而使得器件保持期相比传统纸基芯片要延长很多。目前测定保存1个月的器件样品并无明显酶活性降低。

附图说明

图1本发明的工作原理示意图；

图2本发明的制备流程示意图；

图3本发明的使用流程示意图；

图4本发明的小分子扩散测试；

图5本发明标准葡萄糖液校准曲线；

图6本发明血液葡萄糖校准曲线；

图7本发明器件保存测试；

图8本发明和血糖仪以及传统分光光度法对相同样本的测试结果比较。

具体实施方式

结合实施例说明本发明的具体技术方案。

基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件，其工作原理为如图1所示。

使用的胶体材料在含水时具有纳米孔结构，此结构能固定比色反应物且避免其泄露，比色反应物包括但不限于葡萄糖氧化酶(gox)，辣根过氧化物酶(hrp)，3,3'-二氨基联苯胺(dab)。此材料的结构允许小于其孔径的物质渗透至材料内部:渗透小于孔径的物质比如葡萄糖；且阻拦大于孔径的物质比如血细胞。使用的胶体材料为透明材质可允许实时测定比色反应中颜色变化。该检测方法原理：在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色3,3'-二氨基联苯胺在辣根过氧化物酶的作用下，生成水和棕色3,3'-二氨基联苯胺聚合物用于快速比色测定。

该基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件的制备过程，如图2所示，包括以下步骤：

(1)材料制备：

胶体前驱物：100mg/ml聚乙二醇二丙烯酸酯(peg-da)(分子量：4000)。

光引发剂溶液：100mg/ml安息香双甲醚(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone)溶解于1-乙烯基-2-吡咯烷酮(1-vinyl-2-pyrrolidinone)。

本发明使用的葡萄糖氧化酶：90u/ml，辣根过氧化物酶：20u/ml，按照1：1体积比混合后，反应酶混和液与3,3'-二氨基联苯胺(dab)饱和溶液按照1:1体积比混合制备比色反应溶液。

胶体前驱物和比色反应溶液按照1:1体积比混合；最后按照1：10体积比加入光引发剂溶液至前驱物和比色反应混合溶液。

(2)器件制备：

上述制备材料溶液加入由聚二甲基矽氧烷(pdms)制成的模组中，型腔为圆柱，直径：4mm，高度：0.8mm；

365纳米紫外光照射，强度:20mw/cm²,照射1分钟完成胶体聚合反应；

圆柱形胶体从模组中取出后粘附在支撑材料上。

组装完毕的器件可以直接用于比色法检测。

该基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件的检测流程如图3所示：

胶体浸没在血液中，反应5分钟，随后使用清水冲洗胶体，拍照分析胶体灰度值变化。小分子在胶体中的扩散，如图4所示：

本发明使用小分子荧光染料(分子半径约为0.7纳米)表征和定量分析小分子在胶体里的扩散程度，据报道此胶体孔径约为4.5纳米。如图4所示：小分子荧光染料可以扩散至胶体中并在5分钟后扩散达到饱和。

标准葡萄糖校准曲线获取：

本发明首先使用标准葡萄糖溶液验证胶体灰度值和葡萄糖浓度关系，如图5所示，胶体灰度值和葡萄糖溶液在0mg/ml-1mg/ml区间内呈现线性关系，r²＝0.998。

血液葡萄糖校准曲线获取：

本发明随后使用已知葡萄糖浓度的人体血液验证胶体灰度值和葡萄糖浓度关系，如图6所示，胶体灰度值和血液中葡萄糖浓度在75mg/dl-175mg/dl区间内呈现线性关系，r²＝0.983。所以通过测量灰度可得知血液葡萄糖浓度。通过检测极限(lod)公式：lod＝空样品平均灰度值+3×标准差。30个不同批次的空白样得到的检测极限是7.5mg/ml，检测极限与报道的其他血糖测试方法相近。

该基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件性能重复性测试：

本发明验证了所发明器件性能的重复性。不同批次的器件(10个器件/批次，3个批次)用于测试1mg/ml葡萄糖溶液，所得的灰度值相对误差6％。

该基于3d纳米孔状结构的血液分离和分析器件的存储测试：

本发明的器件保存在零下4摄氏度用于测试性能。如图7所示，使用3种不同葡萄糖浓度，经过30天的存储，所得的反应结果保持一致。说明本发明的器件能长时间保持反应物的效能。

人血葡萄糖测试：

本发明可快速检测来自不同血型血液中葡萄糖。如图8所示，本发明测定的葡萄糖浓度与血糖仪测定的浓度基本一致，差值1～9％。本发明测试结果与市面上销售的血糖仪测试的结果相当，且结果稳定，保存期长，使用成本低见表1和图8。

表1：使用成本

本发明可应用的检测亦可用于检测血液中如尿酸，ph,酮，蛋白质等的检测。本发明可应用酶基反应、比色反应、荧光反应。