一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的制作方法

1.本实用新型涉及核酸检测芯片制作技术领域，具体涉及一种液滴单层平铺式核酸检测芯片。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)提出以来，核酸体外扩增和定量技术已发展成为分子生物学领域的一项核心技术。目前，以pcr为基础的核酸定量检测技术，因其分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点，成为疾病早期诊断的主要应用技术，并广泛应用于分子测序、基因表达分析、基因突变研究和药物筛选等其他研究领域。
3.美国abi公司推出实时荧光定量pcr(real
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time quantitative pcr，qpcr) 技术及相关产品，利用荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环产物量的变化，通过循环阈值(cycle threshold，ct)和标准曲线对起始模板进行定量分析，将pcr由定性与半定量的体外合成技术发展成为高灵敏度、高特异性的，可对核酸进行相对定量的基因分析技术。发展至今，qpcr技术已经成为应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术，其准确度可达95％。但是，由于qpcr 是一种核酸相对定量技术，对低倍差异的分辨能力不足，另外对于含量低于1％的微量突变的检测无能为力。
4.vogeldtein和kinzler提出了一种新的核酸定量技术——数字pcr(d
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pcr) 技术，该技术的原理是将一个样本稀释成几十到几万份，分配到不同的反应单元，使每个单元至多包含一个拷贝的目标分子(初始dna模板)，在每个反应单元中进行单个拷贝dna的pcr扩增，扩增结束后，对有荧光信号的单元进行计数，计数结果即为初始dna模板的拷贝数。
5.根据数字pcr的原理，从实现途径上，数字pcr技术包括三个步骤：样品分散、pcr热循环、结果检测分析这三个环节。其中样品分散成大量均一的微单元是关键步骤，是dpcr技术检测敏感性以及绝对定量准确性的关键。根据样品分散方式的不同，现有的数字pcr技术可分为微流控芯片数字pcr技术和液滴数字pcr技术。
6.目前市面上微液滴式核酸检测系统主要是用于数字pcr(digital polymerasechain reaction)检测，缩写为ddpcr(droplet digital polymerase chain reaction) 系统。现有的ddpcr技术包括美国bio
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rad公司的qx系列微液滴式dpcr系统和法国stilla technologies公司的naica crystal微液滴pcr系统。bio
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rad公司的系统中检测工作工作过程：首先，通过将配制好的pcr反应试剂分散成数万个液滴，收集在类似离心管的结构中；然后，进行pcr反应；最后，将反应后的液滴导入分析芯片进行结果读出。stilla technologies公司的naica crystal微液滴pcr系统芯片才用的是一体化方案，即“液滴产生
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收集
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反应”一体化设计。样品分散成的液滴被收集在芯片的液滴收集腔内，呈单层排列，之后液滴不再需要转移，进行pcr反应，最后读出反应结果。
7.bio
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rad公司的qx系列微液滴式dpcr系统，采用类似流式细胞分析技术中对百万个液滴逐个进行分析，在工作过程中，液滴需要多次转移，转移过程很难避免污染和破乳的
发生。stilla technologies公司的naica crystal微液滴pcr 系统芯片采用特殊键合工艺，成本高。
8.两套系统产生液滴所用的油相为氟化油，为含氟有机混合试剂(例如甲基九氟丁醚等)，易挥发性，需防护措施避免吸入油蒸汽。同时，为保证液滴稳定生成与保存，所用的表面活性剂为特殊合成的，使用成本高。氟化油受热会急剧挥发，为保证pcr过程中液滴的稳定性，通常会保持反应环境高压状态，增加了反应仪器的设计难度与成本。尤其是在转移液滴时，存在氟有机物质挥发性风险问题。


技术实现要素：

9.本实用新型实施例的目的在于提供一种液滴单层平铺式核酸检测芯片，用于解决目前微液滴式核酸检测技术，液滴需要多次转移，转移过程很难避免污染和破乳的发生，以及在转移液滴时，存在氟有机物质挥发性风险问题。
10.为了实现本实用新型的目的，本实用新型所采用的技术方案为：
11.本实用新型提供了一种液滴单层平铺式核酸检测芯片，所述芯片包括：液滴产生组片1以及底部基片2，液滴产生组片1包括带有微沟道的结构片11、双面具有粘性的膜12和上盖片13，所述结构片11和所述上盖片13通过所述膜 12贴合在一起，实现微沟道的封接，形成闭合的微沟道，所述底部基片2靠近长边的位置涂有两条胶线3，所述液滴产生组片1对准所述胶线3压装至所述底部基片2，所述上盖片13、所述底部基片2和所述胶线3围成液滴收集腔，所述结构片11上设置有第一透气孔111、微液滴生成水相孔112和微液滴生成油相孔113，所述膜12和所述上盖片13上分别设置有第二透气孔121和第三透气孔131，所述第一透气孔111、第二透气孔121和第三透气孔131对齐。
12.优选地，所述芯片还包括：衬垫膜4，用于在所述液滴产生组片1压装至所述底部基片2之前，装填至所述底部基片2上的两条胶线3之间，支撑形成所述液滴收集腔。
13.优选地，所述衬垫膜4为由无尘纸或由聚碳酸酯/聚四氟乙烯制成的无尘薄膜，所述衬垫膜4的厚度大于或等于30微米且小于或等于200微米。
14.优选地，所述结构片11、所述膜12和所述上盖片13边缘对齐形成所述液滴产生组片1，所述液滴产生组片1的两个长边缘分别与两条胶线3对齐。
15.优选地，所述结构片11上的微沟道的宽度和高度均大于或等于25微米并小于或等于10000微米。
16.优选地，所述结构片11为聚碳酸酯制片、聚丙烯制片和聚苯乙烯制片中的一种或多种。
17.优选地，所述上盖片13与所述底部基片2为透明玻璃制片。
18.优选地，所述膜12为聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜，所述胶线3为聚二甲基硅氧烷胶线。
19.本实用新型还提供了一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的制备方法，所述方法包括：带有微沟道的结构片11和上盖片13通过双面具有粘性的膜12贴合在一起，作为液滴产生组片1，实现微沟道的封接，形成闭合的微沟道；在底部基片2靠近长边的位置涂上两条胶线3；将所述液滴产生组片1对准所述胶线3 压装至所述底部基片2，所述上盖片13、所述底部基片2和所述胶线3围成液滴收集腔；其中，所述结构片11上设置有第一透气孔111、微液
滴生成水相孔 112和微液滴生成油相孔113，所述膜12和所述上盖片13上分别设置有第二透气孔121和第三透气孔131，所述第一透气孔111、第二透气孔121和第三透气孔131对齐。
20.优选地，所述方法还包括：在所述液滴产生组片1压装至所述底部基片2 之前，将衬垫膜4装填至所述底部基片2上的两条胶线3之间，支撑形成所述液滴收集腔。
21.与现有技术相比，本实用新型实施例制备的液滴单层平铺式核酸检测芯片，采用液滴平铺式收集保存液滴。液滴收集后，原位扩增反以及识别分析，不再转移液滴。另外，可使用矿物油(mineral oil，cas:8042
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5)，室温下与pcr 过程中不易挥发，降低配套仪器的成本，有效降低使用成本，从根本上解决了氟有机物质挥发性风险问题。
附图说明
22.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本技术的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分，本领域技术人员应该理解的是，这些附图未必是按比例绘制的，在附图中：
23.图1为本实用新型公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的结构示意图；
24.图2为本实用新型公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的分解示意图。
25.上述附图中：
26.1、液滴产生组片；11、结构片；111、第一透气孔；112、微液滴生成水相孔；113、微液滴生成油相孔；12、膜；121、第二透气孔；13、上盖片；131、第三透气孔；2、底部基片；3、胶线；4、衬垫膜。
具体实施方式
27.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
28.本实用新型实施例的目的在于：通过一系列工艺过程实现一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的结构，从而实现批量化生产。具体地，一是微通道的构建，封接，实现液滴的顺利生成；二是液滴储藏反应玻璃腔的构建，实现液滴的顺利反应。从而完整的实现数字pcr芯片功能。
29.参考图1和图2，本实用新型实施例公开了一种液滴单层平铺式核酸检测芯片，该芯片包括：液滴产生组片1以及底部基片2。
30.液滴产生组片1包括带有微沟道的结构片11、双面具有粘性的膜12和上盖片13，结构片11和上盖片13通过所述膜12贴合在一起，实现微沟道的封接，形成闭合的微沟道。
31.结构片11上的微沟道的宽度和高度均大于或等于25微米并小于或等于 10000微米。微沟道的宽度大于500微米时，需要用微柱结构予以支撑，避免通道塌陷。
32.结构片11的材质要求：不与液滴体系的油相反应，油相接触角小于30
°
，且结构片
11的水相接触角大于80
°
，结构片11优选为聚碳酸酯制片、聚丙烯制片和聚苯乙烯制片中的一种或多种。
33.聚合物材质的芯片在制造过程中通常会对微沟道结构做表面处理，通过特殊的键合工艺形成微沟道(su,s,et al,sensor actuat b
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chem,2019,282,60
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68.)。为了使芯片微沟道内部特性稳定的表面不被破坏，经过表面处理后能稳定产生液滴。
34.本实用新型实施例中，结构片11和上盖片13通过膜12贴合在一起，实现了微沟道表面无损封接工艺，无需对聚合物结构片进行表面处理，直接封接。制造的微沟道，利用原有性质稳定的聚合物的结构表面能稳定产生液滴。
35.膜12的材质要求：不与形成微液滴的油相反应，膜12的油相接触角小于 30
°
，且膜12的水相接触角大于80
°
，膜12优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜。
36.底部基片2靠近长边的位置涂有两条胶线3，液滴产生组片1对准所述胶线3压装至底部基片2，上盖片13、底部基片2和两条胶线3围成液滴收集腔。
37.优选地，结构片11、膜12和上盖片13边缘对齐形成液滴产生组片1。液滴产生组片1的两个长边缘分别与两条胶线3对齐。
38.上盖片13与底部基片2的材质要求：不与液滴体系反应；受热不分解，厚度方向形变量低于5微米；油相接触角小于30
°
，水相接触角大于50
°
，透明；上盖片13与底部基片2优选为透明玻璃制片。胶线3材质要求：不与液滴体系反应；受热不分解；油相接触角小于30
°
，水相接触角大于50
°
，胶线3优选由聚二甲基硅氧烷胶线。
39.为了解决上述问题，与上述公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片相对应，本实用新型实施例还公开了一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的制备方法。
40.本实用新型实施例公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的制备方法包括：带有微沟道的结构片11和上盖片13通过双面具有粘性的膜12贴合在一起，作为液滴产生组片1，实现微沟道的封接，形成闭合的微沟道；在底部基片2靠近长边的位置涂上两条胶线3；将液滴产生组片1对准胶线3压装至底部基片2，上盖片13、底部基片2和胶线3围成液滴收集腔。
41.优选地，本实用新型实施例公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片还包括：衬垫膜4，在液滴产生组片1压装至底部基片2之前，衬垫膜4装填至底部基片2上的两条胶线3之间，用于支撑形成液滴收集腔。
42.相对应地，本实用新型实施例公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片的制备方法还包括：在液滴产生组片1压装至所述底部基片2之前，将衬垫膜4 装填至底部基片2上的两条胶线3之间，支撑形成液滴收集腔。
43.图像分析法，具有实时、可追溯的优势，在液滴分析中广泛应用。采用图像处理方法分析液滴时，需要液滴单层排列，此时液滴收集腔的腔内部高度h 受到限制，腔内部高度h取值范围需满足d≦h<2d，d为液滴直径。若h<d，液滴呈压扁状态，而图像处理通常是分析液滴在水平方向的二维信息，此时分析得到液滴信息并非真实信息。若h≧2d，液滴重叠2层或2层以上，采集的图像存在液滴重影，影响图像分析。本实用新型实施例中，衬垫膜4的厚度大于或等于30微米且小于或等于200微米，优选地按液滴尺寸而定，腔内部高度h一般为液滴直径d的1.1至2.0倍，衬垫膜4的材质要求：为无尘薄膜，不沾，优选为由无尘纸或由聚碳酸酯/聚四氟乙烯制成的无尘薄膜，通过衬垫膜4及其厚度的限定形成了一种构建液滴收
集腔体制造工艺，使液滴收集腔的腔内部高度h 取值范围满足上述要求，使其收集的液滴单层排列。本实用新型实施例中的核酸检测芯片，采用液滴平铺式收集保存液滴，液滴收集后，原位扩增以及识别分析，不再转移液滴。
44.通常，液滴尺寸在30微米至150微米范围内，如前所述，液滴收集腔的腔内部高度低于300微米，在这样狭窄的空间内，若存在气泡，在热反应过程(比如pcr扩增反应)中，气泡剧烈膨胀，容易挤压液滴导致液滴破碎，甚至将液滴挤出收集腔。在实验过程中，我们发现许多聚合物材料，在加热过程中会出现气泡，比如一些常用的pc、pp材料。在本实用新型实施例中，液滴收集腔与液滴产生组片产生液滴的微沟道相对独立，液滴收集腔的材质异于液滴产生组片，单独挑选与体系有亲和性与兼容性，耐高温(100℃)，加热无气体释放的材料，因此，上盖片与底部基片为透明玻璃制片，保证液滴在反应过程中稳定保存。
45.另外，本实用新型实施例公开的一种液滴单层平铺式核酸检测芯片，由于各部分的选材，可使用矿物油(mineral oil，cas:8042
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5)，室温下与pcr 过程中不易挥发，降低配套仪器的成本。采用商用的表面活性剂，有效降低使用成本，从更本上解决了氟有机物质挥发性风险问题。
46.本实用新型实施例中，结构片11上设置有第一透气孔111、微液滴生成水相孔112和微液滴生成油相孔113，膜12和上盖片13上分别设置有第二透气孔 121和第三透气孔131，第一透气孔111、第二透气孔121和第三透气孔131对齐。
47.本实用新型实施例中，利用材料本身表面性质稳定产生油包水液滴，所用的材料是市面上成熟的材料，不使用其它特殊试剂进行表面处理，成本低；通过衬垫膜可以根据需求，灵活构建液滴收集腔高度，利用高度方向的限制，使液滴单层排列保存，并且构建完成液滴收集腔后，在使用芯片时，可将衬垫膜从液滴收集腔中抽出。
48.本实用新型实施例中，形成闭合的微沟道的具体结构设计见公开专利(cn 111185248a)，利用上述结构设计，可以避免热循环过程产生气泡，具体方案在此不再赘述。
49.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的范围。