一种微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球及其制备与应用

1.本发明涉及一种色谱分离与糖肽富集多功能材料，具体是一种包覆微孔有机聚合物的二氧化硅亲水微球制备及其一方面作为亲水填料用于液相色谱柱填充，分离极性化合物，另一方面作为亲水相互作用色谱法中的吸附剂，用于生物样品中糖肽的分离富集。


背景技术：

2.多孔材料作为材料领域的一个重要分支，在许多科学技术领域具有重要的应用价值，因此受到科研工作者的广泛关注(文献1.yaghi o.,et.al“reticular synthesis and the design of new materials”nature,2003,423:705-714)。相比于其他多孔材料，微孔有机聚合物是完全由共价键连接而成的有机物。合成聚合物的构筑单元至少含有两个可聚合的功能性基团，这些刚性、扭曲的构筑单元通过稳定的共价键进行交联产生微孔结构，可通过选择不同功能性单体进行聚合以满足不同的应用需求，如采用対苯异氰酸酯与经过肼化处理的均苯三甲醛三乙酯反应可制备出亲水聚酰基氨基脲类微孔有机聚合物(文献2.王红卫,“聚酰基氨基脲类多孔有机聚合物的制备及其在糖肽富集中的应用”色谱,2017,35,688-695)。
3.硅基材料具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性与热稳定性，其表面含有丰富的硅羟基，非常容易进行各种化学表面修饰(文献3.赵兴云,“核壳硅碳复合微球固定相的制备及其在糖类分离中的应用”色谱,2020,38(12):1357-1362)。硅基材料的发展由最开始的无定形硅胶到无孔球形硅胶、全多孔球形硅胶进一步过渡到核壳型硅胶。核壳型硅胶由超纯实心硅胶核以及外层组装了一定厚度的多孔壳层组成，实心球的存在，使填料孔体积减小，降低了分子纵向扩散；由于待分离物质只在壳层上进行固液分配，缩短了溶质扩散的路径。因此核壳型硅胶具有缩短分析时间,改善分离效果，提高灵敏度和分辨率等优点(文献4.夏红军,“核壳型二氧化硅色谱填料的研究进展”色谱,2020,38(4):372-382)。
4.糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中最为广泛的翻译后修饰之一。其过程是在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，与蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键，进而形成糖蛋白(文献5.raymond a.dwek,“glycobiology:toward understanding the function ofsugars”chem.rev.,1996,96,2:683-720)。糖基化对调节蛋白质功能具有重要作用，许多细胞表面和体液中糖基化蛋白质上糖链的改变已经被证实在癌症或者其他疾病的发生和发展过程中起着关键作用。但是在糖基化修饰研究过程中发现糖基化蛋白相对丰度较低，酶解后产生的糖基化肽段仅占蛋白质酶解肽段的2～5％，在质谱分析时会受到非糖基化肽段的严重干扰，因此需要发展高效的分离富集方法和材料，以去除糖蛋白中的非糖基干扰，实现对糖基化肽段的后续研究。(文献6.nianrong sun,et.al“hydrophilic mesoporous silica materials for highly specific enrichment of n-linked glycopeptide”anal.chem.,2017,89,3:1764-1771)。目前富集糖肽的主要方法有凝集素亲和法、硼酸亲和色谱法、亲水相互作用色谱法等。其中亲水相互作用色谱法是利用目标分子和干扰物质之
间亲水性差异对目标物进行分离富集，由于使用水溶性有机相，因此在质谱兼容性方面具有明显优势，同时富集到的糖链没有被破坏，方便了后续研究，但是其富集特异性很差，为此需要不断从方法与富集材料上进行探索创新(文献7.sun n,et.al“hydrophilic mesoporous silica materials for highly specific enrichment of n-linked glycopeptide”anal.chem.,2017,89:1764-1771)。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种微孔有机聚合物包覆的二氧化硅亲水微球及其制备与应用，其一方面可作为亲水填料用于液相色谱柱填充，分离极性化合物，另一方面作为亲水相互作用色谱法中的吸附剂，用于生物样品中糖肽分离富集。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.具体是将氨基功能化的实心二氧化硅微球、间苯二胺与间苯二甲醛为原料，采用“一锅法”策略，在酸催化作用下，利用氨醛缩合反应在二氧化硅微球表面包覆一层微孔有机聚合物；
8.(1)氨基功能化的无孔二氧化硅微球制备
9.在容器中，依次加入1～10ml去离子水，5～40ml氨水和50～150ml无水乙醇。将烧瓶放入油浴锅，在150～400r/min转速下机械搅拌10～20min将溶液混合均匀。开启升温装置，在20～60℃条件下，逐滴加入5～40ml正硅酸乙酯与20～100ml无水乙醇混合溶液。滴加完毕后继续反应2～8h。将得到的二氧化硅微球用乙醇洗涤3～6次，置于40～80℃的真空干燥箱中干燥8～24h。
10.称取2.0～6.0g二氧化硅微球于容器中，依次加入25～75ml无水甲苯和0.5～4.5ml无水吡啶。超声分散混匀后，将其放入油浴锅中，通入氩气10～20min后，在转速为100～400r/min的机械搅拌状态下，加入0.5～7.5ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷。开启加热回流装置，将温度升至80～120℃，加热回流16～32h。得到的产物依次用甲苯和乙醇各洗涤3～6次，置于40～80℃的真空干燥箱中干燥8～24h。
11.(2)微孔有机聚合物包覆的核壳型亲水微球材料的制备
12.首先，称取0.1～0.6g氨丙基功能化二氧化硅微球于容器中，加入10～30ml 1,4-二氧六环，超声分散混匀。然后，在氩气保护下，依次向容器中加入0.35～0.95g间苯二胺，0.45～1.05g间苯二甲醛以及0.5～1.5ml浓度为3～6mol/l的醋酸水溶液，在50～100℃油浴锅加热条件下，以100～400r/min的机械搅拌速度，回流16～32h。将得到的微球材料依次用1,4-二氧六环、丙酮各洗涤3～6次。最后，置于40～80℃的真空干燥箱中干燥8～24h备用。
13.本发明采用“一锅法”策略，以氨基功能化的单分散实心二氧化硅微球为基质，以间苯二胺与间苯二甲醛为原料，在酸催化作用下发生氨醛缩合反应，在二氧化硅微球表面包覆一层微孔有机聚合物(microporous organic polymer,mop)，形成具有核壳结构的二氧化硅亲水微球。由于微孔有机聚合物壳层含有大量氨基与醛基官能团，因此具有良好的亲水性，一方面可作为液相色谱分析柱的填料，应用于极性小分子化合物如苯酚类物质的分离；另一方面可作为亲水相互作用色谱的吸附剂，应用于生物样品如人体或动物的体液、组织及细胞等酶解液中糖肽的选择性富集。本发明所采用的亲水材料制备原料易得，成本
低廉，制备简单，反应条件温和。
14.本发明具有如下优点：
15.1.该材料制备过程简单，原料易得，成本低廉。
16.2.材料具有核壳型结构，由于实心核的存在，使填料孔体积减小，因此可以减小分子纵向扩散；减小了溶质的扩散距离，能够有效降低传质阻力，以此提高色谱分离与糖肽富集能力。
附图说明
17.图1为mop@sio2亲水材料的制备示意图。
18.图2为实施例1材料的氦离子电镜：(a)sio2(b)mop@sio2；透射电镜：(c)sio2(d)mop@sio2。
19.图3为实施例1材料的氮气吸附/脱附曲线(a)以及孔径分布图(b)。
20.图4为实施例1材料的红外光谱图。
21.图5为实施例1亲水材料对极性小分子化合物分离的色谱图：毛细管柱规格：内径150μm，长度25cm,流动相：乙腈/水,95/5(v/v),流速：45μl/min。出峰顺序依次为(1)4-叔丁基苯酚(2)邻苯三酚(3)间苯三酚。
22.图6为实施例1亲水材料对免疫球蛋白酶解液富集前后的质谱对比图。(a)富集前(b)富集后。
23.图7为实施例1亲水材料对添加牛血清白蛋白酶解液至免疫球蛋白酶解液富集前后的质谱对比图。(a)免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)富集前(b)免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)富集后。
24.图8为实施例2亲水材料的(a)氦离子电镜(b)透射电镜。
25.图9为实施例2亲水材料的氮气吸附/脱附曲线(a)以及孔径分布图(b)。
26.图10(a)为实施例2亲水材料对免疫球蛋白酶解液富集后质谱图。图10(b)为实施例2亲水材料对免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)酶解液富集后质谱图。
27.图11为对比例商品化venusil hilic材料评价结果。(a)作为色谱填料对极性小分子化合物分离的色谱图：毛细管柱规格：内径150μm，长度25cm,流动相：乙腈/水,95/5(v/v),流速：45μl/min，未实现基线分离。(b)作为亲水相互作用色谱中的吸附剂对免疫球蛋白酶解液富集结果。
具体实施方式
28.实施例1:利用微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球mop@sio2材料用于液相色谱中极性小分子化合物分离与生物样品中糖肽富集。
29.(1)微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球材料制备：
30.制备过程如图1所示，具体为在一个三口烧瓶中，依次加入6.5ml去离子水，19ml氨水(质量浓度25％)和134ml无水乙醇。将烧瓶放入油浴锅，在300r/min转速下机械搅拌10min将溶液混合均匀。开启升温装置，在30℃条件下，逐滴加入20ml正硅酸乙酯与55ml无水乙醇混合溶液。滴加完毕后继续反应5h。将得到的平均粒径为2.1μm二氧化硅微球用乙醇洗涤3次，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h。
31.称取3.0g二氧化硅微球于一个三口烧瓶中，依次加入60ml无水甲苯和3ml无水吡啶。超声分散混匀后，将其放入油浴锅中，通入氩气20min后，在转速为200r/min的机械搅拌状态下，加入3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷。开启加热回流装置，将温度升至80℃，加热回流24h。得到的产物依次用甲苯和乙醇各洗涤3次，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h。
32.称取0.3g氨丙基功能化二氧化硅微球于三口烧瓶中，加入20ml 1,4-二氧六环，超声分散混匀。然后在氩气保护下，依次向烧瓶中加入0.546g间苯二胺，0.672g间苯二甲醛以及0.84ml浓度为3mol/l的醋酸水溶液，在80℃油浴锅加热条件下，以200r/min的机械搅拌速度，回流24h。将得到的壳层厚度为0.15μm亲水二氧化硅微球依次用1,4-二氧六环、丙酮各洗涤3次。最后，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h备用。
33.(2)微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球固定相的填装：
34.取步骤(1)制备的mop@sio2固定相15mg，并向其中加入800μl甲醇，超声分散5min，所得固定相匀浆装入匀浆罐中，通过高压压入毛细管柱中；毛细管柱内径规格为150μm；柱长25cm；填充压力为4mpa。
35.(3)液相色谱流动相制备：乙腈和超纯水作为流动相在使用前均超声30min。液相色谱待分离样品制备：分别称取4-叔丁基苯酚，邻苯三酚和间苯三酚5mg置于1.5ml离心管中，加入600μl乙腈，超声15min后，在25000g离心3min后，取上清液100μl转移至新1.5ml离心管中，加入1ml乙腈后超声5min混匀备用。每次上样量5μl。
36.(4)免疫球蛋白酶解样品的制备：免疫球蛋白1mg溶解在含8m尿素的100mm的碳酸氢铵溶液中(ph＝8.2)，加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，用100mm的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释成1m，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。
37.(5)牛血清白蛋白酶解样品的制备：牛血清白蛋白1mg溶解在含8m尿素的100mm的碳酸氢铵溶液中(ph＝8.2)，加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，用100mm的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释成1m，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。
38.(6)n-糖肽富集：10μg免疫球蛋白酶解液在3mg mop@sio2材料上样。首先用平衡液(acn/h2o/tfa，85:14:1，v/v/v)洗3次，每次体积200μl，每次10min。将10μg免疫球蛋白酶解液用200μl上样液(acn/h2o/tfa，85:14:1，v/v/v)稀释，加入mop@sio2材料，上样30min后，淋洗液(acn/h2o/tfa，85:14:1，v/v/v)洗3次，每次体积200μl，每次10min。洗脱液(acn/h2o/tfa，30:69:1，v/v/v)洗2次，每次体积150μl，每次15min，将两次所得洗脱液合并后冻干，用10μl tfa水溶液(tfa/h2o，1:99，v/v)复溶后在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)上检测。以上每步振荡条件均为1500rpm，25℃。
39.(7)牛血清白蛋白添加测试mop@sio2材料的富集选择性：牛血清白蛋白添加后富集过程同步骤6，其中上样时酶解液为免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)。
40.产物表征
41.实施例1制备的微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球如图2所示，氦离子电镜：(a)sio2(b)mop@sio2；透射电镜：(c)sio2(d)mop@sio2。发现未包覆壳层的实心sio2表面非常光
滑，其粒径为2.1μm，当实心sio2表面包覆mop壳层后，其表面变得非常粗糙，壳层厚度为0.15μm，具有明显的核壳结构。
42.图3为材料的氮气吸附/脱附曲线(a)以及孔径分布图(b)，sio2材料bet比表面积为3m2/g，其表面无孔，mop@sio2材料bet比表面积为91m2/g，孔径分布在3.9nm左右。
43.图4分别为sio2和mop@sio2的红外光谱图。如图所示，sio2和mop@sio2的红外光谱中均出现1018cm-1
和799cm-1
的强吸收峰，其分别为si-o-si键的不对称伸缩振动与对称伸缩振动。mop@sio2的红外光谱中出现1602cm-1
的吸收峰，其为亚胺键特征吸收峰，表明mop壳层已成功包覆在sio2微球表面。
44.综合以上产物表征结果，可证明mop@sio2核壳型材料被成功制备。
45.产物应用
46.色谱分离分析结果如图5(a)所示，三种极性化合物在mop@sio2固定相上能实现基线分离,出峰顺序依次为(1)4-叔丁基苯酚(2)邻苯三酚(3)间苯三酚。
47.采用免疫球蛋白评价mop@sio2材料的糖肽富集效果。用maldi-tof-ms进行检测。图6为亲水材料对免疫球蛋白酶解液富集前后的效果对比图。如图6(a)所示，富集前非糖肽信号峰明显，强度较高，糖肽的信号几乎不可见。如图6(b)所示，用材料富集后，非糖肽明显减少，可以检测到22条典型的n-连接糖肽,表1为mop@sio2材料富集到的所有肽段。
48.采用牛血清白蛋白与免疫球蛋白酶解液混合后评价mop@sio2材料的吸附选择性。用maldi-tof-ms进行检测。图7为亲水材料对免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)酶解液富集前后的效果对比图。如图7(a)所示，富集前非糖肽信号峰明显，强度较高，糖肽的信号几乎不可见。用mop@sio2材料富集后，如图7(b)所示，非糖肽明显减少，说明mop@sio2材料具有良好的富集选择性。
49.表1 mop@sio2材料富集到的免疫球蛋白酶解液中糖肽分子量及糖型组成
[0050][0051]
n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。
[0052]
实施例2:利用微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球mop@sio2材料用于生物样品中糖肽富集。
[0053]
(1)微孔有机聚合物包覆的二氧化硅微球材料制备：
[0054]
制备过程如图1所示，具体为在一个三口烧瓶中，依次加入6.5ml去离子水，19ml氨水(质量浓度25％)和134ml无水乙醇。将烧瓶放入油浴锅，在300r/min转速下机械搅拌10min将溶液混合均匀。开启升温装置，在30℃条件下，逐滴加入20ml正硅酸乙酯与55ml无水乙醇混合溶液。滴加完毕后继续反应5h。将得到的平均粒径为2.1μm二氧化硅微球用乙醇洗涤3次，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h。
[0055]
称取3.0g二氧化硅微球于一个三口烧瓶中，依次加入60ml无水甲苯和3ml无水吡啶。超声分散混匀后，将其放入油浴锅中，通入氩气20min后，在转速为200r/min的机械搅拌状态下，加入3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷。开启加热回流装置，将温度升至80℃，加热回流24h。得到的产物依次用甲苯和乙醇各洗涤3次，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h。
[0056]
称取0.3g氨丙基功能化二氧化硅微球于三口烧瓶中，加入20ml 1,4-二氧六环，超
声分散混匀。然后在氩气保护下，依次向烧瓶中加入0.702g间苯二胺，0.864g间苯二甲醛以及1.08ml浓度为3mol/l的醋酸水溶液，在80℃油浴锅加热条件下，以200r/min的机械搅拌速度，回流24h。将得到的壳层厚度为0.25μm亲水二氧化硅微球依次用1,4-二氧六环、丙酮各洗涤3次。最后，置于60℃的真空干燥箱中干燥12h备用。
[0057]
(2)实施例2亲水材料的糖肽富集过程同实施例1。
[0058]
产物表征
[0059]
实施例2制备的微孔有机聚合物包覆的亲水二氧化硅微球如图8所示(a)氦离子电镜(b)透射电镜。可观察到实心sio2材料的粒径为2.1μm，其表面非常光滑，当实心sio2包覆mop壳层后，其表面变得非常粗糙，壳层厚度为0.25μm，具有明显的核壳结构。
[0060]
图9为材料的氮气吸附/脱附曲线(a)以及孔径分布图(b)，mop@sio2材料bet比表面积为119m2/g，孔径分布在3.9nm左右。
[0061]
综合以上产物表征结果，可证明mop@sio2核壳型材料被成功制备。
[0062]
产物应用
[0063]
采用免疫球蛋白评价亲水材料的糖肽富集效果。用maldi-tof-ms进行检测。图10(a)为亲水mop@sio2材料对免疫球蛋白酶解液富集后结果，用材料富集后，非糖肽明显减少，可以检测到21条典型的n-连接糖肽，表2为mop@sio2材料富集到的所有肽段。采用牛血清白蛋白与免疫球蛋白酶解液混合后评价亲水材料的吸附选择性。用maldi-tof-ms进行检测。图10(b)为亲水mop@sio2材料对免疫球蛋白:牛血清白蛋白(摩尔比1:100)酶解液富集结果，用mop@sio2材料富集后，非糖肽明显减少，说明mop@sio2材料具有良好的富集选择性。
[0064]
表2 mop@sio2材料富集到的免疫球蛋白酶解液中糖肽分子量及糖型组成
[0065][0066]
n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。
[0067]
对比例
[0068]
我们采用商品化venusil hilic 10μm材料(产地：中国，天津博纳艾杰尔科技有限公司)作为色谱填料用于液相色谱中分离极性小分子化合物，另一方面作为亲水相互作用色谱中的吸附剂用于富集免疫球蛋白酶解液中的糖基化肽段。
[0069]
(1)商品化venusil hilic材料的色谱评价过程同实施例1。
[0070]
(2)商品化venusil hilic材料的糖肽富集过程同实施例1。
[0071]
评价结果
[0072]
图11(a)为venusil hilic色谱填料对极性小分子化合物分离的色谱图：毛细管柱规格：内径150μm，长度25cm,流动相：乙腈/水,95/5(v/v),流速：45μl/min，未实现基线分离。
[0073]
图11(b)为venusil hilic材料对n-糖肽富集结果，共富集到18条的典型的n-糖基化肽段，表3为venusil hilic材料富集到的所有肽段。
[0074]
对商品化venusil hilic材料与mop@sio2材料在液相色谱与糖肽富集的评价结果进行对比，发现作为色谱填料在极性小分子化合物分离时，mop@sio2材料实现了基线分离；
作为亲水相互作用色谱中的吸附剂用于生物样品前处理时，mop@sio2材料富集到了更多的n-糖基化肽段，展示了其进一步应用于复杂生物样品的前景与价值。
[0075]
表3商品化venusil hilic材料富集到的免疫球蛋白酶解液中糖肽分子量及糖型组成
[0076][0077]
n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。