用于即时需求诊断的等温核酸扩增方法与流程

本发明涉及一种用于核酸(包括dna和rna)等温扩增的快速且可选的多路复用或多重方法。特别是，本发明涉及用于快速诊断，例如目标生物样品中的至少两种感染原或同一感染原中的至少两个不同靶标的诊断方法。本发明进一步涉及用于在实验室以及非实验室环境中执行扩增方法的手持式和便携式诊断系统。还提供了合适的酶序列、试剂盒以及该方法和系统的用途。

背景技术：

1、世界卫生组织于2020年3月宣布sars-cov-2病毒爆发为世界大流行病，其非常引人注目地证明了对可靠和快速诊断的需求，特别是对于没有预防性疫苗或治疗药物的新出现的传染病。迄今为止，还没有能够在短时间内可靠地识别sars-cov-2病毒的灵敏快速的诊断工具。这是非常有问题的，因为在测试和测试结果的可用性之间存在很大的时间间隔，因此通常只能在可能发生进一步的病毒传播后才开始隔离受感染的个体。尽管如此，这仅仅是一个引人注目的场景，说明目前对各种病原体(病毒、细菌、真菌或寄生虫)的检测和诊断需要花费太多时间才能获得可靠的结果。例如，由多重耐药菌引起的感染在临床环境和畜牧业生产中都代表着治疗挑战，私人和商务旅行返回者可能希望在返回后将潜在感染传播到社会环境之前接受潜在感染的早期诊断，孕妇和/或属于易感免疫防御风险人群的个人可能希望及早确定其健康状况等。

2、所有这些情况的共同点是，通常需要不同感染原的不止一种核酸序列的存在和/或关于存在多于一种靶序列的信息，并且迫切需要该信息。在感染原的情况下，尽快隔离受感染的个体并尽快为相应疾病提供特定的治疗方案非常重要。但是，在任何类型的护理区(诊所、养老院)中，鉴于快速可靠的多重测试不易获得这一事实，测试患者身上或体内或潜在污染表面上是否存在某些感染原仍然是一个问题。

3、核酸扩增技术(naat)与分子实时pcr测定法一样，通常非常灵敏和特异，但在获得结果的时间方面，pcr仍然存在固有的劣势，需要装备精良的实验室和训练有素的人员。因此，迫切需要具有良好特异性和灵敏度并能够在检测地点原位提供可靠结果的新型便携式诊断解决方案。

4、关于基于核酸的制备、克隆和诊断技术，后来的诺贝尔奖获得者kary mullis及其团队在1980年代开发的聚合酶链反应(pcr)作为快速可靠的dna扩增方法彻底改变了分子生物学，因为科学家们突然有机会在短时间内获得数百万拷贝的目标dna靶分子。简单性和效率(例如，现在可以进行单分子/细胞pcr)代表了pcr技术的显著优势。

5、尽管如此，pcr仍存在某些缺点，包括本质上需要反复进行热循环和不同温度之间的转换(在扩增过程中重复循环两个或三个依赖于温度的步骤)和使用高(>90℃)温度。这些缺点导致了替代扩增方法的发展。

6、一类重要的pcr替代方法称为等温扩增方法(有关综述，参见zanoli和spoto，biosensors(basel)，2012 3(1):18-43))。与pcr相比的巨大优势在于，等温核酸扩增方法根本不需要任何热循环，而是可以在恒定温度下进行。这使得扩增过程更容易操作和控制。此外，与pcr方法相比，需要更少的能量，后者本质上需要快速加热和冷却步骤。等温方法的恒温还允许完全封闭的微结构装置，在其中进行等温扩增可降低样品污染的风险，并意味着低样品消耗、多重dna分析、集成和便携式装置实现。最后，如本技术人最近开发(de 102020 109 744.1，其通过引用并入本文)，恒温将非常优选用于即时需求和/或便携式诊断装置。

7、目前可用的等温扩增策略包括基于核酸序列的扩增(nasba)、环介导等温扩增(lamp)、解旋酶依赖性扩增(hda)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)(再次参见：zanoli和spoto，2012年，同上；关于现今rpa技术的综合调查：li等，analyst，2019，144，31，第31至67页)，或基于链侵入的扩增(-下列siba)(hoser等，plos one 9(11):e112656.doi:10.1371/journal.pone.0112656)。尽管如此，正如pcr等温技术一样，往往会产生非特异性扩增产物作为主要缺点。

8、然而，例如，nasba、rpa和hda(以及某些类型的定量pcr)依赖于使用目标特异性探针来提供更高的反应特异性，而lamp使用额外的引物而不是探针以及链置换聚合酶(notomi等，2000，nucleic acids research 28:e63)。然而，在至少30分钟的温育中使用大量大引物已被证明会产生假阳性结果——在诊断应用中绝对要避免这种结果，特别是在诊断传染病时。此外，lamp反应需要65℃的高温，由于监管和实际问题，这不利于诊断装置在家庭环境中使用。因此，如果需要在短时间内在手持装置中需要诊断性核酸扩增结果，lamp将不是首选方法，手持装置必须满足某些监管要求才能适合非实验室使用。

9、rpa和siba技术都依赖于在结合和扩增过程中使用重组酶。最初，形成由寡核苷酸引物和重组酶蛋白构成的核蛋白复合物以用于rpa和siba型核酸扩增策略，这些复合物促进引物与模板dna的结合。由于运行时间短(约15分钟)，未观察到非特异性扩增。一个特定的优势是重组酶可以容忍至少一个不正确的碱基，而不会阻止启动反应所需的链侵入。总体而言，已表明rpa扩增子可以容忍所有引物和探针序列中多达9个错配(参考boyle等，2013，doi:10.1128/mbio.00135-13；daher等，2014，doi:10.1016/j.mcp.2014.11.005)。在需要检测相差一个或几个碱基的密切相关靶标的情况下，这可能是一个优势，其中此设置的原型实例是使用该反应检测感染原，特别是病毒病原体，已知感染原或病原体会经历快速突变。在实践中，如果一种诊断试剂盒能够扩增并因此以高特异性检测目标病毒的核酸序列，但同时容忍某些突变以避免假阴性结果，那将是非常有利的。

10、与核酸扩增的生化进步并行，包括用于以优化方式进行核酸扩增的合适的反应和检测室的装置的开发也在稳步发展。一个很大的趋势是微流体装置的发展，一般来说，小型化或“纳米化反应室”的趋势，即，将它们变成纳米形式，对于减少样品体积和因此减少所需的试剂量，并在生化检测、取得结果的时间、更快的热转移方面取得优势，以及具有自动化和集成的潜力，以及更重要的是具有多路复用或多重测试的可能性。在这种情况下，多重意味着在单独(局部不同的)反应室中进行的平行反应意义上的多路复用。

11、正如2020年新冠病毒大流行期间的明确例证，全球仍然需要提供快速可靠的核酸扩增技术，这不仅可以在专门的诊断中心进行，而且可以在从待分析的人身上获取生物样品的现场立即进行。此外，在全球范围内观察到，取得结果的时间至关重要，因为除非实施严格的预防性隔离规则，否则存在在收到(可靠的)测试结果之前，受感染但无症状的患者传播传染病的巨大风险，其目前可以持续24-36小时以上。

12、据观察，对多于一种病原体或靶序列的快速检测变得非常重要，例如，用于区分sars-cov-2和季节性流感的阳性和阴性患者。出于成本原因，双重检测通常不由全科医生进行，而全科医生通常是诊断出疑似呼吸道疾病症状患者的第一医生。此外，关于可能受污染的表面或出国旅行返回者的预防性检测，经常观察到检测进行得太晚(当疾病症状变得明显时)，或者鉴于pcr测试所涉及的成本，不会定期执行允许对表面等进行有针对性的净化的标准化测试。最后，目前缺少多功能测试系统和装置，其中在短时间内调整一组给定的待测试靶标(例如，季节性流感病毒株和sars-cov-2)的情况下，可以轻松调整反应形式(新出现的毒株或交替使用)。

13、因此，本发明的一个目的是提供一种新型的多重等温核酸扩增方法，其适合并特别优化以在非实验室条件下以及在实验室条件下在优选手持式或至少便携式诊断装置中进行以使得即使在家庭环境下也能进行即时需求诊断感染，并提供快速可靠的诊断结果，以诊断多种潜在感染和/或靶标核酸，优选是直接应用于诊断装置的同一个测试样品。该装置应该以这样一种方式配置，即应该提供针对至少两种靶序列的易于定制的测试，其中该装置允许执行的生化反应可以很容易地交换以适应对相关结果感兴趣的客户的诊断需求。

技术实现思路

1、本发明如所附权利要求书中所定义。