一种基于磁性多糖微球的Oligo-dT层析填料及其制备方法与流程

本发明属于蛋白纯化，尤其涉及一种基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料及其制备方法。

背景技术：

1、oligo-dt被广泛用于核酸mrna的纯化分离的一种填料，通过填料层析可以有效地将mrna体外转录(ivt)反应的(例如，酶蛋白、质粒等)物质进行分离。目前生产oligo-dt亲和层析填料的技术需要用到昂贵的固相合成基球及固相合成linker，价格昂贵，且配基键合化学联结在强碱下表现不稳定，严重阻碍了该填料在大规模mrna生产纯化工艺中的应用。最近有研究使用亲水的基球，在其表面稳定键合oligo-dt，大大节约了成本，为大规模使用oligo-dt提供了思路，但是目前该方法仍然存在基球机械性能低，oligo-dt的回收不方便，很难二次利用等缺陷。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中层析填料的基球机械性能低，oligo-dt的回收不方便，很难二次利用等问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料及其制备方法。

3、本发明的目的是提供一种基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，所述基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料以改性的磁性多糖微球为基球，通过改性的磁性多糖微球表面的羟基与dt核甘酸单体键合生成oligo-dt配基到改性的磁性多糖微球表面而制得。

4、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球的粒径为50μm-150μm。

5、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球的交联度大于20％。

6、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球的饱和磁化强度大于45emu/g，且具有超顺磁性。

7、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)将硅羟基改性的磁性纳米粒子、多糖、油相材料和乳化剂混匀，60-70℃搅拌反应15-25min，得到磁性多糖微球；所述硅羟基改性的磁性纳米粒子、多糖、油相材料和乳化剂的质量比为9-11：0.3-0.5：28-32：1；

9、(2)碱性条件下，向步骤(1)所述的磁性多糖微球中加入交联剂、环氧活化剂，45-55℃反应6-18h，得到改性的磁性多糖微球；所述磁性多糖微球、交联剂和环氧活化剂质量比为1：0.1-0.3：0.1-0.15。

10、在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁和/或镍；所述硅羟基改性的磁性纳米粒子是通过碱性水解硅源，在磁性纳米粒子表面包覆硅层所得。

11、在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述多糖为琼脂糖、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、黄原胶、果胶、卡拉胶、淀粉、肝素和硫酸软骨素中的一种或多种；所述油相材料为石蜡油、环己烷、植物油和正庚烷中的一种或多种；所述乳化剂为司班80、司班85、吐温20、吐温60和吐温80中的一种或多种。

12、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球为硅羟基改性的磁性纳米粒子，具有较好的防氧化作用，由于表面的硅羟基和多糖的羟基活性较高，都可以与交联剂中的环氧基发生反应，保证磁性体被牢固的固定在微球内部不易泄露。所述改性的磁性多糖微球表面的多羟基亲水官能团是其材料本身特性具有的结构，不需要在通过表面化学修饰或者表面亲水包覆额外引入而得到。

13、在本发明的一个实施例中，在步骤(2)中，所述交联剂为丙二醇二环氧丙酯；所述环氧活化剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

14、在本发明的一个实施例中，所述改性的磁性多糖微球表面的dt核甘酸单体键合循环次数为10-20次，即键合10-20个核苷酸单位(dt10-dt20)。

15、在本发明的一个实施例中，所述dt核甘酸单体为5‘-磷酸二酯和/或5‘-亚磷酰胺。

16、本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

17、(1)本发明所述的oligo-dt层析填料采用天然多糖聚合物做为基球，其表面富含羟基，天然的亲水性有利于配基结合oligo-dt。通过引入磁性核增强其机械性能，在后期的磁性分离回收过程中，磁性微颗粒更利于回收二次使用。

18、(2)本发明所述的oligo-dt层析填料以具有高饱和磁性的、表面亲水的交联微球做为基球将dt核苷酸单体循环往复地键合联接到填料聚合物微球上直接制备而成。所述的层析填料不仅具有很好的mrna结合能力，具有更高的mrna载量以及更高的mrna回收率。这种层析填料具有更好的耐碱性、生物相容性好，高饱和磁化强度和超顺磁等特点。

技术特征：

1.一种基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料以改性的磁性多糖微球为基球，通过改性的磁性多糖微球表面的羟基与dt核甘酸单体键合生成oligo-dt配基到改性的磁性多糖微球表面而制得。

2.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述改性的磁性多糖微球的粒径为50μm-150μm。

3.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述改性的磁性多糖微球的交联度大于20％。

4.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述改性的磁性多糖微球的饱和磁化强度大于45emu/g，且具有超顺磁性。

5.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述改性的磁性多糖微球的制备方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，在步骤(1)中，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁和/或镍；所述硅羟基改性的磁性纳米粒子是通过碱性水解硅源，在磁性纳米粒子表面包覆硅层所得。

7.根据权利要求5所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，在步骤(1)中，所述多糖为琼脂糖、透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、黄原胶、果胶、卡拉胶、淀粉、肝素和硫酸软骨素中的一种或多种；所述油相材料为石蜡油、环己烷、植物油和正庚烷中的一种或多种；所述乳化剂为司班80、司班85、吐温20、吐温60和吐温80中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，在步骤(2)中，所述交联剂为丙二醇二环氧丙酯；所述环氧活化剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

9.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述改性的磁性多糖微球表面的dt核甘酸单体键合循环次数为10-20次。

10.根据权利要求1所述的基于磁性多糖微球的oligo-dt层析填料，其特征在于，所述dt核甘酸单体为5‘-磷酸二酯和/或5‘-亚磷酰胺。

技术总结
本发明涉及一种基于磁性多糖微球的Oligo‑dT层析填料及其制备方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明所述基于磁性多糖微球的Oligo‑dT层析填料以改性的磁性多糖微球为基球，通过改性的磁性多糖微球表面的羟基与dT核甘酸单体键合生成oligo‑dT配基到改性的磁性多糖微球表面而制得。本发明所述的Oligo‑dT层析填料以具有高饱和磁性的、表面亲水的交联微球做为基球将dT核苷酸单体循环往复地键合联接到填料聚合物微球上直接制备而成。所述的层析填料不仅具有很好的mRNA结合能力，具有更高的mRNA载量以及更高的mRNA回收率。这种层析填料具有更好的耐碱性、生物相容性好，高饱和磁化强度和超顺磁等特点。

技术研发人员：黄长水
受保护的技术使用者：苏州华诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16