应用组合膜的RNA酶解液预处理的新工艺的制作方法

本发明涉及核苷酸产品制造。更具体的，涉及应用组合膜的rna酶解液预处理的新工艺。

背景技术：

1、rna可被核酸酶p1或磷酸二酯酶降解成5’-腺苷酸(amp)、5’-鸟苷酸(gmp)、5’-胞苷酸(cmp)和5’-尿苷酸(ump)四种核苷酸。混合在一起的核苷酸经过离子交换树脂层析分离纯化，可获得纯度≥98％的四种单一核苷酸。它们可作为婴儿营养强化剂、医药中间体或食品添加剂等，应用领域较为广泛。随着核酸类产品应用开发，需求量日益增加。

2、近年来我国酶法生产核苷酸规模已经达到300～500吨/年，这样对于离子交换层析技术提出了更高更新的要求。实验室或小规模生产时，通过酶灭活，加硅藻土过滤这种简单的预处理后即可上样分离。但是大规模生产需要考虑许多细节优化，才能达到更高效率和更低成本。例如，树脂的使用寿命、分离效率和生产成本等等问题。现有生产工艺一般流程是：rna酶解反应结束后，升温至85～95℃使酶失活，冷却至40℃以下，然后加硅藻土板框过滤即可上柱，使用阳(或阴)离子交换树脂层析分离。根据目前的生产工艺，为了提高分离效果、简化工艺并降低成本，国内外大都使用阴离子交换树脂进行层析分离。

3、目前对于层析分离前rna酶解液的预处理改进报道甚少。大规模层析分离rna酶解液时，在实验室中一些忽略细节在规模生产中会显现出来，并对生产效率、树脂使用寿命、生产成本等产生较大影响。如酶解液中含有大量酶蛋白，锌离子及rna原料带来的色素、蛋白、钙、镁离子等以及工业原料混杂一些颗粒或胶体状杂质等，仅靠板框过滤与离心等常规操作难以去除。杂质过多会封闭或堵塞树脂许多空间，造成离子交换树脂吸附能力降低，使用寿命缩短。上样体积大，层析分离带会变宽，不能达到较好的分离效果。此外，为了上样时不被杂质干扰，常常会稀释酶解液，降低杂质浓度，这样就造成水资源的浪费。

4、现有专利cn202110815236.0公开了一种rna酶解液的预处理方法，解决了rna酶解液中存在的部分色素和可溶性蛋白质等杂质，有效的保护了离子交换树脂，延长其使用寿命。但是还存在一些问题。例如板框过滤效率低，劳动强度大，硅藻土污染等问题。此外，超滤能去除大分子杂质，但对于影响离子交换的钙、镁、锌等离子不能去除，还存在上样体积大，层析带分布宽等问题，分离效果还不能达到更佳状态。

技术实现思路

1、为了进一步克服现有技术的不足。本发明提供了应用组合膜的rna酶解液预处理工艺，包括以下步骤：

2、(1)应用错流陶瓷膜装置过滤：将rna酶解液用错流陶瓷膜装置过滤，得到过滤液；

3、(2)应用卷模式超滤装置超滤：将经过陶瓷膜装置过滤后的滤液用卷模式超滤装置超滤，获得超滤液；

4、(3)应用纳滤装置纳滤：将经过卷模式超滤装置超滤后的超滤液用错流纳滤装置纳滤，得到纳滤液；

5、(4)rna预处理液上样：将透过纳滤装置的纳滤液上柱分离。

6、优选的，所述错流陶瓷膜装置的工作压力为0.2～0.5mpa；进一步优选的，工作压力为0.3～0.4mpa

7、优选的，所述错流陶瓷膜装置的温度为10～30℃，时间为2～7h；进一步优选的，温度为10～20℃，时间为3～5h。

8、在一种优选的方案中，所述错流陶瓷膜装置过滤50m3rna酶解液的过滤面积为30～40m2，工作压力为0.3～0.4mpa，温度为10～20℃，时间为3～5h。

9、本发明中应用错流陶瓷膜过滤装置，取代板框过滤，在除去颗粒、胶体等杂质的同时，可去除20-30％色素，溶液澄清度可以从板框过滤的80％提高到92％，过滤面积可缩小70-80％。板框过滤只能去除颗粒性杂质，若再需提高除杂效果，需先将rna酶解液的ph调至10.5，去除部分碱性蛋白，加硅藻土过滤后，再调ph至3.0左右，去除部分酸性蛋白。这样反复过滤需要使用大量硅藻土，用过的硅藻土按照环保要求需按危废物类排放，容易给环境造成二次污染。同时，硅藻土会吸附很多物料，使核苷酸收率降低。此外，拆卸板框和洗涤滤布劳动强度大，污染严重。板框过滤即使采用以上措施透光率也只能达到85％。所以对于生物提取或发酵醪液澄清过滤是一个非常困难的问题。本发明人意外发现，本发明应用新型错流陶瓷膜装置过滤，减少了杂质表面积累，减轻了过滤压力，所以过滤前不需要加硅藻土。过滤完毕，只需要少量水或稀碱溶液清洗一下即可，而且过滤后澄清度也明显提高。用板框过滤，一般测得过滤液的透光率t660为80％，而陶瓷膜过滤液的t660可达92％以上。由于错流陶瓷膜过滤器效率高，速度快，处理后所剩10％溶液可分多次加清水继续过滤，这样收率可达98％，从而做到其中核苷酸产品的几乎零损失。传统陶瓷过滤或管式陶瓷过滤是采用“全量过滤”、“滤饼过滤”等过滤方式，利用真空或压力，垂直方向通过陶瓷介质，需要工作压力高，效率低。而本发明采用动态的新型“错流过滤”方式，它是我国近年来研制的新型装置，首次应用在本发明中，能通过自身多孔陶瓷介质及所附膜层的筛分效应而实现的物质的分离。在压力驱动下，物料在陶瓷膜管内高速流动并具有一定的压力，物料流经膜面时小分子物质垂直透过膜面，而杂质则被截留并被迅速流动料液冲刷走，从而达到更好分离效果。动态的新型错流陶瓷膜分离技术具有高效、节能、环保和纳米级过滤等特性，分离过程不发生化学反应。

10、优选的，所述卷膜式超滤装置的膜截留分子量为3000d、5000d、10000d中的一种或多种；进一步优选的，为5000d和10000d。

11、优选的，所述卷膜式超滤装置的压力为0.2～0.5mpa；进一步优选的，为0.3～0.4mpa。

12、优选的，所述卷膜式超滤装置过滤50m3过滤液的膜面积为20～100m2；进一步优选的，为30～80m2。

13、本发明中，应用卷膜式超滤装置能从分子层面去除色素和蛋白质，卷模式超滤装置特点是过滤表面积大，死体积小，适合大规模工业生产应用。在使用中，提高了溶液澄清度t660的数值，延长了阴离子树脂的使用寿命。本发明人发现，酶解液的色素和蛋白质主要通过卷膜式超滤装置去除。发明人使用了截留不同分子量的超滤膜，例如3000d，5000d和10000d等，通过实验发现只需截留为10000d分子量的膜即可达到理想效果。截留10000d分子量的超滤膜可去除50％色素和几乎所有蛋白质。而且不需要像板框那样反复调ph，节约了大量的酸碱，获得了明显效果。10000d分子量超滤过后的过滤液的t660可达95％。5000d分子量的超滤膜可去除透过液中所有蛋白质、80％的色素，其t660可达99.3％。阴离子树脂使用20次以上色泽不变深，而且仍能保持原有的交换量。由于错流陶瓷膜过滤效果好，不需要板框过滤后再使用微滤工艺，而且超滤速度更快，使用的超滤膜的面积约可减少50-70％。

14、优选的，所述纳滤装置膜纳滤50m3超滤液的过滤面积20～80m2；进一步优选的30～40m2。

15、优选的，所述纳滤装置膜截留分子量为150～500d；进一步优选的，为150d。

16、优选的，所述纳滤装置的温度为10-20℃、压力0.3～1mpa，时间2～7h；进一步优选的，温度为15℃(±2)、压力0.4～0.7mpa，时间3～5h。

17、本发明中应用纳滤装置可去除钙、镁、锌等离子，提高了核苷酸浓度，从而缩小了上样体积，进而提高了分离效果。本发明人发现，应用150d分子量的纳滤装置可去除钙、镁、锌等离子，并使核苷酸浓度提高，使上样体积缩小了3～5倍，这样离子交换层析分离时可避免以上离子的干扰，而且上样体积小，可使层析带分布变窄，有效提高了分离效果。

18、本发明首次应用了组合膜过滤新技术、新装备预处理rna酶解液，提高了rna酶解液的分离效率，提高了rna酶解液的分离效果，适用于规模化工业。它的规模工业应用一是基于膜过滤技术进步、规模化应用、以及造价的降低；二是基于规模核苷酸生产中精细化管理及降本增效的需求。组合膜的排序以错流陶瓷膜过滤—超滤—纳滤时，效果最佳，工艺最合理，其中工作压力是逐渐升高，对于被处理样品要求也是逐步提高。如此组合以后，获得的不仅仅是叠加效果，而是获得意想不到的相乘效果。

19、有益效果：

20、1、本发明应用错流陶瓷膜过滤装置，取代板框过滤，在除去颗粒性，胶体杂质的同时，去除20-30％色素，比板框过滤面积缩小70～80％，去除了硅藻土环境污染。并使超滤面积缩小了50～70％，收率提高15～20％。

21、2、本发明应用卷模式超滤装置能从分子层面去除色素和蛋白质，减少了酸碱的使用量，提高了溶液澄清度t660的数值，延长了阴离子树脂的使用寿命，减少了纳滤装置面积。

22、3、本发明中应用错流纳滤装置可去除钙、镁、锌等离子，提高了核苷酸浓度，从而缩小了上样体积，进而提高了分离效果。

23、4、本发明先用错流陶瓷膜过滤装置过滤，再用卷模式超滤装置过滤，最后用错流纳滤装置过滤，这种针对rna酶解液去除其杂质的应用组合模的新工艺，可以获得更高效，且成本低的相乘效果。