一种基于DNA纳米花修饰硅胶整体柱的手性毛细管电色谱及其应用

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种基于dna纳米花修饰硅胶整体柱的手性毛细管电色谱及其应用。

背景技术：

1、由于一对对映异构体之间具有不同的生理作用与药理毒性，手性拆分具有重要的现实意义。在众多手性分离方法中，毛细管电色谱(cec)技术具有其独特的优势，其结合了高效液相色谱的高选择性和毛细管电泳的高效性，并可采用微升级的试剂实现多种样品的快速分离，因此cec更为环保、节约。作为一种快速高效、低样品消耗的技术，cec在手性分离领域有着广阔的应用前景。开发新型的手性选择剂在手性cec体系的构建中占据重要的地位。内源性的生物分子包括dna，蛋白质和多糖可作为优越的手性选择剂。dna是天然的自组装生物分子，已有研究选用dna作为手性供体构建基于不同种类纳米材料的手性传感器，较少有文献报道将dna与纳米材料结合应用于cec手性分离。

技术实现思路

1、本发明的目的在于拓宽目前可使用手性选择剂的范围，提供一种基于dna纳米花修饰硅胶整体柱的手性毛细管电色谱及其应用。选用dna纳米花作为手性选择剂，将dna纳米花键合于氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱上，将得到的dna纳米花修饰毛细管柱用于手性分离，并实现了其对酪氨酸、普萘洛尔、阿替洛尔及萘福泮的基线分离。

2、为解决其技术问题本发明所采用的技术方案如下：

3、一种用于毛细管电色谱手性分离的dna纳米花修饰硅胶整体柱，为氨基化的dna纳米花改性的氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱，dna纳米花具有花形的结构。

4、进一步的，氨基化的dna纳米花的合成包括如下步骤：dna模板链通过氨基修饰的引物链使dna模板链形成环状模板，再进行滚环扩增获得具有多段重复序列的长链dna，经液体结晶获得氨基化的dna纳米花。

5、进一步的，环化模板通过如下步骤获得：将dna模板链与氨基修饰的引物链混合在10×dna连接缓冲液中，加热反应(一般在95℃条件下加热5min)，随后缓慢降温到室温，得退火产物；然后采用t4 dna连接酶连接退火产物，在室温下反应(一般4h)获得环化dna模板。

6、进一步的，滚环扩增方法包括：将环化dna模板与phi29 dna聚合酶，dntps，bsa在30℃条件下共孵育3h，通过75℃加热10min终止该反应，离心沉淀，去离子水进行冲洗，获得氨基化的dna纳米花。

7、本发明制备的氨基化的dna纳米花由dna重复序列经液体结晶自组装形成。与传统dna纳米材料相比，氨基化的dna纳米花的合成并不依赖于碱基互补配对，因此可避免复杂的序列设计过程。并且，dna纳米花具有较高的稳定性，可耐高温及核酸酶的处理。因此，将dna纳米花应用于cec手性分离具有其独特的优势。

8、进一步的，毛细管硅胶整体柱的制备：首先将毛细管用碱和酸进行预处理，将聚乙二醇、尿素、醋酸和四甲氧基硅烷混合，在冰浴下搅拌形成溶胶；将上步形成的溶胶超声脱气，注入已预处理的毛细管柱中，封端后置于40℃水浴锅中反应40小时后取出，120℃加热3小时，放置一周，程序升温至320℃焙烧24小时，得到毛细管硅胶整体柱。本专利所采用的毛细管硅胶整体柱可提供丰富的硅羟基官能基团利于进一步引入活性基团以键合dna纳米花。其它常用的毛细管硅胶整体柱例如毛细管硅胶杂化整体柱含有不同的活性基团，分别适用于不同的反应；并且杂化整体柱一般采用“一锅法”制备，可调性不是很强。除了选择合适的手性选择剂，用于生物分子固定化的担体也是手性分离体系构建过程中的重要因素。担体在这里指的是硅胶整体柱。与毛细管开管柱及填充柱相比，硅胶整体柱具有更高的比表面积用于生物分子的固定化，其多孔结构适于小分子的分离，并且其具有较高的稳定性利于多步键合反应的进行。

9、进一步的，氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱通过如下步骤获得：将含氨基的硅烷偶联剂(例如3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷)的甲苯溶液(质量浓度一般10％)注入酸化后的硅胶整体柱中，封端后于110℃反应6小时，用甲苯和无水甲醇冲洗除杂，得到氨基修饰的硅胶整体柱；将氧化石墨烯水溶液超声分散后用氢氧化钾溶液稀释(氧化石墨烯和氢氧化钾的质量比为1:2)，注入氨基化的硅胶整体柱中，封端后于40℃反应2小时，用水冲洗至中性，无水甲醇冲洗除杂，得到氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱。

10、氨基化的dna纳米花改性氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱的方法，包括如下步骤：采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对氧化石墨烯修饰的硅胶整体柱进行功能化，然后将氨基化的dna纳米花溶液灌入整体柱中，充分反应(进一步的，将浓度至少为20mmol/l 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的磷酸盐溶液注入氧化石墨烯修饰的硅胶整体柱至少1小时，再注入dna纳米花溶液，反应至少5小时)，然后缓冲液冲洗去除未反应的dna，得到氨基化的dna修饰的毛细管硅胶整体柱，贮存于电泳缓冲液中。

11、dna单链的序列分别为:

12、模板链：5’-phosphate-cac aac cac cac cac caa atc gtc cag gtc gtt gtagct agc ctg gcc gcg gaa cag tac cag tcg ttg tag cta gcc tca cgg ctg aac caccac cac-3’

13、引物链：5’-nh2-gtg gtg gtt gtg gtg gtg gtg gtt-3’

14、模板互补链：5’-nh2-gtg gtg gtg gtt cag ccg tga ggc tag cta caa cga ctggta ctg ttc cgc ggc cag gct agc tac aac gac ctg gac gat ttg gtg gtg gtg gttgtg-3’

15、本发明还提供了dna纳米花修饰硅胶整体柱的应用，即用于毛细管电色谱手性分离。

16、进一步的，包括如下步骤：将手性分子溶于电泳缓冲液中，配制样品溶液；dna纳米花修饰硅胶整体柱经电泳缓冲液进行平衡后(一般30min左右)进样，电泳分离条件为10kv进样1-6s，分离电压5-15kv，缓冲液浓度10-30mm。

17、进一步优选分离条件为：进样量为10kv，3s；毛细管电泳分离电压为10kv；缓冲液浓度为20mm。在该条件下dna纳米花修饰毛细管硅胶整体柱和萘福泮对映异构体的相互作用力强，可以取得较好的手性识别效果。

18、进一步，手性分子为酪氨酸，阿替洛尔，萘福泮，普萘洛尔中的一种。

19、dna纳米花具有较高稳定性，其内大量的dct单元量协同dna纳米花的纳米效应，增加了手性药物与其之间的相互作用，从而增加手性分离效能。

20、本发明结合了dna纳米花及毛细管硅胶整体柱的优势，构建了新型cec手性分离体系。采用上述的技术方案后，本发明取得了有益效果：本发明提供的dna纳米花修饰的毛细管硅胶整体柱手性分离的方法，进一步拓展了dna纳米材料作为手性选择剂在毛细管电色谱手性分离领域的应用。