聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球吸附剂的制备及其在免疫球蛋白G富集中的应用

本发明涉及纳米材料的制备和应用领域及纳米生物分析领域，特别涉及聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球作为吸附剂在生物医学研究中对免疫球蛋白g的富集的应用。

背景技术：

1、蛋白质不仅是生命的物质基础，也是人体必需的营养物质。人体的内脏，血液，大脑，神经，指甲，头发等都是由蛋白质构成的。蛋白质还参与调节，催化，运输，储存，保护等多种重要的生理功能，保证机体的生长、发育、遗传、繁殖及修补损伤的组织。

2、免疫球蛋白是人体的免疫系统中，最重要的组成部分，免疫球蛋白含量的高低和疾病的发生有着密切的关系。免疫球蛋白g是血液和细胞外液的主要抗体类型，在人体血清中的含量最高，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分。而且它也是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白，对哺乳动物新生幼仔，新生儿抗感染有着重要的作用。对免疫球蛋白g进行监测，可以判断和鉴定感染性疾病，免疫增值性疾病以及免疫缺陷疾病等。临床上，免疫球蛋白g含量水平的测定通常被认为是机体对特定病原体免疫状态的指示，用于预防流感，预防风湿性疾病，抵抗癌症等疾病。

3、然而，免疫球蛋白g富集的重要挑战是复杂生物样品中存在许多其它干扰蛋白。因此探索高效富集免疫球蛋白g的方法具有明显的重要性。在过去的十几年中，基于蛋白质和材料之间的相互作用，已经开发了许多蛋白质富集的方法，例如通过亲水性相互作用，螯合作用，静电力，氢键等进而对目标蛋白进行富集。此外，多种的富集方法也被开发使用，例如通过液-液萃取，沉淀，电泳，超滤，固相萃取等方法进行蛋白质的分离富集。其中，固相萃取大多是用固体形式的吸附剂对基质中的目标物质产生相互作用力来对其选择性吸附，从而完成对目标物质的分离富集。由于固相萃取分离效率高，可靠，消耗试剂少，操作简单，而且对目标物质有较高的选择性和回收率。所以本发明通过固相萃取的方法将免疫球蛋白g从复杂样品中分离出来。

4、钛酸盐纳米材料由于其优异的物理化学性质，常用作光催化剂、湿敏传感器、高介电常数器件和纳米生物材料等。近年来，钛酸盐纳米材料在生物大分子的富集中逐渐的被开发使用。钛酸盐纳米材料的制备方法有很多，目前主要有固相法，共沉淀法，溶胶-凝胶法和水热法。本发明采用水热法制备聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球。此方法制成的材料成分纯度高，团聚程度轻，晶粒组分和形态可控，能够在较低的温度下完成材料的合成。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对免疫球蛋白g富集方法的局限和提高钛酸盐纳米材料的应用范围，提供了一种聚多巴胺修饰的钛酸盐纳米微球的制备方法及应用方向，制备的钛酸盐纳米微球具有开放的中孔形态和较高的比表面积，由于聚多巴胺含有丰富的亲水性基团，可与富含亲水性基团的蛋白质形成亲水相互作用，故能选择性的吸附免疫球蛋白g。本发明制备的钛酸盐纳米微球作为固相萃取吸附剂，能够实现复杂蛋白质样品中免疫球蛋白g的富集，并对复杂生物样品(人血清)中的免疫球蛋白g实现富集。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球吸附剂(pda-utms)的制备方法，工艺步骤为：

4、(1)钛酸钠纳米管(na-tnt)的合成：二氧化钛p25在naoh溶液中采用水热反应制备na-tnt；

5、(2)海胆状钛酸钠纳米微球(na-utms)的制备：利用步骤(1)得到的na-tnt，采用溶剂热法合成na-utms；在naoh溶液中将na-tnt与h2o2超声搅拌，得到均一的混合溶液；将混合溶液转移到高压反应釜中进行溶剂热反应，反应结束后自然冷却至室温，用去离子水洗涤4-5次，真空干燥后得到海胆状钛酸钠纳米微球(na-utms)；

6、(3)质子化的海胆状钛酸盐纳米微球(h-utms)的制备：利用步骤(2)得到的na-utms与hno3进行质子交换合成h-utms；

7、(4)聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球吸附剂(pda-utms)的制备：利用步骤(3)得到的h-utms，在其表面修饰聚多巴胺，合成pda-utms；具体为，h-utms分散于三(羟甲基)氨基甲烷(tris)溶液中与多巴胺水溶液混合，在室温下进行搅拌，待反应结束后，用去离子水洗涤，真空干燥后得到聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球(pda-utms)。

8、所述步骤(1)中，将2g p25放入40ml 10-15m naoh水溶液中，超声搅拌5-10min后，转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，并密封；将反应釜放入烘箱，100-120℃加热处理24-48h，反应结束后在空气中自然冷却，生成na-tnt沉淀物，离心，洗涤，干燥。

9、所述步骤(2)中，将0.2g na-tnt和1.5ml h2o2(30％)加入40ml 0.5-1.5m naoh水溶液中进行溶剂热反应，反应温度为130-150℃，反应时间为10-14h。

10、所述步骤(4)中，将10ml 0.5-1.5mg ml-1的多巴胺水溶液缓慢加入50-100mg h-utms与10ml 0.1mg ml-1tris的混合溶液中，搅拌时间为2-4h。

11、本发明还提供所述聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球吸附剂(pda-utms)在对免疫球蛋白g富集中的应用。具体应用方法包括：

12、(1)pda-utms对免疫球蛋白g的吸附：利用pda-utms上的聚多巴胺的亲水性基团与免疫球蛋白g的亲水基团的亲水相互作用，将免疫球蛋白g从复杂样品中进行选择性吸附。

13、(2)将免疫球蛋白g从pda-utms上洗脱：利用洗脱液氨水与微球上结合的免疫球蛋白g之间的相互作用，将吸附在pda-utms上的免疫球蛋白g洗脱下来，从而达到对复杂样品中免疫球蛋白g富集的目的。

14、富集免疫球蛋白g的过程中：将100μl 10mg ml-1pda-utms为作为吸附剂置于900μl的0.1mg ml-1的免疫球蛋白g的0.01-0.05m tris-hcl溶液中。吸附时间30-60min。洗脱时间30-60min。利用紫外/可见分光光度计检测吸附与洗脱情况。

15、富集蛋白混合溶液中免疫球蛋g的过程中：将100μl 10mg ml-1pda-utms，50μl 2mgml-1免疫球蛋白g，50μl 2mg ml-1牛血清白蛋白和800μl ph＝7的0.01-0.05m tris-hcl混合形成混合蛋白溶液。吸附时间30-60min。洗脱液为0.5％(m/v)氨水，洗脱时间30-60min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测其富集效果。

16、对人血清中免疫球蛋白g的富集的过程中：将100μl 10mg ml-1pda-utms，10μl血清和890μl ph＝7的0.01-0.05m tris-hcl混合。吸附时间30-60min。洗脱液为0.5％(m/v)氨水，洗脱时间30-60min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测其富集效果。

17、本发明采用的纳米微球稳定性好，由于其开放的中孔形态和较高的比表面积，使其具有较多的活性位点。本发明通过对不同ph值和不同离子强度下聚多巴胺修饰的钛酸盐纳米微球对免疫球蛋白g的吸附情况进行研究，通过考察了不同洗脱液对免疫球蛋白g的洗脱情况，从而探究聚多巴胺修饰的钛酸盐纳米微球对免疫球蛋白g的富集最佳条件。成功的应用于免疫球蛋白g和牛血清白蛋白混合溶液中免疫球蛋白g的富集和人血清中免疫球蛋白g的富集。

18、本发明制备的聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球吸附剂及其在免疫球蛋白g的富集中的应用，与现有技术相比，本发明的优势在于：

19、1、本发明采用水热法制备聚多巴胺修饰的海胆状钛酸盐纳米微球。与传统的固相制备方法相比，此方法制成的材料团聚程度轻且能够在较低的温度下合成；

20、2、与传统的免疫球蛋白g富集方法相比，效率高，消耗试剂少，操作简单；

21、3、本发明制备的纳米微球稳定性好，由于其开放的中孔形态和较高的比表面积，使其具有较多的活性位点，可以对免疫球蛋白g有更好的富集能力；

22、4、本方法制备的固相萃取吸附剂可以对目标蛋白进行富集，实现了复杂蛋白质样品和人血清中免疫球蛋白g的富集。