包括固定在盘表面上的俘获分子的方法

专利名称：包括固定在盘表面上的俘获分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过与固定在盘表面上的俘获分子键联来检测和/或量化目标分子的方法。
本发明还涉及一种其表面上固定有不可分割的俘获分子的盘和该盘的制造方法，以及此盘或包括此盘的诊断和/或读取装置。
目标分子(如从微生物上获取的核苷酸序列)的完整的检测方法需要下列筹备------样品的制备；------净化分子的放大；------上述分子与最好是定位在固体支撑物上的“俘获”分子(即序列或受纳体)键联；------贴标签；和------对从标签上获取的信息的分析。
因此，存在一种对能够执行这些步骤的几种(或全部)、尤其是分析获取的信息，并能够在大量的复杂分子或待检微生物中识别特殊分子的简化的自动装置和方法的需求。
对键联到确定小表面上的分子微型化的搜索及其位置的识别导致使用微电子电路，用于设计成DNA片的网络结构(美国专利US5632 957；US5 605 662和WO94/22889)。
分析大量生物分子的另一种方法是生物芯片。这些生物分子可以通过直接合成生物芯片表面上的俘获分子形成(WO97/29212)，也可以通过在它们的合成或离解之后固定这些俘获分子来形成(WO98/28444)。上述这些技术的一个缺点是使用复杂和昂贵的设备读取非常低的信号。另外，当必需进行量化检验时这些设备包括用于识别疵点位置和信号集成的特殊软件。
电子装置可以控制类似俘获的寡核苷酸或抗体的实体特定结合到特定的微位置的输运和连接，以便把可自寻址装置切成薄片。为了定位分子，可以给一个微电极充正电以把寡核苷酸吸附到其表面。与目标分子如DNA或抗原结合之后，利用外荧光(epifluorescent)型显微探测系统进行检测，对目标分子结合到其上的微电极进行定位。
上述技术已被应用于附着到基板的DNA键联蛋白，从而在形成微电路的基板上形成一个网络(美国专利US5，561，071)。
但是，在可利用的俘获分子的数量上还有限制，这是由于在装置的每个微电极上必需一个一个地固定这些俘获分子这一事实。其它的限制是由于发射信号的分散在分辨来自相邻电极的信号时的分辨率。最后，在处理之前必需分析和解释发射信号。
因此，必须在一种固体支撑物上提供数量增大的“俘获分子”，从而能够识别和/或量化特定的目标分子、目标微生物或他们的一部分。但传统的检测支撑物和装置不是很容易地适于这种应用，因为他们受所包括的“俘获分子”数以及信号和样品的特性或再现性之间的差异限制(见美国专利US5 567 294)。另外，读取机器也过于复杂和昂贵。
专利文件WO98/01533描述了一种可分割的信号元件，该元件包括一个有基底附着端(可以是密集盘)和信号响应端(可以连接到金属珠粒，尤其是金珠粒)的可分割隔离物，和一个适于键联到选定的分析物的第一位置上的第一侧面元件以及适于键联到选定的分析物的第二位置上的第二侧面元件。
但是，这种复杂并昂贵的检测方法和装置在各种复杂的分析中会呈现各种假阳性或假阴性，这会对可分割的信号元件引起各种干扰。
本发明涉及一种如权利要求中所述的检测和/或量化目标分子的方法。
本发明还涉及一种如权利要求中所述的在其表面固定不可分割的俘获分子的盘，此盘可用在根据本发明的检测和/或量化方法中。
本发明的另一个方面涉及上述盘的制备方法，包括上述盘的诊断工具，包括上述盘的诊断和读取装置或能够读取并分析出现在本发明的盘上的数据的诊断和读取装置。
“盘”的技术特点“盘”一词意指一种平面固体支撑物(通常以盘的形式)，它包括一个孔，盘能绕位于孔中心的轴(A)旋转，由包括一个或多个聚合物层的刚性材料制造并可被一层或多层(如金属或铝薄层)覆盖，从而能够穿透或反射光束，尤其是激光束，此光束用于检测并读取盘上预存储的数据(见

图1)。
制备上述聚合物和金属层的结构以便使得激光束只能透射和反射选定的层。例如，该盘包括一个允许透射激光束的上层，而激光束只被较内部的第二金属层反射。
“盘”的定义包括任何固体支撑物，如CD或包括可由CD读取装置读取(通过激光束的透射和反射)的数据的DVD。
“可由CD读取装置读取的数据”指寄存的数据(即关于固体支撑物特定区域的俘获分子的特性)或用于作为目标和俘获分子键联结果的信号的处理的数据。
这种密集盘的一个或多个区用于以标准的读取/写入数字技术进行的数据处理(CD轨道；见图3至5和7)。用于处理和分析的特定数据利用数字记录装置记录在密集盘上。在另外的优选实施例中，盘上的只读存储器(ROM)包括密集盘信息，指令，试验协议，可由操作盘的用户访问的数据分析和统计方法以及俘获分子和目标分子之间的键联位置和结果的记录。
另外，该盘可以包含电子电路，包含用于盘函数坐标的微处理器和联系盘操纵和/或读取装置或其他装置通讯的装置。盘最好包括检测器和传感器，或这些装置的元件以及各种检测电路的能量源(如向电化学系统供电的电源，用于频谱系统的电磁辐射源)，或便于利用这些检测器、传感器、驱动器产生数据和操纵的材料，如光学透明材料，利用电磁(激光、红外广、射频、微波)、电或其他装置间接进行盘与播放/读取装置的通讯和数据处理装置；设计用于控制盘上的程序和处理的电路，控制包括系统诊断、样品记录和样品数据的分析。这些以只在制造时被编程的ASICs或ROM，FGPA’sEPROM闪速存储器(UV可除去的EPROM)或可编程的IC阵列、或类似的可由用户通过平台操作装置或其他装置编程的阵列的形式设置。包含在本发明组件中的还有CPU和微处理器单元，以及用汇编语言或通过盘通讯的可编程的高级语言工作的相关的RAM，和间接与其他装置通讯的组件，包括与远程显示器或数据分析系统连通的传真/调制解调器。
根据本发明的盘的一个优越的方面在于嵌入盘材料中的预寄存数据图案的显微阵列的密度。这是一种利用激光束检测反射盘表面压痕的光学存储。把数据压缩成微小的程度并将其精确地读出的这种能力给予本发明的盘一种确定的特性和储存大量数据的能力(对于视频数据，一个密集盘的储存量大约为650MB的数据)。
根据本发明的盘适于将各种激光束透射和反射到不同的聚合物或金属层上。
例如，用于发射激光束和反射激光束的lecture的激光器可以优越地包括设置在盘和光度计之间的全息光栅。
盘一般的厚度为1.2mm，直径为4.72英寸，但也存在更小的支撑体并适于特殊的应用(如把俘获分子和目标分子之间的键联放入到陪氏培养皿)，并且盘的厚度可根据本发明使用的检测方法和俘获分子的技术需要而定。
盘可以结合到凹槽中由激光束进行lecture。在上述凹槽中结合“寄存”数据，这些数据之后可以被解析并有利地转变成数字数据。上述的寄存数据最好是二进制信息的形式。这些凹槽也最好包括固定的非分割的俘获分子。
通过其密集和窄小的聚焦光束，激光器提供一种在迅速旋转的盘表面进行上千条细小压痕的信息的检测和寄存的方法。所述检测方法不产生摩擦，因为检测是基于反射光中的相移的测量。此技术允许检测相当的数据压缩，因为仔细聚焦的激光束能够以光速对盘表面的极细微的变化进行响应。
从典型的自然光源或人工光源中发出的光包括甚至当光子从同样频率的光束中产生时以随机波图案移动的光子。这类光束被认做非相干光，意味着光波在所有的方向上传播。相比之下，与激光有关的光是优秀的相干光。
当能源进入激活介质中时产生激光束。位于激活介质每个侧面上的一对反射镜用于引导撞击到它的一部分辐射。激活介质可由气体混合物(如氦和氖)或晶体中的离子(如在典型地用于密集盘驱动和记录器中的砷化镓激光器中发现的)。用于激励光的材料和能源决定产生的光束的强度和密度。用在CD设备中的激光器通常的功率非常低。
CD驱动激光射向旋转盘，反射光穿过透镜并照射到光电二极管(见图3至图5)。盘表面上的数据以凹点(盘中的凹痕)和平台(盘的表面)或盘轨道的形式被编码。
耦接到光电二极管的逻辑计时电路可以寄存光传播的距离(光入射到盘表面)和光传播的距离(光入射到盘表面的凹痕)之差。该差值备检测为光束的相位差。
至于所有的数字编码信息，由连续的凹点和平台构成的图案-----被光电二极管转换为1和0的电子串-----能够代表更多复杂的模拟等价物，比如对于当前的情形，目标分子和俘获分子之间的键联水平。这些出现在本发明盘表面上的凹点表示的信息是“俘获分子”和“目标分子”之间键联的结果。
在其表面固定了俘获分子的盘可包括一个由有机化合物制成的保护层，该保护层能够或提高对俘获分子的保护和稳定性，俘获分子例如是一个蛋白质的和/或糖类化合物制成的层，如白蛋白、双糖(如海藻糖等)。
本领域的技术人员把这一层的成分用于特殊的俘获分子。如果需要，可采用这些成分，以使激光束毫无困难地读遍上述层并检测目标分子和俘获分子之间的键联或键联的结果。如果需要，在俘获分子和目标分子的键联之前或之后可以省去上述层。
为了只通过盘上的一系列凹点进行成功地通讯，需要计算机处理和一些已可得到的高技术手段。激光器读取机构没有一个点触击到盘表面；所有的数据最好通过激光的反射传输。在标准的音频CD中，当激光束被平台反射时需要花费一定的时间返回，但如果被凹点收到并反射，则需要更长的传播时间。凹点的深度被加工成激光波长的1/4。如果从凹点反射的光束取消了来自平台的光束，则可获得信号传递。信号传递(通过信号的开始和结束发出信号)表示二进制1。如果没有信号传递，则表示二进制0。
市场上CD驱动器的一个特点在于读取这些凹点并以900Kb/sec的速度输送数据，使得这种激光反射器技术特别适合于读取的不仅是寄存的凹点，而且是键联的结果。
为了在读取数据图案时保持同步，CD驱动器利用通常在硬盘驱动器中存在的自计时机构，也被称作运行长度限定(Run LengthLimited)。因为数据存在于螺纹轨道上的有限分区中，每个数据分区延伸大约300nm，所以CD微控制器可通过使盘的旋转速度和转换的发生同步而产生规律的时钟信号。虽然很多形式的数据存储器使用8位序列储存数据字节，但标准的CD需要14位图案来避免产生将阻碍存储数据解码的1和0的合并。存储器的这种改变的形式称作EFM(八-十四调制)。称作合并位的附加的3位用作14位部分之间的分隔器，造成一个17位的图案表示数据的单个8位字节。
数据在位水平的另一种重要的划分是帧，它包括588位。帧包含一个位集它们中的一些表示数据，另一些使得激光能够与盘的旋转同步，还有一些对CD设备中的误差校准功能有用。这个位集中只有24个17位单元(408位全部)可以转换成8位字节。需要很多附加位输送包含在两打数据字节中的信息。
根据本发明的盘可以是任意一种“外部”形状的形式。如上所述，上述盘的形式最好是圆形或椭圆，但它外部的形式也可以是六角形、八角形，或是能够使盘沿中心轴(A)旋转的正方形或三角形。
根据本发明的盘可对应于CD-ROM XA、CD-DVD、音频CD、CD-ROM、CD-I、可记录的CD和光电或视频CD(CD-ROM和CD-I桥)标准。根据数据存储器的类型、精确度以及信息量，上述CD标准可以不同。
根据本发明的盘的特定区域可用于读出作为目标分子和俘获分子键联结果的反应。这些特定的区域是本发明盘表面的一部分，或是第二种材料固定其上的盘的一个区域，它的表面上包括俘获分子。这些区域可以是盘中的一个空隙。第二种材料是一条塑料带，其上已进行了目标分子和俘获分子的键联，并且之后为了特定的读取而固定到盘上。
优越之处在于每个带可以负载几种不同的俘获分子，这些俘获分子将与待分析的相同的或不同的样品发生特定的反应。之后，可以分别地或同时地读出同一盘上的信号。一个传统的盘，如密集盘，可以处理这种带在20条以上。
最利于制造和操作本发明密集盘的优选实施例具有在一个或多个预存格式之内的尺度-3寸密集盘(CD)，具有大约3.8cm的半径和1mm的厚度；-5寸CD，具有大约6cm的半径和1mm的厚度；-8寸CDV(市场上称为“激光视盘”)，具有10cm的半径和2mm的厚度；和-12寸CDＶ盘，具有15cm的半径和2mm的厚度。
存储在磁带上的数据寿命是6到12年。对可记录密集盘寿命的估算通常提议一个百年的存储数据。
根据本发明的特定盘的寿命较短，并且通常受金属撞击和固定在固体表面的俘获分子变性的限制。储存在CD中的数据可以以硬盘驱动器的熟悉的同心圆环(称作轨道)或类似过去唱片的连续螺纹的形式存在。
密集盘的一个特点以及它的编码信息是寻轨系统。在市场上可得到的CD记录机中存在不同的系统，以便控制其中在盘的径向上光学读取器的运动，并搜索存在于CD上的高达20000条不同径向轨道中的一条。上述技术很适于读取作为目标分子和俘获分子之间键联结果的信号。信号的读取和预寄存信息的读取可以由同一装置执行，也可以由两个不同的读取装置执行，可以是相同的激光束读取装置或两种激光束读取装置。
径向寻轨的校正(通过光束识别俘获分子上的键联)利用特殊的系统执行，如同出版物《CD-ROM手册》(Chris ShermanEditor，Intertext Publication，McGraw Hill Inc.)第二版中所述。为了定位激光器的读取头，CD驱动器还采用特殊的装置伺服机构。
最好盘在由塑料、硅、石英、金属或陶瓷和/或微通道制成的平台上组合微制作机构和/或光学控制元件，如WO97/21090中所述。为了本发明的目的，“微制作”指能够在亚微米尺度上产生这些结构的方法。这些方法包括但不局限于那些为本领域技术任意所熟悉的光刻、蚀刻、胶黏或其它毫微或微技术方法。
在下列的公开物中给出了关于CD固体支撑物的另外描述CD－ROM手册(第二版)(Chris Sherman Editor，IntertextPublication，McGraw-Hill Inc.)，完全可记录的CD指南(Lee Purcell&David Martin，Sybex Editions)，数字视盘和密集盘技术(第二版)(Luc Bart，Luc Theunissen and Guido Vergult，Sony Service CenterEurope，ED.BH Newnes)。
“目标”分子和“俘获”分子“目标”分子和“俘获”分子可以是任意一种生物和化学化合物，彼此之间可以产生键联(或凝固)，键联或键联的结果可由读取装置检测，最好利用光束尤其是激光束检测。
最好目标分子存在于从包含血液、尿、脑脊髓液、血浆、唾液、精液、羊水、空气、水、土壤或分解的生物物质等组合物中选取的一种样品中。
上述“目标分子”和不可分割的“俘获分子”最好是从包含核酸、抗体、糖类、脂类、缩氨酸、蛋白质、植物血凝素、催化剂、受体、受体的兴奋剂或抗兴奋剂、荧光团、色基、螯合物、半抗原、离子、具有不同手性结构的分子、由组合化学或其它功能化的宏观结构获得的新合成的化学大分子、部分或其组合等等一组物质中选择的合成或自然分子。
“不可分割的俘获分子”是指那些不包括和不需要一种可分割间隔的分子，能够或允许进行对目标分子和俘获分子之间键联的检测，如专利文件WO98/01533中所述。根据本发明，目标分子和俘获分子之间简单的键联之后能形成先前不存在的并且可由利用光束尤其是激光束的读取装置直接或非直接检测的信号，无需俘获分子的任何特定的分割。
为了获得对目标分子的监测、研究和病理的、治疗的、毒性的特征行为和/或其它改进的特点，最好对根据本发明的目标分子或不可分割的俘获分子进行检测和/或量化。
抗原/抗体键联使得能够进行抗原或抗体检测并用于根据RIA或ELISA检测法的诊断测试。配位体/受体主要在药理学研究以筛选新分子(兴奋剂、抗兴奋剂或受体的反兴奋剂)方面得以开发。通过对大量基因序列了解的增多以及放大、杂交、分离和提纯技术的提高，核苷酸序列的检测也已得到高度发展(如见J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular cloninglaboratorymanual，2nd Ed.Cold Spring，Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1989)。
关于核苷酸序列的第一种通行的检测和放大法包括聚合酶链键联(PCR)(US Patent 4，683，195和4，683，202)或其它的放大，如连接酶链键联(LCR)(Wu and Wallace，1989，Genomics 4560-569)，基于放大系统的转录(Kwohetal.1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173-1177)或循环探子键联(CPR)(Duck et al.，1990，Biotechniques 9142-147和美国专利US5，011，769)。
核苷酸序列在俘获探子上杂交(或通过单个的或夹层杂交)之后通过上述检测和/或量化信号可获得核苷酸序列的检测、量化和记录，并带有给出检测信号的其中一个序列的标志以及可由本发明的读取装置记录的变化。
对DNA序列可以有多种检测方法(通过它自身在260nm处的吸收或通过它在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡存在时的荧光探测)。利用结合到核苷酸序列中的辐射标签32p能够使探测变得敏感，但由于更加严格的安全限制立法的要求，在常规检验时不主张这样。
另外，核苷酸序列可以通过分子(例如，可直接探测到的荧光素、若丹明、钌或镧系螯合物)加标签或以键联酶配对的形式加标签。通过利用生物素或半抗原和配对酶给抗生蛋白链菌素或对应的抗体加标签。优越的是根据本发明的键联产物可获得不通的信号。例如，利用TMB(N-四甲联苯胺)或5溴基-4氯-3-吲哚-磷酸盐作为基底，过氧化物酶和碱性磷酸酶可给出一种彩色物质。利用鲁米诺或AMPPD(3-(2，-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4(3’-磷酸氧基)1，2二氧乙烷)作为基底可得到发光。
DAB(二氨基联苯胺)通过过氧物酶催化键联的氧化之后可以转变成不可溶物质。丙酮酸激酶也可用于由荧光素酶转变的ATP产物，以获得探测光(生物发光探测法)。
类似于等离子体基元表面共振或光学波导的新技术可用于无标签目标分子键联以及随后的的键联运动(Gotoh and all.1995，DNARes.2285-293，StimPson等1995年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，6379-6383)。
密集盘表面上不可分割的俘获分子的固定不可分割的俘获分子最好以特定的间隔固定在CD上，以便可由光束探测装置或其他装置在每种键联之间进行特定的识别，而其中键联是在特定的不可分割的俘获分子与其目标分子之间发生。为了特定的探测，俘获分子最好位于不包括任何凹槽或预寄存信息的盘的特定区域，从而避免任何关于预寄存信息信号所导致的错误正片。
密集盘外表面上不可分割的俘获分子的位置可利用培育的微刻和/或微电机技术通过传统的物理方法寻址，把不可分割的俘获分子保持在将要被固定的特定位置上。另一种方法通过利用光可催化的化学基团得到，能够把不可分割的俘获分子固定到特殊处理的位置上，如外表面的用光束或选择的离子束或选择的等离子体处理的一部分上(见专利文献WO96/15223)。
本发明密集盘的外表面还包含能使盘被基于激光的CD读取器读出的数据(信息通常储存成位于盘凹槽中的一系列凹点，并且需要把不可分割的俘获分子放置在盘的表面)。这可通过被占用的凹点的出现或等同于盘凹槽中凹点的伸出的压痕而获得。表面上不可分割的俘获分子的地址(定位)最好利用这些数据，并如果用相同的激光源读取CD信息，利用作为整个装置一部分的激光束得到。
利用基于共价或非共价键联的传统的方法获得不可分割的俘获分子在盘上的固定。优选实施例是在分子一个末端的共价固定，它能够使存在于表面上的不可分割的俘获分子稳定的固定并匀质以与目标分子键联。
光敏化学基团类似可固定在任何一个分子末端的叠氨基-硝苯基，利用类似磺基瑚铂酸酯6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯胺己酸(Pierce，Rockford，IL，USA)的异二官能剂承载。这种光敏基团只在光照如激光照射的地方反应(Dontha，N.等1997年，Anal.Chem.692619-2625)，并且通过这种方式，特殊探子的固定可以在盘上更好的实施。其他的化学固定存在于类似通过二亚胺碳或热聚物中的吸收而在胺上核苷酸的5’-磷酸盐端基固定。聚合表面可以羧化和氨化，以便能够通过有机化学物质中的公知键联而固定大多数生物分子(Zammatteo等1996年，Anal.Biochem.23685-94)。
对俘获探子物理定位的一种特别的方法是从盘的旋转中产生向心力。液体经出口凹点发出进入该盘，然后位通道护运直到键联腔室(见国际专利申请WO97/21090)。
不可分割的“俘获分子”和“目标分子”之间的键联目标分子在其不可分割的俘获分子上的键联在标准的并且可再现的条件下获得，这两个条件对于核苷酸杂交(杂交最好在标准精确的条件下进行，如Sambrook等$$9.31-9.58在《MoleculaCloning》A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York(1989))公知，对于抗原/抗体键联，对于受体/配位体键联或其他分子间如蛋白/核苷酸或化学的/化学分子的识别公知。
上述分子最好包括(通过自然地或变形)一种化学官能团(伯胺，琉基，醛醇缩合等)，一种公共序列(核酸)，一种抗原决定基(抗体)，一种兴奋剂或配位基以便能够键联。
目标分子与其不可分割的俘获分子之间的键联可依据分子的特定亲和力，依据每个分子的变构特性，依据他们的电离环境，依据分子的电离电荷以及目标分子与其不可分割的目标分子之间的共价反应。上述条件最好是一种已经在文献中对键联的每种类型做过描述的一种，并能够为本领域的技术人员所使用以便避免正的或负的错误探测。
可读出上述键联的光学探测系统最好包括一个光电二极管，能够探测小的光束并根据一个方向轴移动，从而覆盖盘的半径(见图4)。与盘旋转相结合，聚焦的光电探测器扫描盘的整个表面并检定存在于盘上任何位置的目标分子。优选的探测装置是市场上可得到的用于音乐、视频或软盘CD的CD读取器的光电二极管(见图5)。
可以伺服控制光电系统以便停留在对探测面的聚焦。如果提供一个第二光学探测系统用于探测信号，则业可以伺服控制或连接到另一个上进行控制，或者也可以接收来自第一个数据的信号以调节对盘的聚焦及寻轨。从盘表面上的连续读出而接收到的数据可以储存在计算机中，如果需要再重新格式化并分析一确定光点位置。
一旦目标分子与其不可分割的俘获分子之间的键联能够形成一个光度信号，即可获得光度信号。键联(目标分子与其不可分割的俘获分子之间的键联)的探测和/或量化基于利用激光束反射变化的CD二进制探测系统的原理。当在一个凹槽中探测到一个凹点时，可获得激光反射的扰动。
根据本发明的第一实施例，上述凹点是目标分子和不可分割的俘获分子之间键联结果的一个沉淀物。
根据本发明的另一优选实施例，通过对密集盘的一层或几层的诱蚀也可得到激光反射的扰动。例如，目标分子和不可分割的俘获分子之间的键联会引起该层有限的改动，在该层中形成一个压痕(见图3)。层中的这种压痕通常称作“筑堤”或“凸起”，但也统一为负凹点(见文献《Recordable CD Guide》，Lee Purcell&DavidMartin，Sybex Editions)。这些扰动将由激光束作为不同于平地的凹点探测。目标分子和不可分割的俘获分子之间的键联也可以通过当只发生键联时而得到的光发射探测并量化。
根据本发明的另一优选实施例，目标分子和不可分割的俘获分子之间的键联能够使通过化学、生物、荧光灯和/或电致发光系统产生光发射，或产生可被特定的读取装置7探测的磁和/或电场的一种或其它的分子固定(见图1和图4)。
这些系统可基于能够或增强光发射和光探测的特种酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶等)的使用。
一旦目标分子被俘获，就可以使用一个带标签的目标分子6或一个第二带标签的反应分子。此带标签的分子可以是一个键联对的第一元素，如利用辅酶1或带半抗原标志的探子的夹层杂交实验中的核酸2，以及类似地使用带标签的反应分子的抗体/抗原夹层键联中的核酸2。在冲洗步骤之后，辅酶1或半抗原可以与酶配位抗生蛋白链菌素或被认做键联对的第二元素的抗体。可以使用诸如过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或其它脱氢酶的酶。
要得到不可溶的产物，须为酶选择特殊的基底。例如，氧化物酶存在时DAB可以被氧化并形成一种不可溶的产物。这种产物沉淀在不可分割的俘获分子上，并且沉淀将在盘被(激)光照射的盘面上形成把子或凸起。当照射沉淀时反射光强度变低并可得到反射的扰动。通过光敏探测装置把扰动分解成盘表面上的凹点。
如果通过透过盘的透明部分探测，则集尘的呈现则表示一种可以计算的吸收。
当使用胶态金属光金时可获得另一种不可溶物质，例如键联到抗生蛋白链菌素3。当得到键联时胶态金催化银(Ag)4还原成Ag集尘。与通常存在于盘5中的金或铝层相比，银沉淀也可以减少(激)光反射，并且如果没有其它的金属存在，也反射一些光。这种不透光的集尘也可以通过在盘的透射实验中光的吸收探测(见图2和图6)。
还可以使用承载键联分子(第二键联对)的微粒，其中此键联分子可以识别连接到目标分子的第一键联对。这些微粒将位于获得目标分子及其不可分割的俘获分子键联处的盘的表面。这些微粒将衍射激光束并产生激光束反射的扰动。这些反射中的扰动将由光敏探测器探测并分解成盘表面上的凹点。
根据本发明的另一实施例，通过给目标分子(带有一个荧光分子)贴标签而得到探测。激光束将扫描密集盘的表面并分解记录的荧光。可以获得很多与目标分子相关的荧光分子，如荧光素、藻红素、诺丹明或镧系螯合物，这些很容易被贴到核酸、抗体或微粒上作标签以用于直接或间接地标识目标分子。
记录的信号既可以作为一个二进制信号也可以作为一个吸收值读出。二进制信号作为一个电子计算机数据被快速处理并被适当的软件分析。该软件将把此信息转换成能够分析获得的探测结构并量化目标分子及其不可分割的俘获分子之间的键联。
根据本发明的盘最好包括附加的凹点，凹点最好处于邻近不可分割的俘获分子的凹槽中，它给出关于上述邻近的不可分割的俘获分子的类型、数量和特性的信息。
根据本发明的一个特定实施例，本发明的盘承载一个固定的低聚核苷酸俘获探子，从而能够对相同固体支撑物上(根据本发明的盘的表面)的核苷酸序列进行探测、放大和可能的量化。在另一种执行形式中，盘包括固定的PCR底层，以便得到放大的产物以及放大物在盘外表面上的固定，因而能够对其进行探测(根据Rasmussen等于1991年在Anal.Biochem.198138-205所描述的方法)。
根据本发明的盘用于诊断工具，用于通过关于化学或生物化合物的前期处理能够自动地讲解化学或生物化合物样品制备的诊断和读取装置(如核苷酸序列的基于放大)。
上述装置最好是一种合并多个步骤或分步骤于一个集成系统如自动核酸诊断系统的系统，能够在一种样品中执行提纯核酸序列、进行可能的放大、诊断以及可能的量化的步骤。
以下列非限定性的实例对本发明的优选实施例进行描述。
例1CD上的探测本实验的目的在于通过直接在CD支撑物边界的俘获探子上进行杂交而探测特定的DNA。探测通过比色而实现。俘获探子限制在氨化聚碳酸酯CD上，然后对补足的生物素DNA进行杂交，并用抗生蛋白链菌素-过氧化酶进行正向杂交。
1.聚碳酸酯CD的氨化CD首先通过在室温下1N的NaOH溶液中培育30分钟而羧化。用水冲洗3分钟后，羧化的CD在包含1mg/ml二亚胺碳水溶液和1mM的N-美塞卜朗1-3二胺的0.1M、PH值为6的MES缓冲液中室温下培育2小时。在PH值为6的0.1M的MES缓冲液中冲洗3次并用水冲洗3次后，用37℃的温度对氨化CDs干燥30分钟。
2.俘获探子在氨化CD上的固定制备两种溶液，一种包含CMV俘获探子，另一种包含HIV俘获探子。这些溶液是PH值为7.5的0.01M的MeIM缓冲液，包含浓度为2μg/ml的变性DNA俘获探子(CMV或HIV)和浓度1.6mg/ml的二亚胺碳。
3×20μl的这种溶液标在两个氨化CD上，并在潮湿的环境下在50℃下对这些CD培育5小时。用0.4N的NaOH+0.25％de Tween在50℃下冲洗3次5分钟，这些CD被用水冲洗3次并在37℃下干燥30分钟。
3.在CDs上的CMV生物素DNA的杂交两个CD在0.2N的NaOH中培育5分钟用于对俘获探子变性，然后用PH值7.5的带有0.15M的NaCL的马来酸0.1M冲洗。然后在包含变性的DNA的100μg/ml橙红色精液、SSC 4X、黄蜡煤5X和变性的CMV生物素DNA的浓度为70ng/ml、温度为2小时的杂交溶液中培育2小时。在杂交步骤之后，用包含15mM的NaCl和0.3％的Tween的0.01M的马来酸缓冲液冲洗3次。
然后用包含0.15M的NaCl、0.1％的奶粉和1μg/ml的抗生蛋白链菌素-过氧化酶的0.1M的马来酸在室温下培育45分钟。共轭培育之后，用包含15mM的NaCl和0.3％的Tween的0.01M的马来酸缓冲液在室温下冲洗3次。
4.杂交DNA的探测然后在TMB溶液(Medgenix)中培育第一CD 10分钟。培育后的1分钟后对此CD拍照，观察发生正向杂交的蓝色外观(图4)。可以得到CD透射光的吸收。
例2用微波发射探测器探测CD上的DNADNA俘获探子标注在CD表面上并与目标DNA杂交，与例1一致。为了探测生物素杂交的DNA，用包含0.15mM的NaCl、0.1％的奶粉和1μg/ml的抗生蛋白链菌素-胶态金(Sigma，St-Louis，USA)的0.1M的马来酸缓冲液在室温下培育45分钟。还在由相同体积的溶液A和B制成的溶液中培养CD 30分钟，以便在发射正向杂交的地方有银集尘。因银的特性，用金层还原CD以使得激光CD播放器能够读出写在CD上的信息并读出干扰(图2和图)。
例3通过光吸收探测CD上的蛋白使用的CD中凹点上被局部地印刷了数据，并且这部分用金覆盖。俘获分子的固定在CD的周边、直接在塑料表面进行。
1.CD的羧化第一CDs在1N的NaOH溶液中于室温下培养30分钟然后用水淋洗3次并在37℃时干燥30分钟。
2.在CDs上抗体的固定三种不同类型的抗体固定在羧化的CD上抗牛血清清蛋白的抗体，抗荧光素的抗体(用于负控制)和抗抗生蛋白链菌素的抗体(用于正控制)。
三种不同溶液的20μl的PH为8.2的0.02M的NaCl的硼酸盐缓冲液包含1mg/ml的二亚胺碳(Acros)，并且三种不同抗体的一种类型以10μg/ml在三种不同类型的CD上形成斑点。这些斑点以4℃通宵培养，然后用包含0.1％的酷蛋白0.1M且PH为9.2的甘氨酸缓冲液淋洗10分钟，然后用包含0.1％的非离子活性剂0.1M且PH为9.2的甘氨酸缓冲液淋洗两次5分钟，最后用0.1M且PH为9.2的甘氨酸缓冲液淋洗两次。CDs在30分钟内以37℃干燥。
3.通过ELISA技术在CD上检测抗牛血清清蛋白CDs在室温下用三种固化在表面上的抗体和包含0.1％的酷蛋白以PBS的10μg/ml的血清清蛋白溶液培养。并且培养90分钟。CDs用0.1％的非离子活性剂20淋洗3次，然后用0.1％酷蛋白的抗血清清蛋白的生物素抗体以PBS20μg/ml培养45分钟。然后用包含PBS0.1％的非离子活性剂20淋洗3次，再后CDs在包含PBS0.1％的酷蛋白溶液或1μg/ml的抗生蛋白链菌素-过氧化物酶中培养45分钟。CDs用包含PBS0.1％的非离子活性剂20淋洗3次。为了检测，抗生蛋白链菌素-过氧化物酶被固化的CD处以TMB溶液培养并在2、4和6分钟后用照相机照相以观察在抗BAS和抗抗生蛋白链菌素的抗体斑点处有兰色出现。
试验4用激光探测器探测CD上蛋白质已在试验3中证实清蛋白在CD表面上形成斑点并与抗体反应。成对用于与生物素抗体抗反应的是抗生蛋白链菌素-金。它在包含PBS0.1％的酷蛋白溶液以浓度1μg/ml培养45分钟。抗生蛋白链菌素-金用于银还原的中心。“银增强”(Sigma)在室温下使用15分钟。可在抗BSA和抗抗生蛋白链菌素的抗体斑点处见到银沉淀。由于沉淀和直径大约为1μm沉淀的尺寸，故可观测到光吸收的变化。可发现凹点被激光束反射(图5)。
试验5在CD上磁探测DNA或蛋白质在CD机座上探测混杂DNA或蛋白质可通过磁过程探测。粘合在DNA或抗体上的生物素可认为与铁流质(Immunicon，HungtintonValley，PA，美国)结合的抗生蛋白链菌素。根据铁流质的亚铁原子核大小，此配对为磁性或顺磁的，并且可在磁场中探测到(图7)。
权利要求
1．一种在样品、尤其在生物样品中探测和/或量化目标分子的存在的方法，包括步骤--允许所述目标分子与固定在固体支撑物表面的俘获分子之间的键联，该固定支撑物是一个包括寄存数据的盘，键联导致一个信号，--利用通过俘获分子的分割不能获得上述信号这一附带条件对上述信号进行探测和/或量化。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于俘获分子和目标分子是核苷酸分子。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于俘获分子和目标分子分别是抗原或抗体。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于俘获分子和目标分子分别是受体或受体的配位体。
5．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于通过光束，尤其是激光束或电磁场的变化的反射、吸收或衍射得到信号的探测和/或量化。
6．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于在由光束激发结合的目标分子和俘获之后，通过荧光发射得到信号的探测和/或量化。
7．如前述权利要求1至4的任一权利要求所述的方法，其特征在于通过光束、辐射或磁场的直接发射得到信号的探测和/或量化，其中光束、辐射或磁场的直接发射是目标分子及其俘获分子之间键联的结果。
8．如前述6或7的所述的方法，其特征在于光束的发射通过一个选自包含具有化学、生物、荧光、辐射和/或电致发光或辐射的分子的一个组中选取的键联分子产生。
9．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于目标分子和俘获分子之间的键联在盘表面的一层或多层的侵蚀和/或盘的表面产生集尘，尤其是不透明的或磁性的集尘比如胶态金属试剂的沉积，尤其是银集尘。
10．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于目标分子和不可分割的俘获分子之间的键联能够使得用于信号探测和/或量化的一个或多个分子固定，其中信号导致于所述键联。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于其它的分子是微粒或磁性颗粒。
12．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于当盘在其轴(A)上旋转时获得信号。
13．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于盘上的寄存数据是二进制数据，最好是凹槽二进制数据。
14．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于盘是一种密集盘。
15．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于寄存数据使得能够处理并解释俘获分子和目标分子之间的键联导致的信号。
16．如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于盘包括相连并且处于射流接触的微通道。
17．一种包括寄存数据的盘，其特征在于其还包括固定在其表面的一个不可分割的俘获分子，该分子能够与待探测和/或量化的目标分子键联。
18．如权利要求17所述的盘，其特征在于目标分子和/或不可分割的俘获分子选自包括核酸分子、尤其是核苷酸分子序列、抗原、抗体、受体、受体的配位体、缩氨酸或蛋白分子、脂类、糖类、半抗原、荧光团、色基、催化剂、通过组合化学或其化合获得的新大分子的组。
19．如权利要求17或18所述的盘，其特征在于盘的寄存数据是二进制数据，尤其是凹槽二进制数据。
20．如权利要求17或18所述的盘，其特征在于盘是密集盘。
21．如权利要求17至21任一所述的盘，其特征在于盘包括相连并且处于射流接触的微通道。
22．如权利要求17至21任一所述的盘的制备方法，包括在包含预寄存数据的盘表面上通过光催化所述俘获分子而固定不可分割的俘获分子的步骤。
23．如权利要求22所述的方法，其特征在于通过俘获分子的末端与盘表面层的共价连接而得到不可分割的俘获分子。
24．如权利要求22或23所述的方法，其特征在于盘表面由最好是由有机化合物制成的保护层复原，能够或增进不可分割的俘获分子的保护和稳定，和/或对目标分子及其不可分割的俘获分子之间键联的保护、稳定和/或探测。
25．一种诊断工具，包括根据权利要求17至21任何之一的盘，和能够使得目标分子和俘获分子键联的试剂以及能够探测作为键联结果的信号的试剂。
26．一种探测和/或读取装置，能够探测和/或量化信号，而该信号是样品中出现的目标分子及其俘获分子之间键联的结果，它包括根据权利要求17至21任意一个的盘或根据权利要求25的工具，以及探测和/或量化上述信号的装置。
27．根据权利要求26的探测和/或读取装置，是一种读取密集盘的装置。
28．根据权利要求27的探测和/或读取装置，其特征在于包括用于读取盘上寄存数据的第一读取头和用于探测和/或量化作为目标分子及其俘获分子之间键联结果的信号的第二读取头。
29．根据权利要求26至28任一所述的探测和/或读取装置，包括用于在集成探测和/或读取装置内进行目标分子的提纯、目标分子的具体分割、目标分子的可能的遗传放大的附加装置。
全文摘要
本发明涉及一种通过与固定在包括寄存数据的盘表面上的不可分割的俘获分子键联来检测和/或量化目标分子的方法。本发明还涉及一种其表面上固定有不可分割的俘获分子的盘和该盘的制造方法,以及此盘或包括此盘的诊断和/或读取装置。
文档编号B01J19/00GK1285917SQ98812804
公开日2001年2月28日 申请日期1998年12月24日 优先权日1997年12月30日
发明者乔斯·勒马克勒 申请人:乔斯·勒马克勒