免疫增强剂及其生成方法和生成装置的制作方法

专利名称：免疫增强剂及其生成方法和生成装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞(allogeneictumorcells which is an immunopotentiator containing)增殖的免疫功能的免疫增强剂(immunopotentiator)、该免疫增强剂的生成方法、及该免疫增强剂的生成装置。
背景技术：
为了治疗癌症等恶性肿瘤，开发出多种抗肿瘤药。但是这些肿瘤治疗药，大多数都是以化学物质为有效成分的药物，都伴有程度不同的副作用。
日本专利特开2001-137852号公报中，作为特种肿瘤治疗药，将通过电解含NaOH的水所得到的电解还原水作为有效成分的物质称为“癌抑制剂”。这种癌抑制剂中，利用有隔膜电解生成的碱性水即电解还原水(电解生成的碱性水)中含有高浓度溶解氢具有能防止或修复活性氧引起对DNA的损伤的功能。一般地说，含有高浓度溶解氢的电解还原水是将NaCl稀释液放入有隔膜电解槽的负极侧电解室中进行电解而生成的。
但是，NaCl稀释水溶液在有隔膜电解槽的负极侧电解室中被电解的时候，在该有隔膜电解槽的正极侧电解室里生成含有氯成分的氧化性水(电解生成的酸性水)，这时生成大量的次亚氯酸和氯气溶解于电解还原水中。溶入大量氯成分的电解还原水不适于饮用是毋庸置疑的，考虑到溶解的氯成分有引发癌细胞致癌的作用，为了得到不存在大量含氯的电解还原水，提出了用NaOH水溶液代替NaCl水溶液进行电解的方法。
另外，WO95/14484号再发表的专利公报中，提出了称为“生物体内自由基生成剂”的在由有机或无机离子交换体所组成的载体上载有银离子的物质。因为这种生物体内自由基生成剂的自由基·OH具有破坏癌细胞的作用。从这点看，能够连续生成·OH的试剂是非常有利的，该生物体内自由基生成剂以银离子使水基分解生成·OH为前提，载有银离子的离子交换体长时间连续生成·OH，因此将载有银离子的离子交换体作为特定的生物体内自由基生成剂。

发明内容
近年来，本发明者等对引起注目的具有特殊功能的物质进行了深入研究，结果发现含有银成分的电解生成的碱性水及电解生成的酸性水虽然没有直接攻击癌细胞的功能，但有提高对特定肿瘤的免疫功能的作用。本发明基于上述知识，其目的在于提供以含有特定成分的电解生成水为有效成分的免疫增强剂、该免疫增强剂的生成方法、和该免疫增强剂的生成装置。
根据本发明，为达到上述目的，提出了用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂，其特征在于以通过含有银成分的水电解所生成的弱碱性电解水为有效成分。在该免疫增强剂中，希望上述弱碱性电解水的氢离子浓度以pH9为基准处于pH8.0～10.0的范围内，银成分以离子的状态存在，所换算成的银离子浓度以100ppb为基准处于30ppb～200ppb的范围内。另外，希望上述弱碱性电解水的氧化还原电位以+200mV为基准，规定在+400mV～+800mV的范围内。
另外，为达到上述目的，提出了以通过含有银成分的水电解所生成的弱酸性电解水为有效成分的免疫增强剂。在该免疫增强剂中，希望上述弱酸性电解水的氢离子浓度以pH6为基准处于pH5.0～7.0的范围内，银成分以离子的状态存在，所换算成的银离子浓度以100ppb为基准处于30ppb～200ppb的范围内。另外，希望上述弱酸性电解水的氧化还原电位以+400mV为基准，处于+200mV～+800mV的范围内。
如上所述的本发明免疫增强剂已被证明虽然没有直接攻击癌细胞等肿瘤的作用，没有抗癌剂的功能，但对于作为小鼠肿瘤的Sarcoma180(S-180)具有抑制肿瘤增殖的作用，对于同样是小鼠肿瘤的Meth-A却没有抑制肿瘤增殖的作用。该效果(抗肿瘤作用)是因为S-180为抗原性高的同种异系肿瘤，Meth-A是一体肿瘤，因此可以预测有免疫系统介入。另外，根据该结果，研究了脾淋巴细胞的活化反应，所得结果证明，表示natural killer活性的细胞表面标记物CD233的发现比例和细胞损坏性、表示T细胞活性的CD3e的发现比例在肿瘤抑制组中有显著的增加。这些结果表明，由于投药了本发明中特定的含银成分的电解生成碱性水或电解生成酸性水，在肿瘤抑制组中显示出细胞性免疫功能亢进，发挥了抗肿瘤作用。
根据上述事项，虽然本发明特定的含银成分的电解生成碱性水或者电解生成酸性水的作用机制还不能得到确定，但对于同种异系肿瘤细胞可以作为提高抗肿瘤免疫力的药剂，换言之，可以作为增强免疫功能的免疫增强剂。
本发明的免疫增强剂是通过将含银成分的水在有隔膜电解槽的负极侧电解室里电解，生成以含银成分的弱碱性电解水作为有效成分的免疫增强剂。或者是，通过将含银成分的水在无隔膜电解槽的负极侧电解，生成以含银成分的弱碱性电解水作为有效成分的免疫增强剂。另外，本发明的免疫增强剂也可以是通过将含银成分的水在有隔膜电解槽的正极侧电解室或无隔膜电解槽的负极侧电解，生成以含有银成分的弱酸性电解水作为有效成分的免疫增强剂。
另外，本发明的免疫增强剂是通过将银粉末溶解于水以调整银成分的水溶液在有隔膜电解槽或无隔膜电解槽的负极侧电解室里电解，生成以含银成分的弱碱性电解水作为有效成分的免疫增强剂。
另外，根据本发明，提供了免疫增强剂生成装置，该生成装置具有配备有处理自来水、自然水等清水的软水器和净水器的水处理机构、以银电极为正极侧电极并安装在内部从而用来电解上述水处理机构处理过的处理水的无隔膜电解槽、和使在该无隔膜电解槽中电解生成的电解水进行电解的有隔膜电解槽，从上述有隔膜电解槽的正极侧电解室引出含有银成分的弱酸电解性水，从该有隔膜电解槽的负极侧电解室引出含有银成分的弱碱性电解水，上述弱酸性电解水或弱碱性电解水可以用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂。
另外，根据本发明，提供了免疫增强剂生成装置，该生成装置具有配备有处理自来水、自然水等清水的软水器和净水器的水处理机构、以银电极为正极侧电极并安装在内部从而用来电解上述水处理机构处理过的处理水的第1无隔膜电解槽、和使该无隔膜电解层中电解生成的电解水进行电解的第2无隔膜电解槽，从上述第2无隔膜电解槽的正极侧电解室引出含有银成分的弱酸电解性水，从该第2无隔膜电解槽的负极侧电解室引出含有银成分的弱碱性电解水，上述弱酸性电解水或弱碱性电解水可以用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂。


表示有关本发明免疫增强剂生成装置的全体结构的概略构成图。
表示移植S-180肿瘤的增殖随时间变化(推测重量)的示意图。
表示移植S-180肿瘤的增殖(实际重量)的示意图。
表示移植Meth-A肿瘤的增殖随时间变化(推测重量)的示意图。
表示移植Meth-A肿瘤的增殖(实际重量)的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、PSK、Ag0试剂)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag40试剂)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag70试剂)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag150试剂)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、PSK、Ag0试剂)对移植Meth-A肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag40试剂)对移植Meth-A肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag70试剂)对移植Meth-A肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示各种试剂(蒸馏水、Ag150试剂)对移植Meth-A肿瘤增殖抑制效果随时间变化的示意图。
表示FACS(flow cytometory)解析各投药组结果的示意图。
表示各种试药(第7天)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
表示各种试药(第10天)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
表示各种试药(第14天)对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
表示生成方法不同的各种试药对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
表示投药时间不同的各种试药对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
表示银浓度不同的各种试药对移植S-180肿瘤增殖抑制效果的示意图。
具体实施例方式
有关本发明中的免疫增强剂是可提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂，其第一免疫增强剂是将含有银成分的电解生成的弱碱性水作为有效成分。具体地说，这种免疫增强剂的电解生成碱性水的pH值范围是pH8.0～pH10.0，氧化还原电位的范围是+400mV～-800mV，而且银成分用银离子换算，其浓度范围是30ppb～200ppb。
有关本发明中的第二免疫增强剂是将含有银成分的电解生成的酸性水作为有效成分。具体地说，这种免疫增强剂电解生成酸性水的pH范围是pH5.0～pH7.0，氧化还原电位的范围是+200mV～+800mV，银成分用银离子换算，其浓度范围是30ppb～200ppb。
这些免疫增强剂没有直接攻击癌等肿瘤的作用，也没有抗癌剂的功能。但已经确认对于作为小鼠肿瘤的Sarcoma180(S-180)具有抑制肿瘤增殖的作用，而对于同是小鼠肿瘤的Meth-A则没有抑制肿瘤增殖的作用。由于小鼠肿瘤Sarcoma180(S-180)是抗原性很高的同种异系肿瘤，而同样是小鼠肿瘤Meth-A是同系肿瘤，因此这个结果(抗肿瘤作用)暗示有免疫系统介入。
还有，根据这个结果，研究脾淋巴细胞的活化反应所得的结果证明，表示(natural killer)活性的细胞表面标记物CD233的发现比例和细胞损坏性、在T淋巴细胞中表示T细胞活性的CD3e的发现比例，在肿瘤抑制组中有显著的增加。这些结果表明，由于投药了本发明中特定的含银成分的电解生成碱性水或电解生成酸性水，在肿瘤抑制组中显示出细胞性免疫功能亢进，发挥了抗肿瘤作用。
以上结果表明，本发明特定的含银成分的电解生成碱性水或者是电解生成酸性水，虽然其作用机制还不能得到确定，但对于抗原性高、获得性免疫功能高的同种异系肿瘤细胞是提高抗肿瘤免疫力的试剂，换言之，就是增强免疫功能的免疫增强剂。含有银成分的量越多，该增强免疫功能的免疫增强剂的作用越大。在一个试验范围(银成分含量0～150ppb的范围)，银成分含量为150ppb时，显示出最大的免疫增强作用。
上述免疫增强剂可以通过将自来水、天然水等一般水经软水和净水处理后的处理水作为被电解水经过无隔膜电解、和将该无隔膜电解所生成的电解水再经过有隔膜电解或者是无隔膜电解来简单地生成。另外，作为上述使用有隔膜电解槽生成免疫增强剂的方法，可以采用如图1所示的免疫增强剂的生成装置来进行。图1是该免疫增强剂的生成装置的全体结构的概略表示图，配备有水处理机构10、无隔膜电解槽20及有隔膜电解槽30。
构成该免疫增强剂生成装置的水处理机构10配备有软水器11、净水器12及储留槽13。软水器11内藏有阳离子交换树脂，净水器12内藏有高精度过滤功能的过滤器。软水器11通过给水管路11a连接自来水的供给源，通过给水管路11b连接净水器12。另外，净水器12通过给水管路12a连接储留槽13。储留槽13通过给水管路13a连接无隔膜电解槽20的电解室R。储留槽13配备有环流管路13b、溢流管路13c及图中没有显示的水位传感器。溢流管路13c与排水管路13d连结、且给水管路13c的途中通过排水阀13e连接排水管路13d。另外，给水管路13a的途中装备了给水泵14。
当该水处理机构10的两个功能是，利用软水器11及净水器12处理后的自来水在储留槽13内按所设定量进行储留的功能，换言之就是生成被电解水的功能，及将储留在储留槽13里的处理水作为被电解水供给无隔膜电解槽20的电解室R的功能。在该水处理机构10中，储留槽13储留的处理水由水泵14驱动，作为被电解水供给无隔膜电解槽的电解室R。
无隔膜电解槽20由在圆筒状槽主体21内配置的正极电极22和负极电极23组成。正极电极22是银制棒状，位于槽主体21的中央。负极电极23是SUS304等构成的圆筒状，以正极电极22为中心，位于其外周侧。因此，槽主体内形成电解室R。槽主体21的下方侧连接着储留槽13具有的给水管13a。另外，槽主体21具有连接电解室R的流出管路21a。流出管路21a在其分支管路与后述有隔膜电解槽30的各电解室R1、R2连接。
在无隔膜电解槽20中，从控制系统40具有的电源向正极电极22与负极电极23之间施加电压，开始进行电解运行。在进行电解中，由于给水泵14的驱动，储留槽13里的处理水作为被电解成水，供给电解室R内。被电解水在电解室R通过所设定的电解电流被电解成为电解生成水。电解生成水经流出管路21a，供给到后述的有隔膜电解槽30的各电解室。电解电流值被图中没有表示的电流计检出，并被输入到控制机构40具有的微电脑，从而将电流控制在预先设定的电解电流值。这样，在进行电解时，正电极22和负电极23之间的电解电流值可维持在规定范围内。在该无隔膜电解槽30中，电解电流可以控制在0～3mA范围内。
有隔膜电解槽30为在呈方形的箱状槽主体31内，由可透过离子的隔膜32分隔而成，所以在各个分隔室里配备电极33a、33b，形成一对电解室R1、R2。各电极33a、33b均为在表面镀Pt的Ti板，隔膜32被夹在电极33a、33b中间，使电极33a、33b在隔膜两侧相对而立。槽主体31的下方连接着具有无隔膜电解槽20的流出管路21a的分支管路。无隔膜电解槽20里生成的水作为被电解水，能供给到电解室R1、R2。另外，槽主体31配有和电解室R1、R2连通的一对流出管31a、31b，在两流出管路31a、31b的途中安装有切换阀门34。
在该有隔膜电解槽30中，从控制系统40具有的电源向往各电极33a、33b施加电压，开始进行电解，无隔膜电解槽20的电解运转连动进行。在该有隔膜电解槽30的电解运转的途中，施加在电极30a、30b的电压极性每经过规定时间，进行正负反转，且随着电压极性的反转，切换阀门34进行切换操作，从而两流出管路31a、31b对两电解室R1、R2连接状态也发生交替转换。各电极33a、33b极性的反转以及切换阀门34的切换操作均通过控制系统40具有的微电脑进行控制，同时两电极33a、33b之间的电解电流值通过图中未表示的电流计检出，并被控制在微电脑所设定的电解电流值。这样，进行电解时，两电极33a、33b之间的电解电流值维持在规定范围内。在该有隔膜电解槽30中，电解电流可以控制在0～3A范围内。
这样，在该有隔膜电解槽30中，各电极33a和33b的极性定期反转，各电解室R1、R2的正极及负极也定期反转。其目的是为了消除电解时由于正极侧电解室产生的电解生成酸性水的气氛中容易发生的水锈附着，即使在正极侧电解室水锈发生并附着，通过将该正极侧电解室反转成负极侧电解室，通过产生碱性水的气氛可以使水锈流出除去。
因此，在该有隔膜电解槽30中，进行电解时，各电解室R1、R2定期进行正极侧及负极侧反转，在一侧电解室R1，作为正极侧电解室时，生成电解酸性水，同时，作为负极侧电解室R2时，生成电解碱性水。而且，在另一侧电解室R2，作为负极侧电解室时，生成电解碱性水，同时，作为正极侧电解室时，生成电解酸性水。随着各电解室R1，R2的正极侧及负极侧的反转，与此对应，切换阀门34进行切换操作。流出管路31a、31b连接各电解室R1，R2的反转侧，确保流出管路31a、31b中的一方作为电解生成酸性水的专用流出管路、且流出管路31a、31b中的另一方作为电解生成碱性水的专用流出管路。在该有隔膜电解槽30的负极侧电解室生成的电解生成碱性水(含有银成分)相当于本发明的第一免疫增强剂，且正极侧电解室生成的电解生成酸性水相当于本发明的第二免疫增强剂。
在该免疫增强剂生成装置中，水处理装置10可任意运行，储留槽13里常时储留定量的处理水，当无隔膜电解槽20和有隔膜电解槽30进行同步电解时，通过供给泵14的驱动，储留槽13内的处理水作为电解水供给到无隔膜电解槽20的电解室R。另外，储留槽13内的处理水减量到设定量时，图中未表示的水位检测传感器检测出这种情况，将检测信号输入到控制机构40的微电脑。微电脑根据该检测出信号开启给水阀11C，将处理水补充到储留槽13内，直到达到规定量为止。
当利用无隔膜电解20和有隔膜电解槽30进行同步电解时，在无隔膜电解槽20的正极电极22与负极电极23之间施加30mA以下的规定的电解电流，且在有隔膜电解槽30的两电极33a、33b之间施加3A以下的规定的电解电流。在利用无隔膜电解槽进行无隔膜电解时，通过供给到电解室R的被电解水的处理水的电解，从正极电极22侧洗脱银离子，生成含有银离子或者其他形态的银成分的电解生成水，即产生含有银成分的大致中性的电解生成水。所生成的该电解生成水作为被电解水，供给到有隔膜电解槽30的两电解室R1、R2。
在利用有隔膜电解槽进行有隔膜电解时，在一侧的电解室R1为正极侧电解室的情况下，生成电解生成酸性水，同时，在为负极侧电解室的情况下，生成电解生成碱性水。还有。在另一侧电解室R2为负极侧电解室的情况下，生成电解生成碱性水，同时，在为正极侧电解室的情况下，生成电解生成酸性水。由该有隔膜电解生成的电解生成酸性水通过例如作为专用的流出管路的流出管路31a，流到规定的场所，电解生成碱性水通过例如作为专用的流出管路的流出管路31b，流到规定的场所。
该电解生成碱性水是含有规定量的银成分的电解生成碱性水，相当于本发明的第一免疫增强剂。该电解生成酸性水是含有规定量的银成分的电解生成酸性水，相当于本发明的第二免疫增强剂。
在该生成装置中，免疫增强剂含有的银成分的量可由无隔膜电解的电解条件来控制。例如，通过控制电解电流值或电解时间，可以将银离子浓度调节在0～200ppb范围内的任意浓度。另外，可以通过控制有隔膜电解的电解条件来控制免疫增强剂的pH等特性。例如，通过控制电解电流值或电解时间，可以将电解生成碱性水的pH设为pH7.0～11.0范围内的任意值，还可以将电解生成酸性水的pH设定为pH3.0～7.0范围内的任意值。
另外，该生成装置中，从无隔膜电解槽20出发的流出管路21a可以选择性地与有隔膜电解槽30的电解室R1、R2连通，从而使在无隔膜电解槽20生成的电解生成水可以选择性地供给到电解室R1、R2中被选择的一方，并对非选择的另一方的电解室供给单纯的水。通过该电解，可以在被选择的电解室生成免疫增强剂。例如，被选择的电解室为负极侧电解室时，生成电解生成碱性水是第一免疫增强剂，另外，被选择的电解室为正极侧电解室时，生成电解生成酸性水是第二免疫增强剂。
第1实施例本实施例中，采用在该免疫增强剂的生成装置中生成的电解生成碱性水，对不同浓度的银成分的电解生成碱性水(供试药)，为确证其肿瘤细胞增殖的阻害作用、和对移植肿瘤的抗肿瘤作用，进行了下述的2个体内试验(in vitro)。
(1)试验1对各种肿瘤细胞的作用本试验中，作为供试材料，采用了社团法人北里研究所的研究室里培养传代保存下来的各种小鼠和人的癌细胞。另外，作为供试药，采用了该免疫增强剂生成装置中每次生成的4种电解生成碱性水(供试药1～4)。供试药1是pH9.3、银成分浓度50ppb的电解生成碱性水、供试药2是pH9.3、银成分浓度25ppb的电解生成碱性水、供试药3是pH9.3、银成分浓度12.5ppb的电解碱性水、供试药4是pH9.3、银成分6.25ppb的电解生成碱性水。
供试材料中，对于小鼠黑色素瘤细胞株(B16/BL6)、肉瘤细胞株(S-180)小鼠淋巴瘤细胞株(P388)、纤维肉瘤细胞株(L929)、人神经母细胞瘤细胞株(NB-1)、人子宫颈癌细胞株(HeLa)、人纤维母细胞株(WI-38细胞)，利用含10％牛胎儿血清(Fetal Bovine SerumFBS)的Minimum Eagle’smedium(MEM)培养基进行培养传代。将这些细胞调制成3～5×104cell/mL，在有96穴的培养皿中每个穴加入0.1mL的细胞调制液。在它们中间添加目的用量的供试药，再添加MEM培养基，使其总量达到0.2mL，在5％的CO2存在下，在37℃中培养72小时。细胞生存率利用MTT法(Carmichaei，J.，et al.Cancer Res.Vol.47，p936-942，1987)的比色常数来测定。
供试材料中，对于小鼠肉瘤细胞株(Meth-A)、小鼠肺癌株(LCC)、人胃癌株(KATO-III)、人髓性白血病细胞株(HL-60)、人组织细胞性淋巴瘤细胞株(U-937)、人前列腺癌株(LNCaP)、小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y-ML)、人淋巴母细胞性白血病细胞株(Jurkat)，以含10％FBS的(RPMI-1640)培养基进行培养传代。将这些细胞调制成5×104cell/mL，在有96穴的培养皿中每个穴加入0.1mL的细胞调制液。在其中添加一定量的供试药，再加入(RPMI-1640)培养基，使其总量达到0.2mL。在5％CO2存在下，在37℃中培养72小时。细胞生存率利用MTT法的比色常数来测定。
供试材料中，对于小鼠髓母细胞样白血病细胞株(ML)、人肝癌株(HepG2)、人口腔上皮样癌株(KB细胞)，利用含有10％FBS的DMEM(Dulbeccs Modijed EM)培养基进行培养传代。将这些细胞调制成5×104cell/mL，在有96穴的培养皿中每个穴加入0.1mL的细胞调制液。在其中添加一定量的供试药，再加入DMEM培养基，使其总量达到0.2mL。在5％CO2存在下，在37℃中培养72小时。细胞生存率利用MTT法的比色常数来测定。该试验结果如表1(小鼠来源癌细胞的细胞生存率)和表2(人来源癌细胞的细胞生存率)所示。
小鼠来源癌细胞的细胞生成率(MTT法的比色常数)

其中供试药1pH9.3、银成分浓度50ppb的电解生成碱性水供试药2pH9.3、银成分浓度25ppb的电解生成碱性水供试药3pH9.3、银成分浓度12.5ppb的电解碱性水供试药4pH9.3、银成分6.25ppb的电解生成碱性水 人来源癌细胞的细胞生成率(MTT法的比色常数)

其中供试药1pH9.3、银成分浓度50ppb的电解生成碱性水供试药2pH9.3、银成分浓度25ppb的电解生成碱性水供试药3pH9.3、银成分浓度12.5ppb的电解碱性水供试药4pH9.3、银成分6.25ppb的电解生成碱性水(2)试验2对小鼠的抗肿瘤作用本试验中，作为供试验动物采用了5周龄雌性ddY系小鼠(自日本SLC购入)、5周龄雌性BALB/c系小鼠(自日本SLC购入)。在ddY系小鼠中，向其腹侧皮内移植1×106个S-180细胞。在BALB/c系小鼠中，向其内腹侧皮内移植Meth-A细胞。以移植日为day0，从day0至day15(移植日至15日)内，使小鼠能够以自由经口摄取的方式投放供试药。在这期间，定期从外部测定肿瘤的大小(长径和短径)。同时还测体重。在day15，将小鼠放血致死，摘除肿瘤测定重量。
在该试验中，作为供试药，采用了银成分为70ppb浓度、pH9.2的电解生成碱性水。另外，该试验中作为阴性对照组用蒸馏水替代试剂，阳性对照组用云芝多糖(Krestinクレスチン)即免疫疗法抗癌药(PSK，阳性对照三共株式会社制)替代供试药。另外，对于动物组，小鼠在经过购入后一周的预备饲养后供试验用。饲养时，将5只小鼠放入polycarbonate(ポリカ一ボネ一ト)制的笼子(32×231×13cm)内，在室温23±0.5℃、湿度55±5％的环境下进行饲养。照明时间为上午8时至于下午8时的12小时，水、食物处于能够自由摄取的状态。
定期测定肿瘤的大小(长径和短径)和体重，以确认癌的增殖度。肿瘤大小(长径和短径)的测定使用角尺，利用长径(mm)×短径(mm)2/2计算肿瘤的大小(肿瘤推定重量)。另外，利用unpaired t检验进行统计处理。另外，供试药投药终止后的肿瘤大小则通过直接测定摘除的肿瘤重量来获得。这些结果中，S-180细胞的结果通过表3(移植S-180的增殖抑制效果推定重量和实际重量)、图2的曲线(移植S-180的增殖随时间的变化推定重量)、图3的曲线(移植S-180的增殖的实际重量)来表示。另外，另外，Meth-A的结果通过表4(移植的增殖抑制效果推定重量和实际重量)、图4的曲线(移植Meth-A的增殖随时间的变化推定重量)、图5的曲线(移植Meth-A的增殖的实际重量)来表示。
移植S-180肿瘤的增殖抑制效果

供试药pH9.2、银成分浓度70ppb的电解生成碱性水蒸馏水对照云芝多糖(PSK)阳性对照重量(平均值±标准偏差)mg(n＝7)[表4]移植Meth-A肿瘤的增殖抑制效果

供试药pH9.2、银成分浓度70ppb的电解生成碱性水蒸馏水对照云芝多糖(PSK)阳性对照重量(平均值±标准偏差)mg(n＝7)(3)考察研究了含有银成分的电解生成碱性水对于小鼠和人的各种来源癌细胞株的细胞增殖的作用。结果发现，对于增殖抑制感应性高的P338小鼠淋巴瘤株，在培养基pH为浓度界限的50％(添加供试药)的情况下，也只能观察到10％的增殖抑制。对于其它的细胞株，则无法确认增殖抑制效果，所以，此结果暗示含有银成分的电解生成碱性水对于细胞没有直接的细胞膜障碍DNA/RNA的切断、复制阻碍、选择性的情报转达阻碍的作用等。
研究了含有银成分的电解生成碱性水对于移植入小鼠的肿瘤细胞的抗肿瘤作用。结果表明，移入皮内的S-180细胞的增殖与阳性对照的云芝多糖(PSK)投药情况相比，具有相同程度的有效(P＞0.05)抑制的结果，从而得出没有抑制移植入皮内的Meth-A细胞的增殖的结论。S-180是抗原性高的同种异系的癌。与此相对，Meth-A则是抗原性低的同系的癌。PSK是具有免疫增强作用的制癌剂，因此可以说对于Meth-A的增殖抑制作用低。而且由于含有银成分的电解生成碱性水的增殖抑制作用与PSK的规格相似，因此可以认为含有银成分的电解生成碱性水的增殖抑制作用是经由免疫系统而起作用的。
第2实施例本实施例中，采用在该免疫增强剂的生成装置中生成的电解生成碱性水，对不同浓度的银成分的电解生成碱性水(供试药)，为确证小鼠移植肿瘤(S-180、Meth-A)的抗肿瘤作用，进行了下述的2个试验(in vitro)。本实施例中采用的肿瘤是在社团法人北里研究所的研究室培养传代、保存的S-180肿瘤、Meth-A肿瘤。另外，供试药采用该免疫增强剂生成装置所生成的不同银成分浓度的电解生成碱性水(供试药1～4)。蒸馏水作为阴性对照，作为阳性对照采用云芝多糖pSK(阳性对照三共株式会社制)。供试药1是pH9.5、银离子浓度0ppb的电解生成碱性水(称为Ag0试剂)。供试药2是pH9.5、银离子浓度40ppb的电解生成碱性水(称为Ag40试剂)。供试药3是pH9.5、银离子浓度70ppb的电解碱性水(称为Ag70试剂)。供试药4是pH9.5、银离子150ppb的电解生成碱性水(称为Ag150试剂)。各供试药为连日生成。另外，供试验用小鼠是各投药试剂每6只为1组。
(1)试验1对S-180的作用试验用小鼠采用的5周龄雌性ddY系小鼠(自日本SLC购入)。向ddY系小鼠腹侧皮内植入0.5×106个S-180细胞，移植日作为day0，以从day0到day24之间(从移植日至24日)为基准，将供试药、蒸馏水以及PSK对小鼠进行自由经口摄取的投药。对于PSK，利用经口用器进行强制经口投药。在经口投药时，从day0到day24之间(同日投药组)之外，还进行了从移植日前一周到day24之间(前投药组)、和从移植日的一周后到day24之间(后投药组)之间的投药。
在这些投药期间，从外部定期测定肿瘤的大小(长径和短径)，同时测定体重。另外，在day24，将小鼠放血致死，摘除肿瘤测定重量。另外，试验用小鼠在购入后进行一周时间的预备饲养。饲养时，将6只小鼠放入polycarbonate制的笼子(32×231×13cm)内，在室温23±0.5℃、湿度55±5％的环境下进行饲养。照明时间为上午8时至于下午8时的12小时，水、食物处于能够自由摄取的状态。
定期测定肿瘤的大小(长径和短径)和体重，以确认癌的增殖度。肿瘤大小(长径和短径)的测定时使用角尺，利用公式长径(mm)×短径(mm)2/2计算肿瘤的大小(肿瘤推定重量)。另外，利用unpaired t检验进行统计处理。另外，供试药投药终止后的肿瘤大小则通过直接测定摘除的肿瘤重量来获得。这些结果通过表5(移植S-180的增殖抑制效果推定重量和实际重量)、图6～图9的曲线(移植S-180的增殖随时间的变化推定重量)来表示。

移植S-180肿瘤的增殖抑制效果

蒸馏水对照云芝多糖(PSK)阳性对照供试药1Ag0试剂(pH9.5、银成分0ppb的电解生成碱性水)供试药2Ag40试剂(pH9.5、银成分40ppb的电解生成碱性水)供试药3Ag70试剂(pH9.5、银成分70ppb的电解生成碱性水)供试药4Ag150试剂(pH9.5、银成分150ppb的电解生成碱性水)推定重量(平均值±标准偏差)mg(n＝6)(2)试验2对于Meth-A的作用。
试验用小鼠采用的5周龄雌性MALB/c系小鼠(自日本SLC购入)。向MALB/c小鼠腹侧皮内植入Meth-A肿瘤，移植日作为day0，以从day0到day24之间(从移植日至24日)为基准，将供试药、蒸馏水以及PSK对小鼠进行自由经口摄取的投药。对于PSK，利用经口用器进行强制经口投药。在经口投药时，从day0到day24之间(同日投药组)之外，还进行了从移植日前一周到day24之间(前投药组)、和从移植日的一周后到day24之间(后投药组)之间的投药。
在这些投药期间，定期从外部测定肿瘤的大小(长径和短径)，同时测定体重。另外，在day24，将小鼠放血致死，摘除肿瘤测定重量。另外，试验用小鼠在购入后进行一周时间的预备饲养。饲养条件与ddY系小鼠相同。
定期测定肿瘤的大小(长径和短径)和体重，以确认癌的增殖度。肿瘤大小(长径和短径)的测定时利用角尺，利用公式长径(mm)×短径(mm)2/2计算肿瘤的大小(肿瘤推定重量)。另外，利用unpaired t检验进行统计处理。另外，供试药投药终止后的肿瘤大小则通过直接测定摘除的肿瘤重量来获得。这些结果通过图10～图13的曲线(移植Meth-A的增殖随时间的变化推定重量)来表示。
(3)考察关于S-180的增殖抑制效果，在蒸馏水组中，S-180肿瘤随着时间增加。在PSK前投药组以及Ag0试剂同日投药组，S-180肿瘤随着时间增加的趋势呈现受若干抑制倾向(图6参照)。在Ag40试剂前投药组以及Ag40试剂同日投药组，移植10日后，确认了有效的肿瘤增殖抑制(参照图7)。在Ag70试剂投药组，Ag70试剂前投药组和Ag70试剂后投药组均在移植17日后确认了有效的肿瘤增殖抑制(参照图8)。但是，在Ag70试剂同日投药组，由于存在抑制肿瘤增殖受到抑制和没有受到移植两种情况，因此平均值上升，在unpaired t检验中无法确认有效差。在Ag150试剂投药组，Ag150试剂前投药组、Ag150试剂同日投药组以及Ag150试剂后投药组均从移植10日后确认了有效的肿瘤增殖抑制(图9参照)。
表5表示以上试剂投药结束后S-180肿瘤的推定重量和实际重量。该结果证实各试剂对上述S-180肿瘤增殖抑制具有抑制效果。
另外，在观察移植入了S-180肿瘤的小鼠的饮水量和体重变化时，Ag0试剂、Ag40试剂、Ag70试剂、Ag150试剂之间虽然没有有效差，但是与蒸馏水相比，确认多量饮水。另外，对于投药了Ag0试剂、Ag40试剂、Ag70试剂、Ag150试剂的小鼠，体重均发生增加，没有发现由于体毒性引起的体重减少。
关于meth-A肿瘤的增殖抑制效果，在蒸馏水组(对照组)和PSK的各投药组，Meth-A肿瘤随着时间增加，在这些之间没有确认有效差。另外，在Ag0试剂、Ag40试剂、Ag70试剂、Ag150试剂的各投药组，Meth-A肿瘤同样随着时间增加，在这些之间没有确认有效差(参照图10～图13)。
第3实施例本实施例中，通过试验确认在该免疫增强剂的生成装置中生成的不同银成分浓度的电解生成碱性水、蒸馏水(对照)和PSK(阳性对照)对T淋巴细胞的作用。
本试验中，从投入各试剂的小鼠(day24)中摘除的脾脏在显微镜的载玻片上压平，调制成细胞悬浮液，将其重叠到(Lympholite-M)，在20℃以2000rpm的速率进行20分钟离心分离，获得T细胞。所得T细胞在MEM培养基中悬浮，调制成1×106细胞/ML/well，作为抗原，加入50μL的(S-180)膜区分，在5％CO2存在的条件下，在37℃进行24小时的培养。培养结束后，与FITC标示CD3e抗体、PE标示CD233抗体进行反应。洗净后，在FACS(flow cytometory)测定淋巴细胞的活化。另外，对于表示细胞障碍性的CD3e抗原的发现和表示NK(natural killer)活性的CD233抗原的发现，从第2实施例的结果中，抽出表示各试剂的投药组中的肿瘤增殖和抑制的典型例的个体，脾脏T淋巴细胞的CD发现利用FACS分析。所获结果如表6(对于淋巴细胞的活化作用)所示。图14表示获得的FACS分析结果。
对于淋巴细胞的活化性作用

UL活化natural killer细胞CD233(+)UR活化natural killer细胞CD233(+)和活化障碍性T细胞CD3e(+)LL不活化淋巴细胞LR活化障碍性T细胞CD3e(+)云芝多糖(PSK)阳性对照供试药1Ag0试剂(pH9.5、银成分0ppb的电解生成碱性水)供试药4Ag150试剂(pH9.5、银成分150ppb的电解生成碱性水)在图14中，UR区域表示活化natural killer细胞和活化障碍性T细胞(CD233(+)、CD3e(+))，UL区域表示活化natural killer细胞(CD233(+))，LR区域表示活化障碍性T细胞(CD3e(+))，LL区域表示不活化淋巴细胞。从所获得的结果可知，在没有确认肿瘤增殖抑制的对照组和Ag0试剂投药组，CD3e(-)和CD233(-)的不活化T淋巴细胞均占65～75％。另外，在表示肿瘤增殖抑制的云芝多糖(PSK阳性对照)投药组和Ag150试剂投药组，CD233(+)和CD3e(+)的活化T淋巴细胞的比例为13～23％，比非抑制组上升了大约3倍。
该结果表示通过Ag150试剂的投药，细胞性免疫被增强。另外，从该结果中表示natural killer活性的CD233(+)、表示细胞障碍性T细胞活性的CD3e(+)的T淋巴细胞的比例的增加的现象，说明利用Asg40～Ag150试剂(含有银成分的电解生成碱性水)后，细胞性免疫亢进，发挥了抗肿瘤作用。
第4实施例本实施例中，采用无隔膜电解(银电极)-有隔膜电解(本发明的生成装置)中生成的不同银成分浓度的电解生成碱性水(A组供试药)和电解生成酸性水(B组供试药)、有隔膜电解-无隔膜电解(银电极)中生成的不同银成分浓度的电解生成碱性水(C组供试药)、无隔膜电解(银电极)中生成的电解生成水(D组供试药)、将银粉末添加到水中并充分搅拌调制成的银水溶液(E组供试药)，对小鼠移植肿瘤(S-180)的抗肿瘤作用，进行了体内试验(in vitro)。
(1)试验作为试验动物，采用5周龄雌性ddY系小鼠(自日本SLC购入)。向ddY系小鼠腹侧皮内植入1×106个S-180细胞，移植日作为day0，以从day0到day14之间(从移植日至14日)为基准，使小鼠进行自由经口摄取供试药。在这期间，从外部定期测定肿瘤的大小(长径和短径)，同时测定体重。另外，在day14，将小鼠放血致死，摘除肿瘤测定重量。
本试验中，作为供试药，采用下述表7所示的各供试药A组(A1、A2)、供试药B组(B1、B2、B3)、供试药C组(C1、C2)、供试药D组(D1、D2)和供试药E组(E1、E2)。另外，该试验中作为对照组用蒸馏水替代供试药。对于动物组，小鼠在购入后进行一周时间的预备饲养。饲养时，将5只小鼠放入polycarbonate制的笼子(32×231×13cm)内，在室温23±0.5℃、湿度55±5％的环境下进行饲养。照明时间为上午8时至于下午8时的12小时，水、食物处于能够自由摄取的状态。
供试药

AgEac(无-有)含有银的电解生成酸性水(无隔膜电解-有隔膜电解)AgEal(无-有)含有银的电解生成碱性水(无隔膜电解-有隔膜电解)AgEal(有-无)含有银的电解生成碱性水(有隔膜电解-无隔膜电解)Agion(无)含有银的电解生成水(无隔膜电解)Agaq银水溶液(在水中添加溶解银粉末)(2)结果本试验中，定期测定肿瘤的大小(长径和短径)和体重，以确认癌的增殖度。肿瘤大小(长径和短径)的测定时利用角尺(ノギス)，利用公式长径(mm)×短径(mm)2/2式计算肿瘤的大小(肿瘤推定重量)。另外，利用unpaired t检验进行统计处理。另外，供试药投药终止后的肿瘤大小则通过直接测定摘除的肿瘤重量来获得。表8表示供试药A组的结果。表9表示供试药B组的结果。表10表示供试药C组的结果。表11表示供试药D组的结果。表12表示供试药E组的结果。
移植S-180肿瘤的增殖抑制效果(A组)

载置癌移植有S-180细胞的物质非载置癌没有移植S-180细胞的物质偏差值n＝8 移植S-180肿瘤的增殖抑制效果(B组)

载置癌移植有S-180细胞的物质非载置癌没有移植S-180细胞的物质偏差值n＝8 移植S-180肿瘤的增殖抑制效果(C组)

载置癌移植有S-180细胞的物质非载置癌没有移植S-180细胞的物质偏差值n＝8 移植S-180肿瘤的增殖抑制效果(D组)

载置癌移植有S-180细胞的物质非载置癌没有移植S-180细胞的物质偏差值n＝8 移植S-180肿瘤的增殖抑制效果(E组)

载置癌移植有S-180细胞的物质非载置癌没有移植S-180细胞的物质偏差值n＝8另外，根据这些表的结果，各测定日总结的结果(曲线)分别如图15(第7日)、图16(第10日)、图17(第14日)所示。另外，根据这些表的结果，图18表示不同的供试药的生成方法的结果(曲线)，图19表示不同的供试药的投药时间的结果(曲线)，图20表示供试药的不同银离子浓度的结果(曲线)。
(3)考察参考本试验的结果，对于不同的供试药生成方法，确认了利用无隔膜电解(银电极)-有隔膜电解法生成的含有银成分的电解生成酸性水(供试药A组)和电解生成碱性水(供试药B组)具有高增殖抑制作用。但是，即使是含有银成分的电解生成碱性水，利用有隔膜电解-无隔膜电解(银电极)生成的电解生成碱性水(供试药C组)也没有确认增殖抑制作用。而且，利用无隔膜电解(银电极)生成的含有银的电解生成水(供试药D组)和在水中添加银粉末调制成的银水溶液(供试药E组)没有确认增殖抑制作用。
对于不同的供试药的投药时间，前投药与同时投药均具有增殖抑制作用，但是同时投药时的增殖抑制作用有更高的倾向。而且，对于不同的供试药的银离子浓度，确定了银成分为银离子浓度100ppb时，具有高的增殖抑制作用。即使银成分的银离子浓度为500ppb，也没有确定增殖抑制作用出现差异。
权利要求
1.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂，其特征在于含有通过电解含有银成分的水而生成的弱碱性电解水作为有效成分。
2.如权力要求1中所述的免疫增强剂，其特征在于上述弱碱性电解水的氢离子浓度以pH9为基准处于pH8.0～10.0的范围内，银成分以离子的状态存在，其换算成的银离子浓度以100ppb为基准处于30ppb～20ppb的范围内。
3.如权力要求1或2中所述的免疫增强剂，其特征在于上述弱碱性电解水的氧化还原电位以+200mV为基准，规定在+400mV～+800mV的范围内。
4.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂，其特征在于含有通过电解含有银成分的水而生成的弱酸性电解水作为有效成分。
5.如权力要求4中所述的免疫增强剂，其特征在于上述弱酸性电解水的氢离子浓度以pH6为基准处于pH5.0～7.0的范围内，银成分以离子的状态存在，其换算成的银离子浓度以100ppb为基准处于30ppb～200ppb的范围内。
6.如权力要求4或5中所述的免疫增强剂，其特征在于上述弱酸性电解水的氧化还原电位以400mV为基准，处于+200mV～+800mV的范围内。
7.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将含有银成分的水在有隔膜电解槽的负极侧电解室中电解，以所形成的含有银成分的弱碱性电解水为免疫增强剂的有效成分。
8.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将含有银成分的水在无隔膜电解槽的负极侧电解，以所形成的含有银成分的弱碱性电解水为免疫增强剂的有效成分。
9.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将含有银成分的水在有隔膜电解槽的正极侧电解室中电解，以所形成的含有银成分的弱酸性电解水为免疫增强剂的有效成分。
10.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将含有银成分的水在无隔膜电解槽的正极侧电解，以所形成的含有银成分的弱酸性电解水为免疫增强剂的有效成分。
11.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将通过银粉末溶解于水而调整所得的含银成分的水溶液在有隔膜电解槽的负极侧电解室中电解，以所形成的含有银成分的弱碱性电解水为免疫增强剂的有效成分。
12.一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂的生成方法，其特征在于将通过银粉末溶解于水而调整所得的含银成分的水溶液在无隔膜电解槽的负极侧电解，以所形成的含有银成分的弱碱性电解水为免疫增强剂的有效成分。
13.一种免疫增强剂的生成装置，其特征在于具有配备有处理自来水、自然水等清水的软水器和净水器的水处理机构、以银电极为正极侧电极并安装在内部从而用来电解上述水处理机构处理过的处理水的无隔膜电解槽、和使该无隔膜电解层中电解生成的电解水进行电解的有隔膜电解槽，从上述有隔膜电解槽的正极侧电解室引出含有银成分的弱酸电解性水，从该有隔膜电解槽的负极侧电解室引出含有银成分的弱碱性电解水，将上述弱酸性电解水或弱碱性电解水用作提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂。
14.一种免疫增强剂的生成装置，其特征在于具有配备有处理自来水、自然水等清水的软水器和净水器的水处理机构、以银电极为正极侧电极并安装在内部从而用来电解上述水处理机构处理过的处理水的第1无隔膜电解槽、和使该无隔膜电解层中电解生成的电解水进行电解的第2无隔膜电解槽，从上述第2无隔膜电解槽的正极侧电解室引出含有银成分的弱酸电解性水，从该第2无隔膜电解槽的负极侧电解室引出含有银成分的弱碱性电解水，将上述弱酸性电解水或弱碱性电解水用作提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂。
全文摘要
本发明为一种用于提高抑制同种异系肿瘤细胞增殖的免疫功能的免疫增强剂，该免疫增强剂以通过含有银成分的水电解所生成的弱碱性电解水或弱酸性电解水为有效成分。
文档编号C25B9/18GK101031311SQ200580032699
公开日2007年9月5日 申请日期2005年3月24日 优先权日2004年9月27日
发明者稻森总一郎, 林正彦 申请人:星崎电机株式会社