改进的电化学生物反应器模块及其用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014.11.02提交的美国临时申请号62/074,065的优先权和权益，其全部内容通过引用纳入本文。

本发明通常涉及生物介导的反应的用途，所述生物介导的反应能改变化合物的氧化态，特别是给定化合物中的碳原子的氧化态。更特别地，本发明涉及改进的电化学生物反应器模块(ebm)及其用于制造所需产品的用途。

背景技术：

在化学反应中，还原是由特定化学物质得到电子，并且氧化是从特定化学物质失去电子。通用术语“氧化还原”反应是氧化-还原反应的简写。氧化还原反应涉及电子从一种化学物质向另一种化学物质的转移。电化学电池被定义为利用氧化还原反应组合的系统，以产生有用的电能，或利用电能来驱动有用的氧化还原反应的组合(silberberg,martin(2009)《化学：分子物质的性质和变化(chemistry:themolecularnatureofmatterandchange)》(第五版)纽约，纽约麦格希出版)。

电化学电池包括称为阳极和阴极的两个电极。电子从电极向化学物质的转移是还原反应，发生在阴极；电子从化学物质向电极的转移是氧化反应，发生在阳极。为了平衡电子在阴极的消耗以及电子在阳极的累积，电子必须以电化学电池外部的某种方式(即通过电线或一些允许电子移动的其他材料)从阳极流动到阴极。该电子的流动就是电流，并可经利用以执行工作，例如驱动电子设备。反之，电子从阳极向阴极的流动可由外部能源驱动，如电池或电动势(emf)，造成发生在阳极或阴极或两者处的有用的化学反应。

电化学电池可被构建用于产生电流，即来源于在阳极和阴极进行的自发的氧化还原反应的通过传导性的元件(如电线)的单向的电子流，或其也可被构建用于消耗由外部来源(如电池或emf)提供的电流，以驱动阳极和阴极处的非自发反应。在后一种情况下，该电力驱动的、非自发的反应可被称为电合成。

电化学电池要求发生两个反应，一个发生在阳极，一个发生在阴极，在各电极发生的反应被称为半电池反应，或半反应。不论电化学电池是消耗还是产生电流，半电池反应都必然在阳极和阴极处同时进行。

半电池反应被认为具有正或负的还原/氧化电势，称为氧化还原电势；这是半电池反应的氧化和还原的物质之间的平衡常数，以伏特表示，且相对于氢被解离为质子和电子，其被认为具有零伏特的氧化还原电势。

在环境氧化还原电势比给定的半电池反应的氧化还原电势更正的条件下，会使半电池反应朝向反应的氧化的物质。在环境氧化还原电势比给定的半电池反应的氧化还原电势更负的条件下，会使半电池反应朝向半电池反应的还原的物质。

通过从外部源提供电子，即，从外部电源(例如电池)对电化学电池的阴极施加负电压，可使阴极附近的环境的氧化还原电势变得更负。该效应可用于使半电池反应产生还原的物质。为了平衡这一点，半电池反应必须以相应的正电压在阳极进行，从而使阳极的半电池反应产生氧化的物质。

因此，电化学电池的阴极室中提供到环境中的电子会导致半电池反应以从基质产生还原的物质。

任何导致特定化学物质的还原或氧化的反应都可提供有用的半电池反应。这包括生命系统，其中所需的半反应存在于对有机化合物进行转化的代谢途径，并被酶催化。如前所述，半电池反应通常被称为氧化还原反应；因此催化这样的半反应的酶通常被称为氧化还原酶。典型但非排他地，氧化还原酶需要称为辅酶或辅因子的其他生物组分，这些辅酶或辅因子在催化对给定的生物系统中的半电池反应(氧化还原反应)的各种氧化还原酶之间物理传输电子。

为了使氧化还原酶催化氧化还原反应，辅因子或辅酶必须处于合适的氧化或还原形式。在活细胞中，这在代谢过程中被完成。为了氧化给定的碳原子，微生物或其他细胞的代谢过程必须从感兴趣的碳原子去除电子，且为了还原给定的碳原子，代谢过程必须向感兴趣的碳原子提供电子。

在氧化的情况下，容易通过如下方式来实现：使用来自环境(例如，来自空气)的分子氧作为电子的“阱(sink)”，且在该过程中，氧分子通过电化学方式被还原，通常产生两个水分子。

在还原的情况下，微生物中的代谢过程必须氧化一些其他化学物质以提供电子，用于进行所需的还原。在生长于碳源如碳水化合物上的微生物的情况中，最常见的是，还原当量通过将部分碳水化合物完全氧化为co2来产生，也就是说，一些提供给微生物的碳水化合物牺牲式地被氧化，来向微生物提供电子，以在生产更大程度上被还原的有机分子的代谢过程中使用。尽管产生的电子对微生物而言是需要且有用的，但丢失了因氧化为co2而牺牲的碳原子。

类似计算也适用于所有牺牲了输入含碳物质中的一些以向所需代谢过程提供电子的代谢过程。

如果电子可由外部源(也即，电流)提供，则消除了牺牲输入含碳物质以提供电子的需要，且个体氧化还原酶可被用作常规催化剂，进行氧化还原反应而不需要活细胞，并与生物系统或过程如活性发酵相关联。

显著改进的化学过程可通过如下系统实现，该系统能在和标准催化的化学过程类似的过程中使用过剩的氧化还原酶。在发酵液中去除活性代谢的细胞的方面将使更高的底物浓度的使用、非生理条件、以及所需产物的容易分离和纯化成为可能。例如，已经报道了使用电化学方法来使对bayer-villiger氧化进行催化的p450单加氧酶的黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)辅因子再生(schmid等，《美国化学学会会志(j.am.chem.soc.)》2005，127，6540-6541)，但这是在容纳10ml的体积的简单搅拌瓶中进行的。然而，并没有设想以工业实践的规模进行该反应。

自然界中包含有用的氧化还原酶的微生物是广泛已知的，且可以通过简单的筛选快速找到。如果需要特定的氧化还原酶且天然宿主生物不容易生长或处理，则氧化还原酶可以容易地在标准的工业上有用的宿主中被克隆和过表达，如酿酒酵母(s.cerevisiae)或大肠杆菌(e.coli)。

因而非常需要从外部源向具有一定物理布置的氧化还原酶系统提供电子，其允许以连续的工艺料流提供底物分子、通过经选择的氧化还原酶来催化所需的氧化还原反应、且易从连续的工艺料流回收和分离所得产物。

该需要已经被他人认识到，并已经公开了向生物系统递送电子的多项尝试。电子从电极(阴极)向生物系统的转移也通过电子运送介质的使用而被改进，且化合物中性红(nr)普遍应用于该方面。

zeikus等的美国专利第6,270,649号显示了中性红是一种改进的电子介质，其用于将电力转化为微生物的还原力，该还原力用于增强的细胞生长和还原的最终产物的产量(见park等，《应用与环境微生物学(appl.environ.microbioi.)》65:2912-2917，1999；和park等，《细菌学杂志(j.bacteriol.)》1812:2403-2410，1999)，或在生物燃料电池中将微生物的还原力转化为电力(见park和zeikus，《应用与环境微生物学》66:1292-1297，2000)。

在《细菌学杂志》1812:2403-2410，1999中，park等首次提供了nr如何通过生理学方式形式功能的生物化学证据，其显示(i)nr的电还原与nad+还原有化学联系，并且其与质子动力势的生成和琥珀酸盐的生产有生物化学联系，(ii)nr似乎通过替代膜结合复合物中的甲基萘醌来行使功能。

在《生物技术通信》(biotech.lett.)22:1301-1304，2000中park等显示了将中性红结合在石墨电极上进一步增强了微生物燃料电池中的电子转移效率。

发酵和生物转化的电增强还涉及电极和电子介质在生物反应器系统中的利用，以增强还原的最终产物的产量(见hongo等，《农业与生物化学期刊》(agri.biolio.chem.)，43:2075-208111979；hongo等，《农业与生物化学期刊》，43:2083-2086，1979；kim等，1988；park和zeikus，《细菌学杂志》181:403-2410，1999；和shin等，《应用微生物学与生物技术》(applmicrobiolbiotechnol.)，dol1o.1007/s002530100809.网上公开：2001年9月22日)。例如，石墨粘结电极和可溶的中性红可大大增强通过发酵而生产的琥珀酸盐的产率(见park和zeikus，《细菌学杂志》181:403-2410，1999)以及通过酵母转化生产的四氢萘醇的产率(shin等，《应用微生物学与生物技术》，dol1o.1007/s002530100809.网上公开：2001年9月22日)。

在化学合成(见例如，s.m.roberts等，《今日化学》(chimicaoggi)，1993年7月/8月，93-104页；和d.miyawaki等，《酶和微生物技术》(enzg.microbiol.technol.)15:525-29，1993)或化学检测即生物传感器(见例如，p.n.bartlett，《医学与生物工程与计算机》(med.andbioi.eng.andcomput.)28:blo-b7，1990；和d.miyawaki等，同上)中，限制氧化还原酶利用的一个主要因素是缺乏用于电子转移辅因子(例如，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、醌类、黄素腺嘌呤二核苷酸等)再生或回收再利用的简便系统。

虽然电子可作为单个电子通过辅因子在生物系统中被传递，但电子的传递常以电子对的形式发生。在电子对的情况下，质子也在形式上被传递，因此形式上的化学物质是氢化物，也就是说具有额外(第二)电子的氢原子，因此带负电荷，通常写作“h-”。

在生物系统中，这种物质在历史上被称为“还原当量”，因为向化学物质的形式添加氢化物导致了该化学物质的减少。形式上，需要一个额外的第二质子来中和反应的还原产物通过添加氢化物物质所携带的形式负电荷。通常在生物系统中，必需的质子简单地通过水合氢离子(即质子化水分子，h3o⁺)提供。在电化学电池中，质子化水分子可在阳极产生并被允许向阴极动。

park和zeikus在《细菌学杂志》181:2403-2410，1999中已经报道，称为中性红的化合物将与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子(nad+)进行可逆的化学氧化还原反应，也就是说中性红的还原形式(nrred)具有足够低的氧化还原值，以使电子转移至，进而将氧化还原辅因子nad+从其氧化形式还原到其还原形式nadh。在该过程中，中性红被氧化为物质nrox，然后该物质可从阴极接受电子，从而回到还原形式nrred，进而可减少nad+。

还有报道说，通过在含有微生物的电化学反应器中使用可溶性中性红，微生物可以仅依靠电力生长；不同的微生物可在生物转化发酵过程中过量生产各种还原的生物化学物质；微生物可以在有机物代谢过程中发电。(见例如，park等，《应用与环境微生物学》(appl.environ.microbioi.)2912-2917页，1990；park和zeikus，《应用与环境微生物学》，66:1292-1297，2000；和美国专利第6,270,649号)。

美国专利第7,250,288号b2中，zeikus等讨论了在电化学生物反应器系统中提高电极效率的需求并提出了提高的方式，如将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、中性红和延胡索酸还原酶连接至电极，以改善电子转移特性。尽管上述这些可以改善电子转移特性，但是基于电极设计和电化学生物反应器系统设计的其它方式的改进也可能是有利的。

用于生产氯、臭氧和过氧化氢的商业规模电化学工艺设备的文献记载了在实验室电化学研究中使用的电极规模通常具有较差的流体流动确定和质量传递特点，从而难以扩大规模(walsh,f.,和g.reade,《分析员》(analyst)，119(1)，797-803页(1994年5月))。

向微生物提供还原当量可通过再生nadh来实现。在文献中，标准电势常被报道为-0.32v，然而根据karyakin等，ph6下-0.59v的电势可能是更精确的(见karyakin等，《电化学通讯》(electrochemistrycommunications)5:677-680，2003)。

还原的电子穿梭体可以将电子转移到几种不同的吸电子化合物，例如偶氮染料、多卤代化合物、硝基芳族化合物和氧化的准金属。vanderzee和cervantes综述了电子穿梭体催化的还原生物转化过程的结果(见frankp.vanderzee和franciscoj.cervantes.《生物技术进展》(biotechnologyadvances)27:265-277,2009)。

为了使电化学生物反应器变得商业上可行，必须对常规系统的硬件设计和工艺设计做出改变，以将产率和效率提高到实用水平。

此外，虽然其他人之前已经认识到向生物系统提供外部电子的适宜性，但是在其提供的实施例中显示，用于实现这一点的方法要求以一定形式包含阳极，该形式防止其与本体(bulk)生物系统发生不期望的反应。因此，必须采取一些物理布置以提供向阳极的电子转移，同时保持阳极与发酵液(在为全细胞的情况下)或缓冲系统(在分离的酶处于水介质中的情况下)的物理隔离，且这由各种膜、盐桥或其他物理手段实现。相对于先前公开的设计，电化学电池的设计的简化，以及用于连续、流通系统(例如通过大型发酵容器或化学反应器的环路)的电池的设计是理想的。甚至更希望以如下方式安排电化学电池，所述方式在阳极利用简单的半反应，并且以避免使用盐桥来连接阳极室和阴极室的方式进行操作，且当采用膜来分隔阳极室和阴极室时减轻膜污染。

本发明的目的是提供改进的方法和系统，其允许在电化学生物反应器模块(ebm)中相互转化生物化学还原力(例如nadh)和电能。本发明的另一目的是制造所需的产品，其要求ebm中的还原能力或还原当量。本发明的另一个目的是公开酶、辅因子和/或电子传递介质与ebm联合用于制备所需产物的应用，并且以高效利用酶、辅因子和/或电子传递介质的方法中实现上述目的，并且基本上防止它们与制备的制备的所需产物混合或掺混。

在阅读了说明书和权利要求的基础上，本发明的其他目标、特征和优势是显而易见的。

附图的简要说明

图1示出了在示例性设计中，wo2014039767中描述的电化学电池的整体电化学和总体布置。

图2示出了在示例性实施方式中的阴极室的总体布置，其显示了分隔阴极和本体反应相的不对称膜的放置。

图3示出了在示例性实施方式中，在阴极室中的水性本体相中使用中性红(“nr”)作为etm，使电子穿梭到包含在不对称膜的孔内的nad(p)辅因子/酶系统。

图4示出了在示例性实施方式中，在阴极室中的水相中使用甲酸盐/碳酸盐(碳酸氢盐)作为etm。

图5示出了在示例性实施方式中，采用不同部件相对设置的电化学生物反应器的分解图。

发明概述

在一个方面，本发明包括用于向氧化还原酶提供以电化学方式产生的还原能力或还原当量的设备或装置，用于催化所需的底物分子的还原。通过提供以电化学方式产生的还原当量，该发明允许在非生理或非细胞环境中使用氧化还原酶，并且允许所述酶用于工业工艺。

该装置还允许以如下方式包括已知的生物辅因子如nad(p)、一种或多种氧化还原酶，和电子传递介质(etm)的系统，所述方式允许在连续工艺料流中将所需的底物分子提供给所述装置，允许使工艺料流与所需的氧化还原酶接触来催化所需的氧化还原反应，并允许所得的所需产物分子在连续工艺料流中离开所述装置。

该装置还允许捕获在向氧化还原酶提供还原当量的过程中可能在阴极表面不定产生的任何氢气。

本发明的一个方面涉及以通过需要还原当量的反应来生产产物的装置，包括：

(a)包含在阳极室中的阳极和包含在阴极室中的阴极；

(b)阳极室中去离子水，其与阳极接触；

(c)分隔阳极室和阴极室的质子渗透膜；

(d)阴极室中的液相，其与阴极连续接触，所述液相任选地包含能够将还原当量传递到氧化还原酶系统的电子传递介质(etm)，所述氧化还原酶系统包含氧化还原酶和辅因子；

(e)含有待被氧化还原酶系统催化为所需产物的底物的工艺料流；

(f)位于阴极和工艺料流之间的膜，所述膜能防止任选的etm和氧化还原酶系统显著地进入工艺料流；以及

(g)在阳极和阴极之间提供电压的外部电源。

在一些实施方式中，膜允许液相和工艺料流之间的界面接触，同时防止液相和工艺料流的大量混合并防止工艺料流与阴极大幅接触。膜可以是其中含有氧化还原酶系统的至少一部分(例如，一种或多种氧化还原酶和任选的一种或多种辅因子)的亲水性不对称膜。在某些实施方式中，膜可以具有延伸穿过其中的一个或多个孔，且氧化还原酶系统的至少一部分可以包含在所述孔内。孔可以在膜的面向阴极的第一表面上具有第一开口，其中第一开口足够小以防止分子量大于100kda(例如，大于100kda、大于80kda、大于60kda、大于50kda、大于40kda、大于30kda、大于20kda、大于20kda、大于10kda或大于5kda)的分子大幅通过。孔还可以在面向工艺料流的膜的第二表面上具有第二开口，其中第二开口足够大以允许包含在孔内的氧化还原酶的至少一部分接触工艺料流中的底物。第二开口可在尺寸上大于第一开口。

在一些实施方式中，辅因子可位于膜或液相中。

在一些实施方式中，工艺料流可以是氧化还原酶系统在其中基本上不溶的本体有机相。当膜为亲水性时，氧化还原酶和/或辅因子存在于与本体有机相基本上不混溶的水性环境中。

液相可以任选地再循环进和出阴极室。任选的etm可以是选自中性红、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)、黄素单核苷酸(fmn)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、铁氧还蛋白、醌和腐殖酸中的一种或多种，其各自任选经化学修饰，所述化学修饰以保持其氧化还原性质和与氧化还原酶的功能性相互作用、同时允许膜防止etm大幅进入工艺料流的方式进行。在一个实施方式中，etm是甲酸盐或碳酸氢盐。

在一个实施方式中，氧化还原酶系统包括p450酶、p450还原酶、以及任选的铁氧还蛋白。在另一个实施方式中，氧化还原酶系统包括酮还原酶或具有必需辅因子的醇脱氢酶，最典型的是nad(p)。在另一个实施方式中，氧化还原酶系统有能力催化脱氮。本领域技术人员将认识到可以使用需要辅因子还原形式的其它氧化还原酶系统。

本发明的另一个方面涉及从底物生产所需产物的方法，包括；

(a)提供采用包括底物的工艺料流的本发明公开的装置的任何实施方式；

(b)在阳极和阴极之间施加来自外部电源的合适电压；

(c)在工艺料流中累积所需的产物；以及

(d)任选地，收集不定产生的氢气。

在一些实施方式中，该方法可进一步包括通过膜保持氧化还原酶系统和任选的etm，使得工艺料流基本上不含氧化还原酶系统或任选的etm。

发明详述

本文提供了一种装置和用于使用该装置的方法，用于通过需要添加还原当量的氧化还原酶系统来生产日用、专用、功能或精细化学品。该装置允许方便地改变操作条件以实现最大电化学效率以供给定的酶促介导的氧化还原反应或一系列反应。

在一些实施方式中，本发明涉及pct专利申请公开号wo2014039767a1中先前描述的“电化学生物反应器模块”(ebm)的改进形式。现有的ebm示于图1，其通常包括电化学电池，该电化学电池具有包含在阳极室中的阳极、包含在阴极室中的阴极、分隔所述两室的质子渗透膜、任选的etm和氧化还原酶系统。氧化还原酶可用于将底物催化还原成所需产物。图1中，指出了随水合氢离子(h3o⁺)从阳极室(“去离子化的水侧”)向阴极室(“反应侧”)的质子净流量，以及外部驱动电流和电化学物质。图1显示一般的电子传递介质(etm)，其通过从阴极接受电子并向nad(p)辅因子递送电子而在其氧化态和还原态之间循环。etm由于可以将电子从阴极直接递送到nad(p)辅因子而是任选的。

在一些实施方式中，本发明涉及在ebm中使用一个或多个膜以限制电子传递介质(任选的)、氧化还原辅因子和/或酶，以及其与本体化学反应相的隔离，所述化学反应相中，底物被氧化还原酶催化为还原产物。

更具体地，在某些实施方式中，氧化还原酶、它们的相应的辅因子和任选的电子传递介质可通过膜与本体反应相隔离，防止它们大幅进入本体反应相。这样，反应相基本不含氧化还原酶、辅因子和/或任选的电子传递介质，这显著地节省了与纯化终产物相关的时间和成本。在某些实施方式中，膜可被设计为具有孔，氧化还原酶、辅因子和/或任选的电子传递介质可被包含或定位在所述孔中，从而增加氧化还原酶与反应相中的底物的接触面积，并减少促进将底物还原为所需产物所要求的氧化还原酶、辅因子和/或任选的电子传递介质的量。

如本文所用，“氧化还原酶”是催化导致被作用的分子的化学氧化状态发生变化的反应的酶，这样的分子称为“底物”。在反应过程中，底物分子通过氧化还原酶接受电子以产生比底物分子化学还原程度更高的分子。该还原的分子为“还原产物”，或更简洁地，“产物”。示例性产物包括商业或工业上重要的产物，例如琥珀酸(例如从富马酸盐还原)、甲烷(例如从co2还原)、丁二醇、乙醇、脂肪酸和其它醇。

通过质子进行平衡的电子被称为“还原当量”或“还原力”。还原当量通常通过辅因子向氧化还原酶提供。通常，一起催化底物转化为具有不同化学氧化态的产物分子的氧化还原酶及其相应的辅因子的组合被称为“氧化还原酶系统”。

任何合适的氧化还原酶可用于本发明的基质中，包括氧化还原酶的混合物。氧化还原酶可从商业来源获得，或通过可以大量生产重组蛋白质的基因工程制备。

在底物分子上操作以得到还原产物的氧化还原酶系统的一个例子是通过称为“醇脱氢酶”(例如，酶类别ec1.1.5尤其是ec1.1.5.2，或ec1.1.1尤其是ec1.1.1.1或ec1.1.1.2)或“酮还原酶”的酶将酮催化还原为仲醇；一些实施方式中的术语被同义使用。该类酶能够作用于>ch—oh基团以将其氧化为>c＝o基团(或逆反应)。通过使用氧化还原酶来催化该反应，仲醇产物可以所需立体化学或手性特点被制造。这为制备药学上有用的分子提供了相当大的价值，例如其中手性通常是必要性质的情况。

在一个实施方式中，醇脱氢酶(adh)可获自或获自活体。合适的adh来源于细菌或真菌。优选细菌来源的adh酶，尤其是葡萄糖假葡萄糖杆菌(pseudogluconobactersaccharoketogenes)adh、高加索酸奶乳杆菌(lactobacilluskefir)adh、布氏热厌氧菌(thermoanaerobiumbrockii)adh和大肠杆菌(escherichiacoli)adh，或与其中任一种具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少95％、更进一步优选至少96％，如至少97％、还更优选至少98％、最优选至少99％序列相同性的醇脱氢酶。特别优选葡萄糖假葡萄糖杆菌(pseudogluconobactersaccharoketogenes)adh或与其具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少95％、更进一步优选至少96％，如至少97％、还更优选至少98％、最优选至少99％序列相同性的醇脱氢酶。在真菌来源的adh酶中，优选酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)adh或与其具有至少70％、例如至少75％、如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少95％、更进一步优选至少96％，如至少97％、还更优选至少98％、最优选至少99％序列相同性的醇脱氢酶。

氧化还原酶的另一个例子是p450单加氧酶或p450酶，一类催化多种有用的化学转化的酶。p450酶需要还原当量，尽管它们催化的反应的结果实际上是一种氧化，其中产物的化学氧化程度高于起始底物。为了实现这个目的，p450氧化还原酶使用氧分子o2，并将其分解为两个组分氧原子。一个氧原子通过p450由其辅因子提供的还原当量被还原为水h2o，该辅因子最通常是“p450还原酶”并在一些情况下为铁氧还蛋白分子。另一个氧原子形式上插入在其它情况下未活化的碳-氢或碳-碳键，产生氧化的产物分子。这种类型的反应，未活化的碳的氧化在不使用p450酶的情况下是非常困难的，因此是非常有价值的。一个具体的例子是生产皮质类固醇必需的羟基化反应。因此，可认为提供可以向p450酶提供还原当量的系统有相当大的实用价值。尽管所需的产物分子的氧化程度高于底物分子，在本发明的内容中其仍被认为是“产物”，并将存在于工艺料流中。

可以使用任何细胞色素p450酶。因此，本发明所涵盖的p450包括原核、真核、细菌和线粒体酶。细胞色素p450(通常缩写为cyp、p450，和不经常缩写为cyp450)是血红素蛋白的一个非常大且多样化的超家族，其形成称为含p450的系统的多组分电子传递链的一部分。已知适用于本发明的细胞色素p450包括cyp1家族(cyp1a1；cyp1a2；cyp1b1)、cyp2家族(cyp2a6；cyp2a7、cyp2b6、cyp2a13；cyp2b6；cyp2c8；cyp2c9；cyp2c18、cyp2c19；cyp2d6；cyp2e1；cyp2f1；cyp2j2；cyp2r1；cyp2s1；cyp2u1、cyp2w1)、cyp3家族(cyp3a4；cyp3a5；cyp3a7；cyp3a43)、cyp4家族(cyp4a11；cyp4a22；cyp4b1；cyp4f2、cyp4f3、cyp4f8、cyp4f11、cyp4f12、cyp4v2、cyp4z1)、cyp5a1、cyp7a1、cyp7b1、cyp8a1、cyp8b1、cyp11a1、cyp11b1、cyp11b2、cyp17a1、cyp19a1、cyp20a1、cyp21a2、cyp24a1、cyp26a1、cyp26b1、cyp26c1、cyp27a1、cyp27b1、cyp27c1、cyp39a1、cyp46a1、和cyp51a1。其他p450由urlacher和girhard在《生物技术趋势》(trendsinbiotechnology)，30(1)，2012，26–36页中进行综述，其通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“电子传递介质”或“etm”是指能够自身接受一个或多个电子，然后将电子传递到另一分子的分子，包括将电子传递到酶分子。一个典型的周知的etm是中性红，其也被用作ph指示剂。可用作etm的其他化合物包括亚甲基蓝、甲基紫精和醌。最通常地，可以使用其还原电势比nad+更低的化合物，并且其包括通常称为氧化还原染料的各种化合物。例如，在先前描述的情形下，中性红通过促进电子从阴极到nad+辅因子的运动而充当电子传递介质，从而有助于还原nad+以产生nadh。

术语“电子传递介质”或“etm”可包括促进电子转移到酶分子的分子，因此在广义上，辅因子(例如nadh、fmn、fad，铁氧还蛋白等)也可以被认为是电子传递介质。然而，在一些例子中，术语“电子传递介质”或etm仅意在描述促进电子转移，但在其它情况下通常不被认为是氧化还原酶系统的天然存在的辅因子的那些分子，例如，nadh、fmn、fad、铁氧还蛋白等。

在本公开的内容中，etm通常被认为是促进电子从实际阴极表面转移到氧化还原酶系统的辅因子所需要的。然而，氧化还原酶系统的辅因子自身能直接从阴极表面吸收电子而不需要etm分子的介导。从而，在通常情况下，etm的使用是任选的，尽管在本发明的一些实施方式中是优选的。

除了提供还原当量之外，本发明允许通过使用合适的膜将酶、nad(p)辅因子和任选的etm包含在阴极附近。这种布置防止酶、nad(p)辅因子和任选的etm进入包含底物和产物的大得多的本体反应相中的损失，从而减少这些试剂所需的量并因此降低成本。此外，对酶、辅因子和任选的etm的这种包含使得它们不会污染本体有机反应相中的产物，从而显著简化还原产物的回收和纯化。这在etm是氧化还原染料分子时特别有用。

在一个方面，提供一种用于通过需要还原当量的反应产生所需产物的装置。该装置包括：

(a)包含在阳极室中的阳极和包含在阴极室中的阴极；

(b)阳极室中的去离子水，其与阳极接触；

(c)分隔阳极室和阴极室的质子渗透膜；

(d)阴极室中的液相，其与阴极连续接触，所述液相任选地包含能够将还原当量传递到氧化还原酶系统的电子传递介质(etm)，所述氧化还原酶系统包含氧化还原酶和辅因子；

(e)含有待被氧化还原酶系统催化为所需产物的底物的工艺料流；

(f)位于阴极和工艺料流之间的膜，所述膜能防止任选的etm和氧化还原酶系统大幅进入工艺料流；以及

(g)在阳极和阴极之间提供电压的外部电源。

在本发明中，阳极可以是允许有用的电流密度的任何简便的设计。最典型地，阳极可以是涂覆有铂的钛基底。这样的阳极设计现在商业可得且被用于电解槽。

阳极室可以任何方便的设计，其允许去离子水的输入、再循环和温度控制，同时允许在阳极表面处产生的气体(即氧气)的输出和任选的收集。

在一个实施方式或使用方法中，阳极室被去离子水填充，并且施加足够的电压以引起水的电解裂解。这导致了氧气在阳极室中形成，其可以释放到大气中或被捕获用于其他用途。附带产生的水合氢离子(h3o⁺)沿着电梯度迁移并穿过隔离阳极室和阴极室的膜。

阴极可以是任何方便的设计，其允许良好的电流密度和电子传递到etm。优选地，阴极被设计成使表面积、阴极室中的液相与阴极的接触、以及阴极的整体电子传递特性均最大化。

在一个实施方式中，阴极室包括主要由碳构成的阴极。其可以是已经加工成具有增加表面积和etm和阴极之间的接触时间的流动通道或其它物理形状的固体碳块。

在另一个实施方式中，阴极室包括碳、碳毡或多孔碳的薄片形式的碳电极。这是商业上称为“碳纸”，可以以以下品牌名称购得：toraycarbonpapertgp-h-060、carbonpaperavcarb。其他类似的产品也是可得的且被本领域技术人员所知。电连通的多张碳纸可用作阴极，从而提供增加的表面积。

在某些实施方式中，阴极室被构造成允许在顶部空间或其他合适的区域中收集氢气，该顶部空间或其它合适的区域被设计成允许在ebm的正常操作期间从液相中分离不定地在阴极上形成的氢气小气泡，并且允许从ebm装置除去氢气。该氢气可以回收并作为其他化学过程的试剂流，或用作燃料。

在各种实施方式中，本发明的装置包括分隔阳极室和阴极室的质子渗透膜。在一个实施方式中，质子渗透膜可以是改良的膜，其允许质子(如水合氢离子，h3o⁺)穿过它。质子渗透膜可以在阳极侧支撑或容纳催化剂，以产生氧气。

在本发明的一些实施方式中，阴极室包括阴极，和一个或多个位于阴极和本体反应相之间并将它们分隔开的膜。该分隔通过聚合物膜的存在而实现，最典型的是亲水性膜，例如，聚丙烯腈，其用作保持任选的etm、辅因子和氧化还原酶的物理屏障，并防止这些物质分散或进入在阴极室内循环的本体反应相。

膜可以具有穿过其中延伸的一个或多个孔。孔可用于圈留氧化还原酶和/或辅因子。该膜可以是“不对称”的，由于孔在膜的一侧(例如，面向本体反应相的一侧)的开口尺寸可以比另一侧大(例如，面向阴极的一侧)。

孔的大小可以表示为分子量截止值。例如，膜可以被称为10kda膜，这意味着孔尺寸较小的膜的侧面的孔尺寸具有使分子量大于10kda(千道尔顿)的分子不以任何实质的程度通过该膜的尺寸。在一些实施方式中，孔可以在膜的面向阴极的第一表面上具有第一开口，其中第一开口足够小以防止分子量大于100kda(例如，大于100kda、大于80kda、大于60kda、大于50kda、大于40kda、大于30kda、大于20kda、大于20kda、大于10kda、大于5kda或大于1kda)的分子大幅通过。孔可以在面向工艺料流的膜的第二表面上进一步具有第二开口，其中第二开口足够大以允许包含在孔内的氧化还原酶的至少一部分接触工艺料流中的底物。第二开口可在尺寸上大于第一开口。

可以根据需要提供垫圈，以在所述一个或多个膜之间形成填隙空间。本体反应相本质上可以是有机的，并且合理地不与水混溶。阴极室可以装配有端口，以允许包含在任何任选的填隙空间或隔室中的流体被独立地移除、替换或再循环。不对称膜支持工艺料流和含有氧化还原酶的水相之间的界面接触以及直接与阴极接触的流体的界面接触。优选选择使不对称膜的孔径尽可能地大，但仍应防止氧化还原酶、辅因子和/或etm通过膜和/或以显著程度进入工艺料流中。在一些实施方式中，超过99％、超过98％、超过95％、超过90％、超过80％、超过70％、超过60％、超过50％的氧化还原酶、辅因子和/或etm被膜所保留。在特定的实施方式中，工艺料流中基本上没有氧化还原酶、辅因子和/或etm，例如，包含少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％的氧化还原酶、辅因子和/或etm。

一个示例性的亲水性不对称膜在美国专利第4,705,704号和第5,077,217号中被描述，两者的全部公开内容通过引用并入本文。然而，应该注意的是，美国专利号第4,705,704号和第5,077,217号中使用的膜用于分离含有底物的反应物相和含有所得产物的产物相。也就是说，底物和产物在膜的不同侧，从而不处于同一个工艺料流中。另外，美国专利第4,705,704号和第5,077,217号中的膜必须同时影响跨过膜的酶催化反应的产物的迁移。而且，其中使用的酶不需要还原当量，且其中没有公开与任何电化学工艺相关的任何膜的使用，或者用于防止etm或辅因子与工艺流体混合的目的。

本文所用术语“本体反应相”、或“本体有机反应相”是其中溶解有底物和/或产物的液体或气体或流体相。在标准用法中，这种液体或气体或流体也称为“工艺料流”，本领域普通技术人员将容易理解这些术语。

在本发明的一个实施方式中，例如，阴极与本体有机反应相由本文公开的膜隔离，所述本体有机反应性中存在待还原的化学物质(即，底物)且将包含所述反应的还原产物。本体有机反应相可以含有待用氧化还原酶系统还原的化学物质的工艺流料形式连续循环。在反应过程中，反应相的组成随着底物的量或浓度减少，同时产物的量或浓度增加而持续变化。在反应结束时，本体有机工艺料流主要含有得到的产物的化学物质。作为本体有机相的实例，可以使用溶剂如庚烷、叔丁基甲基醚、甲苯或与水不混溶的其它有机溶剂来提供底物和还原产物所需的溶解。本领域技术人员能直接理解，本体有机反应相还必须与不对称膜的材料相容，以免损害或溶解膜。

在本发明的一个实施方式中，任选的电子传递介质可被用于将电子从阴极传递到辅因子。etm是任选的，因为辅因子可直接将电子从阴极传递到氧化还原酶，而不需要etm。在一些实施方式中，希望采用etm。

如果etm存在于阴极液相中，则可以由不对称膜保留，因此不会大幅或显著进入反应相。这可以通过在水性阴极液相的情况下拥有足够高的分子量(例如通过etm的化学修饰)来实现。在非水性或部分水性阴极液相(例如，有机的)的情况下，可以选择etm以在其中具有合适的溶解度，或者可以选择溶剂以适当地溶解etm。

在特定的实施方式中，etm和/或辅因子可通过接枝到可溶性聚合物上的方法来被化学修饰，使得它们不能通过与阴极室连通的膜的孔。在该方式中，etm被保留在阴极室内，且辅因子被保留在膜的多孔基质中，甚至在阴极室中的水相和保持在膜中的水相彼此连续时也是如此，从而允许etm将电子转移到辅因子，进而允许氧化还原酶。例如，etm和/或辅因子可以被共价连接至水溶性聚合物，所述水溶性聚合物具有足够的分子量，从而其物理上无法穿过孔较小的非对称膜。作为具体的例子，中性红具有可以与聚合物如聚丙烯酸上的活化的羧酸基团进行反应的游离的伯氨基。共价键可以通过在中性红上的伯氨基和聚丙烯酸酯上的可接近的羧酸基之间形成酰胺键来实现。可以使用通常用于在水性环境中形成酰胺键的试剂，例如在寡肽合成期间遇到的条件，水溶性碳二亚胺是这些试剂的常见和公知的实例。

在一个实施方式中，图2所示，阴极室包含液体(水性或有机)相，其包含任选的etm。电子从阴极传递到etm。氧化还原酶或酶的系统，任选地与其所需的一个辅因子或多个辅因子一起被包含在合适的水相中，该水相通过合适的膜、最典型是亲水膜保持在适当的位置上。在一个实施方式中，设置亲水不对称膜以在膜的多孔结构内的水性环境中含有氧化还原酶或辅因子/氧化还原酶系统。辅因子从etm接受存在于阴极液相的电子，并将电子传递到被保持在膜中的水性环境中的氧化还原酶。含有氧化还原酶的水性环境接触本体有机反应相，允许催化氧化还原反应。底物和氧化还原反应的还原产物都包含在本体有机反应相中。

参考图2，膜上的水相或环境与液相直接接触，其可以是水性或有机的且位于阴极室中并保持etm。含有氧化还原酶的膜中的水相也与本体有机反应相接触并将本体有机反应相与阴极分离。在该实施方式中，当阴极室包含有机相时，etm通过有机相的不混溶性而被保持在阴极室中，且水相中的etm被膜保持，并从而防止分散到膜的另一侧的本体反应相中。被膜所保持的、存在于水性相中的辅因子和酶同样由于其在有机相中的溶解度不足而被防止分散到阴极室或本体有机反应相中。

仍然参考图2，左边的质子渗透膜将阳极室与阴极室分隔。不定产生于阴极的氢气可被捕获离开阴极室。

在另一个实施方式中，如图3所示，阴极室含有水相，并且防止氧化还原酶通过与阴极室中的水相连通的膜中的孔的尺寸而分散到阴极室中。酶系统处于与阴极室中的主体水相连续的水性环境中。etm可以被适当地化学修饰以具有足够高的分子量，以被不对称膜保留在阴极室中。具有氧化还原酶的不对称膜中的nad(p)辅因子可任选地被修饰以具有显著高的分子量，以防止其离开膜的孔并进入阴极室。辅因子/氧化还原酶系统催化氧化还原反应，底物及其产物保留在本体有机反应相中。

在另一个实施方式中，辅因子可以是未经修饰的并存在于阴极室中的水性相中，同时氧化还原酶被保留在膜的多孔结构中。辅因子自由地与阴极直接接触，被还原，然后通过膜中的孔扩散到达氧化还原酶并向用于催化包含在本体有机反应相中的底物的还原的酶提供电子。在该实施方式中，不存在etm，且酶和辅因子均由于其溶解度不足而被防止进入本体有机相。

在密切相关的实施方案中，氧化还原酶所需的辅因子被化学修饰以防止其通过亲水不对称膜，例如nad化学接枝到20kda的peg寡聚体。这使得在溶剂中使用大量有机反应相能够溶解未修饰的辅因子，尽管溶剂的有机性质。

在另一个实施方式中，如图4所示，etm为小分子如甲酸盐，其能够向氧化还原酶系统递送还原当量，该氧化还原酶系统包括甲酸脱氢酶(fdh)本身连接到进行连续工艺料流在所提供的底物的所需的还原的氧化还原酶。在该操作的实施方式中，甲酸盐被fdh氧化以从nad+加上碳酸氢盐和/或二氧化碳生成nadh，其可以任选使用碳酸酐酶重新捕获为碳酸氢盐。nadh被还原底物的氧化还原酶所用，再生为nad+。在阴极处，碳酸氢盐还原形成甲酸盐，并完成循环。该系统继而催化本体有机反应相中的氧化还原反应。

本发明的装置可进一步包括具有集成仪器的电化学电池，该仪器包括阳极侧氧收集系统、阴极侧气体收集系统、流动速率控制系统、温度测定和控制系统、电压和电流测定和调节系统、ph测定系统、溶解氧(do)测定系统、电导率测定系统、代谢能力(荧光)测定系统。这样的集成系统允许以下具有很大效用的动作：电子和质子转移调节和优化、微生物副产物最小化、h2气体消除或最小化、所需产品优化、蒸馏水(di)水纯度分析、完全质量平衡分析、流速控制、温度控制。

在各种实施方式中，通过ebm将还原当量引入生物系统可以包括以下一个或多个动作：

a)阳极室填充有去离子水，并且阴极室填充有待转移电子的氧化还原酶系统的所需组分；

b)在阳极和阴极之间施加足够电压(电势)的外部电流，使得水在阳极被电解裂解，导致电子流入阳极，以及阳极室中的带正电荷的水合氢离子(h3o⁺)和中性氧(o2)的形成；

c)带正电荷的水合氢离子通过质子渗透膜从阳极室迁移到阴极室，从而在阴极室中提供质子源；

d)来自阳极的电子由外部电源通过外部电路驱动到阴极；

e)电子从阴极转移到阴极室中的氧化还原酶辅因子或所需的etm；

f)氧化还原酶系统使用从阴极提供的电子，通过电子从阴极的直接转移，或直接转移到辅因子如nad+，或者通过电子从阴极转移到etm、然后转移到辅因子如nad+、然后到氧化还原酶，以此在工艺料流中的底物上进行所需的化学还原；和/或

g)从阳极室迁移的水合氢离子的质子被置于本体生物系统中以平衡已从阴极转移的电子。

应该注意的是，这种ebm系统的电力输入可来自可再生资源(风能、太阳能、水力发电等)。

此处还提供一种从底物生产所需产物的方法，其包括；

a)提供具有包括底物的工艺料流的本发明公开的任何装置；

b)在阳极和阴极之间施加来自外部电源的合适电压；

c)在工艺料流中累积所需的产物；以及

d)任选地，收集不定产生的氢气。

本发明的各方面可以单独使用、联用或以前述实施方式未具体讨论的各种排列来使用，并且因此其应用并不限制于前面描述或附图说明所示组件的细节和排列。例如，一个实施方式的所述方面可与其它实施方式所述方面以任何方式组合。

权利要求中修饰所提要素使用的顺序术语“第一”、“第二”、“第三”等本身并不暗指所提要素其一相对另一个的任何优先、居先或级别高低，或实行方法多个行动的时间顺序，而是仅仅用作标记把有某一名称的所提要素与有相同名称的另一要素(但是就顺序术语使用而言)区分开以区别所提的多个要素。

而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。

实施例

在一个例子中，显示ebm系统用于向由单一、分离的氧化还原酶催化的氧化还原反应提供还原当量的应用，通过醇脱氢酶(ec1.1.1.1)在nad+辅因子的存在下将苯乙酮还原成苯乙醇。将通过共价连接到20kda的水溶性聚乙二醇(peg)低聚物来进行化学修饰的醇脱氢酶和nad+按照美国专利第4,705,704号和第5,077,217号中描述的方式装入亲水性不对称膜。将其自身被共价连接到聚丙烯酸酯的水溶性低聚物所修饰的中性红的水性溶液加入到阴极和亲水不对称膜之间形成的隔室中。含有修饰的nad+(例如nad-peg)和醇脱氢酶的水性相与接触阴极的修饰的中性红水相连续，同时在亲水性不对称膜的另一侧提供含有苯乙酮的有机相。施加足够的电压以引起阴极处的中性红的还原，其随后将nad+还原成nadh。nadh与醇脱氢酶结合，并将苯乙酮还原成苯乙醇，nadh被连带氧化回到nad+。亲水性不对称膜非常薄(例如，100微米)，氧化的nad+简单地通过扩散重新接触还原的中性红，并再次还原成nadh。中性红的溶液可以通过在形成于阴极和亲水不对称膜之间的隔室独立地再循环，允许ph的控制、更多的中性红的引入、或通过流通的分析室以跟踪中性红的总体氧化还原状态。

等同形式

本发明提供了用于向生物系统提供还原当量的新方法和装置。尽管讨论了本发明的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员在阅读本说明书后将清楚了解本发明的许多变化。本发明的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。

通过引用纳入

本文中应用的所有公开、专利和专利申请通过引用全文纳入本文用于所有目的，就如同各公开、专利被具体地说明通过引用纳入本文一样。