一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用电泳分离5 (6)-羧基罗丹明异构体的方法，特别涉及一种利 用琼脂糖凝胶电泳分离5 (6)-羧基罗丹明异构体的方法。
【背景技术】
[0002] 荧光探针在表达分子间识别行为，传递复杂生命和环境体系的内部状态信息等方 面具有优异的性能。罗丹明类化合物因其螺环结构变化伴随的分子荧光〇ff-〇n转换特性， 被广泛的应用于构建荧光探针分子。近年来罗丹明基荧光探针的发展呈现功能化的趋势， 其中利用5(6)-羧基罗丹明的底环(苯环）羧基衍生化构建功能探针分子的策略引起了广 泛的关注（参见图4)。Yuan 2012，14(2): 432-435)等利用罗丹明底环羧基 与香豆素连接，构建了性能优异的比率突光探针。Yan等2012，2(10): 988-998)和 I^nia 等（/7/?〇作?沿ocAe?, 2013，121: 156-166)通过罗丹明底环羧基将 革巴向基团引入探针分子，构建了革巴向定位探针。Ryan等（泛6? Cb遞《//?，2002，21(18): 2092-2093)将罗丹明底环羧基与多肽连接，合成了一种可用于酶活性研究的功能探针。以 上工作的特点是利用5 (6)-羧基罗丹明的底环(苯环）羧基将功能基团组合到探针分子中， 从而实现了探针的某种特殊功能。
[0003] 由于5-、6_羧基罗丹明的荧光光谱存在着不可忽视的差异（054? 5bi， 2006，25(2): 147-155)，采用罗丹明底环羧基衍生化构建功能探针分子时，必须采用异构 纯的5-羧基罗丹明或6-羧基罗丹明为原料。遗憾的是异构纯的5-、6_羧基罗丹明并不易 得。按照合成罗丹明类化合物的一般方法，采用比邻苯二甲酸酐多一个羧基的苯三酸酐与 间氨基酚缩合制备羧基罗丹明时，只能得到比例接近的5和6位羧基罗丹明异构体的混合 物，而且两种异构体的理化性质接近，难以用常规方法进行分离2003，5(20): 3675-3677)。因此制备高纯度的羧基罗丹明异构体，已成为发展该类荧光探针的关键性问 题之一。
[0004]目前为了获得异构纯的5-、6_羧基罗丹明化合物，主要采用以下几种方法。方法 一，使用高效制备液相色谱分离5 (6)-羧基罗丹明混合物。这种方法是现在获得异构纯羧 基罗丹明的主要方法，但是其成本高，无法大规模生产。方法二，对合成羧基罗丹明的中间 体一两种异构体混合物进行拆分，然后分别用异构纯中间体进行第二步缩合，由此得到 异构纯羧基罗丹明（Aioco/u?收ate泛￡麗2009，20, 1673-1682)。合成路线见下述的方程 式。这种方法的优点是适用于大规模生产，但是其异构纯中间体的产率很低，成本也较高。 方法三，利用柱前衍生法对5 (6)-羧基罗丹明混合物进行分离。这种方法是先将5 (6)-羧 基罗丹明混合物衍生化，增加异构体间的结构差异并降低分子极性，然后使用柱色谱进行 分离。本申请人曾经对5(6)-羧基罗丹明110混合物采用酯化、柱色谱分离、水解的方法， 成功地实现了克级量的异构体分离(有机化学，2007,27(2): 269-271)。与此类似，肖义 等（CN201210080853)将5 (6)-取得罗丹明混合物与水合肼或羟胺反应得到5 (6)-取代的 罗丹明螺内酰胺混合物，然后柱色谱分离、水解，制备得到5-、6_取代罗丹明异构纯化合 物。这种方法优点是产率较高，但是步骤多，操作复杂。综上所述，开发一种简便、廉价分离 5(6)-羧基罗丹明异构体的方法仍然是一个尚未圆满解决的问题。
【主权项】
1. 一种分离5 (6)-駿基罗丹明异构体的方法，包括如下步骤： (1) 样品的准备 将5-駿基罗丹明和6-駿基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液，将其 在一定温度下超声分散一定时间后获得样品溶液，备用； (2) 凝胶的制备 制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65C后小也地倒入电泳槽内的有机玻璃内 槽中，添加一定抑值的Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止； (3) 电泳分离 用移液器将步骤（1)的样品溶液加到样品孔中，控制一定的电场强度，对凝胶板通电进 行电泳，当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳； (4) 样品后处理 取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离，分别将两个胶带研磨后用有机溶 剂萃取，浓缩萃取液即可分别得到异构纯的5-駿基罗丹明化合物、6-駿基罗丹明化合物。
2. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 的5-駿基罗丹明异构体或6-駿基罗丹明异构体具有下列结构通式：
其中；馬、R2、Rs同时为氨，或者R 1、R2、Rs选自氨、2-6个碳原子焼基中的一种。
3. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 步骤（1)中溶剂为无水己醇、丙丽、己離、己酸己醋、甲醇或含有上述溶剂与水的任意比率的 水溶液。
4. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 步骤（1)中样品溶液的浓度在0.02?4 mol/L之间。
5. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于步骤 (1)中所述的一定温度在l〇~5(TC之间；步骤（1)中所述的一定时间在10?120分钟之间。
6. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 步骤（2)中琼脂糖凝胶液的浓度在0. 5?2wt%之间。
7. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 步骤（2)中抑值在4?10. 5之间，其Tris碱缓冲溶液的浓度为0. 04?2. 00 mol/L。
8. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述 步骤（2)中Tris碱缓冲溶液选自Tris-己酸、Tris-磯酸或Tris-测酸。
9. 根据权利要求1所述的一种分离5化)-駿基罗丹明异构体的方法，其特征在于步骤 (3)中所述的一定电场强度在0. 5 ~20 V/cm之间。
10. 根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的一种分离5 (6)-駿基 罗丹明异构体的方法，其特征在于所述步骤（4)中有机溶剂至少有一种选自甲醇、己醇、己 膳、二氯甲焼、氯仿或己離。
【专利摘要】本发明公开一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，包括如下步骤：将5-羧基罗丹明和6-羧基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液，一定温度下超声分散后获得样品溶液；制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止；将步骤（1）的样品溶液加到样品孔中，控制一定的电场强度，对凝胶板通电进行电泳，当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳。取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离，分别将两个胶带研磨后用有机溶剂萃取，即可分别得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物、6-羧基罗丹明化合物。具有简单、方便、经济等特点。
【IPC分类】C25B7-00
【公开号】CN104593813
【申请号】CN201510078343
【发明人】高勇, 余喜娣, 付妹, 张晓伟, 汪军
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月13日