重组血小板胶原受体糖蛋白vi及其药用的制作方法

专利名称：重组血小板胶原受体糖蛋白vi及其药用的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖蛋白VI(GPVI)、其分离、纯化以及重组生产方法。特别是，本发明涉及GPVI，优选地重组GPVI的用途，其用于治疗与血液凝固紊乱直接或间接相关的紊乱和病理事件(如血栓和心血管疾病)。胞外重组蛋白质也可用于建立筛选鉴定法，以找到膜结合GPVI潜在的抑制剂，目的在于抑制血小板与胶原的相互作用。血小板在体内生存期间，位于血小板表面的GPVI被修饰，因此其可用作血小板年龄曲线的标记。
糖蛋白VI为62/65kDa(分别为非还原的/还原的)血小板膜糖蛋白，其与Fcγ共同亚基一同形成复合体。GPVI亚基包含胶原结合位点，Fcγ亚基负责信号传递。该复合体形成了血小板表面的主要胶原受体之一，对应答胶原所致血小板活化是关键的。胶原上的识别序列由(GlyProHyp)n序列组成。具有GPVI遗传缺陷的患者公知来自日本。他们有轻度的出血问题，并且他们的血小板对胶原只有弱反应，可能是通过其它受体进行的。对起源于GPVI的信号传递级联放大已有许多了解，其非常类似于那些免疫受体，包括T-细胞受体、B-细胞受体和天然杀伤细胞受体。这些级联包括src家族酪氨酸激酶，如Fyn、Lyn以及p72SYK和许多其它的酪氨酸激酶、磷酸酶、衔接蛋白质(如LAT)。这些级联的一个主要目标是活化磷脂酶Cγ2，其将磷脂断裂开，产生第二信使二酰甘油和IP3。GPVI被认为参与了血小板整合蛋白α2β1的活化，其在血小板与受损血管壁的粘附中起主要作用。“敲除”Fcγ亚基的小鼠具有仍显示可与胶原反应的血小板，暗示休眠状态的α2β1也可被GPVI/Fcγ复合体调节。血小板胶原受体GPVI与p58KAR家族的天然杀伤激活受体以及FcαR紧密相关。
休眠的、循环血小板在血管损伤处的粘附和活化是导致血栓形成过程的第一步，其可转换为止血栓。胶原是血管壁负责血小板活化的主要成分之一。存在许多类型的胶原，在内皮下层发现了其中7种。在血小板上已确定了一些不同的胶原受体，但目前认为主要的胶原受体为整合蛋白α2β1和非整合蛋白GPVI。虽然对α2β1的特性有充分了解，并且几年前就对两个亚基进行了克隆及序列测定，但对GPVI的结构仍然不清楚，尽管对其一些特性已经确定。大约二十年前已确定GPVI是一个主要的血小板糖蛋白，其分子量在60-65kDa范围内，具酸性pI。它作为推定的胶原受体的角色是通过在日本鉴定的一位轻度出血紊乱患者而建立，该患者的血小板显示对胶原反应的特异性缺陷，并且缺乏这个受体。该患者也产生了针对缺陷受体的自身抗体，它们被用来进一步表征该分子的特性。最近确定了GPVI与共同的Fcγ亚基非共价地结合，后者作为复合体的信号传递部分而起作用。也阐明了胶原上的GPVI识别序列为位于胶原三联螺旋结构内的重复Gly-Pro-Hyp三联体，并且基于此结构合成的肽可用作特异的GPVI导向的激动剂。GPVI/Fcγ复合体通过免疫受体样机制，将信号传递至血小板内部，该机制包括p72sYK的活化和通过激酶/磷酸酶/衔接蛋白质相互作用的级联，导致PLCγ2的活化，且因此释放颗粒和血小板聚集。进一步表征该分子特性的步骤是证实来自响尾蛇属(Crotalus)durissus terrificus热带响尾蛇的蛇C-型凝集素convulxin可以活化血小板，其通过多聚体的相互作用，使GPVI聚集而活化血小板。convulxin显示出特异地结合GPVI，提供了一种与已建立的方法相结合纯化该受体的方法。
因此，从现有技术很清楚在许多治疗领域GPVI似乎是一种很让人感兴趣的化合物，尤其是关于直接或间接涉及依赖胶原-血小板相互作用的血液凝固事件的应用。因此本发明的目的是以重组体形式提供GPVI，并且显示它作为直接治疗目标或者作为筛选短化合物之工具的有效性，其中的短化合物特别是那些有能力抑制或阻断天然血小板-胶原相互作用的已化学合成的或者可化学合成的化合物。
本发明也涉及GPVI蛋白质的部分或片段，其保持了它们与胶原结合的生物活性。
本发明成功地纯化了足量的GPVI用于初步的表征和肽序列的测定。该序列用于设计PCR引物，以确定在DNA文库中的阳性序列。这个DNA序列然后用作探针，从该文库中分离接近全长的eDNA序列，并且从血小板cDNA文库中用RACE法获得缺失的5’序列。
本发明也成功地显示了重组GPVI作为治疗上可应用的化合物的用途，将它施与例如具有损伤血小板的患者，以结合胶原，这样防止了具有膜结合GPVI的血小板与所述的胶原结合。
重组的GPVI可溶性胞外域包含胶原结合位点，并且能抑制由胶原引起的血小板活化。因此它能应用于对如下疾病的治疗，包括胶原引起的血小板活化增加(如动脉粥样硬化斑破裂)，疾病如不稳定型心绞痛，或应用在外科处理过程中(如经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA))，其中通过气囊导管充气重开动脉，引起血管壁的严重损伤，而且大量的血小板活化，往往导致后来血管的再闭合。与目前的处理方法相比较，重组GPVI片段的优点是它们在更早的阶段通过阻止或减少血小板活化而起作用，而不是通过抑制血小板活化后的事件(如GPIIb-IIIa拮抗剂引起的凝集)。这样，释放少量的血小板颗粒内含物(包括生长因子和趋化因子)，它们不仅参与伤口修复，而且参与通过平滑肌迁移的血管壁重塑以及吸引已知有助于动脉粥样硬化的巨噬细胞(如单核细胞)。也可使用人源化小鼠抗GPVI单克隆抗体的Fab片段，其以相似的作用阻断血小板表面的GPVI，具有与上面相似的应用。
根据本发明的重组GPVI也可用于胶原的结合测定，用来筛选能抑制该相互作用的小分子(例如组合文库)和用来开发治疗用化合物，所述化合物为胶原-血小板相互作用的抑制剂。通过合适的衍生化，将这些化合物制备为口服的。再者，主要目的是制备这样的化合物，其可减少GPVI-胶原相互作用和减少在血小板与胶原接触处的血小板活化。在本发明中使用的诸如此类的筛选技术在现有技术中已充分建立。通过这样的筛选测定，本发明可发现及开发新靶，其可作为胶原拮抗剂抑制血小板表面天然的膜结合GPVI。这些靶可以是小的化学分子，然后可以是进一步发明的基础。
GPVI和识别GPVI特定域的试剂另一个主要应用是作为血小板年龄和功能的标记。通常认为年幼的血小板比老的血小板更富有活性和功能。年幼的血小板与对GPVI特异的蛇毒液C-型凝集素convulxin结合，并且被活化，并且随着血小板老化，结合及活化程度均降低。这是因为GPVI蛋白水解的变化或构象的变化，或是因为在循环中血小板的活化或损伤导致它与Fcγ的结合改变。这是一个测定患者和在医学对照期间正常人体内血小板年龄及功能曲线的有用参数。在许多影响骨髓或免疫系统的疾病中血小板年龄曲线会改变，并且如果能得到用于测定它的较好方法，它可以是一个重要的诊断标准。例如，患者患有增加的血小板更新的疾病将会显示较多的年幼血小板；而进行化疗或辐射治疗的患者显示稳定的衰老群体。这样，这个年龄曲线可用于对治疗的精确监测。在正常健康人群中，对年龄曲线分布及它作为健康改变预测信号的角色知之甚少，不知道GPVI的变化是否是因为血小板部分参与了止血事件，也不知道在广泛的心血管疾病患者体内，其变化是否会更显著。目前，噻唑橙用于检测含mRNA的年幼循环血小板，该mRNA不久就衰变，限制了该方法只能用于最年幼的血小板。可用于此测定的试剂包括GPVI-特异性蛇毒液蛋白质(如convulxin)、或识别GPVI之N-末端区的单克隆或多克隆抗体、或识别N-末端区水解后暴露出的新位点或构象的单克隆抗体、或存在于完整分子而不存在于已老化血小板的特异构象(或反之亦然)、或选择特异地识别完整GPVI或其修饰形式的小的化学分子。这些试剂可用荧光素标志标记、或与荧光素标记的二级抗体或亲和试剂一起，用于流式细胞术以测定血小板结合曲线。另外，在后一阶段，可采用基于自动测量血小板曲线的低劳动强度的测量技术。使用流式细胞术的细胞分选法或磁珠，能分离年幼的和老的血小板，以检测参与从循环中去除老的血小板的因子。识别GPVI特异形式的试剂是这类研究的一个关键。
因此，本发明的目的是提供编码糖蛋白VI或其生物活性片段的DNA，特别是图2的序列。
本发明进一步的目的提供编码糖蛋白VI的DNA，其中糖蛋白VI包含

图1a和1b的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供药物组合物，其包含重组GPVI及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂，以及其在生产用于血栓和心血管事件和涉及血小板-胶原相互作用紊乱的治疗领域的药物中的用途。
本发明的另一个目的是重组GPVI的用途，其可用在检测血小板-胶原相互作用的特异性抑制剂的筛选工具中。
本发明的另一个目的是GPVI作为血小板年龄和血小板暴露于心血管疾病的标记的用途。
可能的医学指征及应用分别是例如，不稳定型胸部心绞痛、PTCA、在这个领域中斯滕特固定模的使用、冠状血管手术、血管的一般手术、可损坏大血管的手术(如髋关节手术)。而且，包括所有的指征，其涉及血管壁和凝固系统相互作用之紊乱引起的血栓事件，具有形成血栓症并堵塞血管的高风险性。
如上所述，根据本发明的GPVI蛋白质及其片段在药学组合物及其结合物中适于作为药学有效化合物。
根据本发明的药物制剂任选地可包含额外的活性成分，像抗凝剂(如蛭素或肝素)，或血栓溶解剂(如纤溶酶原激活物或hementin)，或其它血小板受体拮抗剂(如GPIIb-IIIa拮抗剂，像abciximab或eptifbatide)，或ADP-受体拮抗剂(如clopidogrel)。
根据本发明的新蛋白质及其生物活性片段分别可与任一非毒性的、有机酸或无机酸形成药学可接受的盐。无机酸例如盐酸、溴化氢、硫酸或磷酸以及酸性金属盐，如正磷酸单氢钠和硫酸氢钾。有机酸的实例为单、二、三羧酸，如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、苯丙烯酸、水杨酸和磺酸(如甲磺酸)。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任一合适的无机或有机碱形成的非毒性羧酸盐。这些盐包括例如，碱金属(如钠和钾)、碱土金属(如钙和镁)、IIIA组的轻金属，包括铝，以及有机伯、仲、叔胺，如三烷基胺，包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、1-亚乙基胺(1-ethenamine)、N，N′-二苄乙烯二胺、二羟基二乙胺(dihydroabietylamine)和N-烷基哌啶。
此处所用术语“药学可接受的载体”指惰性、非毒性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，不与活性化合物或病人发生不利反应。合适的、优选的液体载体为本领域公知，如无菌水、盐水、含水葡萄糖、糖溶液、乙醇、乙二醇和油，包括来源于石油、动物、蔬菜或合成的油，例如花生油、大豆油和矿物油。
根据本发明的制剂可以单位剂量施用，其包括常规的非毒性药学可接受的载体、稀释剂、佐剂及载体，通常肠胃外施用。
术语“肠胃外的”此处包括皮下、静脉内、关节内及气管内注射和输液技术。其它施用途径如经口施用和局部涂药也是适用的。肠胃外的组合物和结合物最优选的是以大丸剂形式(bolus)或根据公知的步骤连续输入的形式静脉内施用。经口施用的片剂和胶囊包含常规的赋形剂，如结合剂、填充剂、稀释剂、成片剂、润滑剂、崩解剂及湿润剂。根据本领域公知的方法包被片剂。
口服液体制备物可为水性或油性悬液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂形式，也可以干产物呈现，临用前用水或其它合适的载体重建。这样的液体制备物可包含常规的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水性载体及防腐剂。
局部涂药可为水性或油性悬液、溶液、乳剂、胶冻剂或者优选地乳膏。
根据本发明的单位剂量可包含根据本发明的蛋白质之每日需要量，或由多个亚剂量构成所需剂量。对给定的患者(哺乳类动物，包括人)最佳治疗可接受剂量及剂量率依赖于许多因素，例如所使用的特定活性物质的活性、患者年龄、体重、综合健康状况、性别、饮食、施用时间及途径、清除率、治疗目的，即治疗或预防，以及欲治疗的血栓疾病的性质、抗血小板或抗凝活性。
在用作抗凝剂的组合物和结合物中，本发明的肽对所治疗的患者(体内)之药学有效日剂量约在0.01至100mg/kg体重之间，优选地在0.1至10mg/kg体重之间。根据应用的形式，单一剂量可包含0.5至10mg的胶原抑制剂。为达到对体外血的抗凝固效果，本发明肽的药学有效量在0.2至150mg/l之间，优选地在1mg至20mg/l体外血之间。
附图简述图1GPVI的蛋白质序列(单字母代码)1a前导序列1b成熟蛋白质开放读码框339个氨基酸星号糖基化位点双下划线跨膜结构域下划线已测序的肽图2GPVI核苷酸序列，其覆盖开放读码框1017bp，加上3′和5′区，总共1249bp。
发明详述为了用PCR扩增GPVI cDNA之一部分，选择了两个序列用于合成DNA引物，其中这两个序列为显示遗传密码的最小简并性的7个氨基酸。由于对这两个肽在蛋白质中的定位全然不知，对它们中的每一个均制备了两条简并引物，一条有义，一条反义。用这些引物扩增人骨髓文库。有义5’TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3’引物(编码序列PAMKRSL)与反义5’TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3’引物(对应于DQFALYK)联合使用，扩增了221bp的DNA片段。除了所选择的肽外，扩增的DNA编码LysC/AspN肽DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS，清楚地将该序列连接至GPVI的cDNA。
用221bp的DNA片段筛选来自骨髓文库的600,000pfu，产生4个阳性pfu。有三个具1350bp的插入片段，其被限制性酶Sal I或EcoR I切割或未切割且属于IgG超家族。第四个经Sal I消化，具有4.6kb插入片段，并且当用EcoR I处理时，分别产生2300bp和1300bp两个片段。其DNA编码10肽序列，后者源于GPVI的氨基酸序列，但终止于氨基酸末端前。没有找到起始的甲硫氨酸或前导序列，但存在超过2000bp的以前已测序的非读码框DNA，其以Alu序列终止、DNA。用位于已通过肽序列确证的GPVI序列部分的引物，对血小板多聚A RNA进行5’末端RACE实验。在后退至已确定的GPVI序列之前，发现了一个348bp的片段，其包括第四个克隆中的278bp序列和70bp的新序列(从1987bp开始)对应于14个氨基酸(包括第一个甲硫氨酸)。这样可测序得到cDNA，总共包含1249bp，为起始密码子上游5’序列25bp，开放读码框1017bp，编码包括前导序列的蛋白质，共339个氨基酸，以及包含终止密码子的3’区207bp。
从人骨髓cDNA文库克隆，并测序编码血小板GPVI的cDNA以提供缺失的5’端序列，方法是用RACE法及血小板mRNA。1017bp的开放读码框编码339个氨基酸以及非翻译的3’区。氨基酸序列的疏水性分析显示存在两个推定的跨膜域，一个为推定的20个氨基酸的信号序列，一个为位于成熟蛋白质的247和265残基之间的19个氨基酸域。序列及其氨基酸翻译如图2及图1所示。与检索GenBank找到的最相似分子之氨基酸序列比较清楚地显示出它属于免疫球蛋白超家族，并且胞外区包含两个Ig C2-域的环，其由两个二硫桥形成。它是一个跨膜蛋白一类分子，其氨基末端在外且跨膜一次。最密切相关的分子属于天然杀伤受体类，其包含抑制及活化类型。GPVI清楚地属于活化亚类，不仅通过其功能，而且因为其不像抑制类型，在它的胞质区不包含ITIM序列。它也不包含任一可能参与磷酸化作用的酪氨酸残基。在此域中有一些苏氨酸和丝氨酸残基，但是它们不与任一激酶共有序列标准相匹配。像NK受体的活化类，GPVI包含一个精氨酸残基作为跨膜区的第三个氨基酸，其参加与Fcγ亚基的复合体形成。胞质区包含51个氨基酸，与此家族其它成员的胞质域仅显示小的相似性(在紧靠膜下区)。这暗示了GPVI的这个结构域可能与胞质分子的不同类型相关，而不与其它家族成员相关。GPVI只包含单一的推定N-糖基化位点，在Asn69。但是此结构域(其紧挨着膜，在Ig区结束的β片层之后)富含苏氨酸和丝氨酸残基，其可提供O-糖基化位点，如在GPIbα和GPV中发现的一样。此O-糖基化位点的主要功能似乎是提供从血小板表面充分延伸的受体结构，从而促进其庞大的配基间的相互作用。由于GPVI早期作为唾液酸糖蛋白建立的，理论的氨基酸分子量(37kDa)与凝胶电泳所测定的分子量(65kDa)之间的差异可能是因为这个糖基化作用。
天然杀伤受体的这两域类型的结构已通过X射线结晶学研究建立，显示这两个Ig域与带有肽的HLA抗原之受体位点(位于肘部外侧)形成锐角。HLA肽结合位点结构与胶原结构的直接比较立即暗示出为什么这些受体有共同起源，因为HLA结合位点及其包含肽的多重α螺旋结构与胶原的三联螺旋结构非常相似。天然杀伤受体据推论通过两个受体的二聚体化发挥作用，所述受体识别正被天然杀伤细胞考察的细胞上两个分开的HLA位点。可能此二聚体化是活化或去活化机制的一部分，这取决于受体类型。在是GPVI的情况下，也存在两个GPVI分子与一个Fcγ相结合的可能性，因为Fcγ二聚体的每一个单体均具有识别序列。但还不知道该化学计量，基于胶原的结构和通过GPVI和convulxin发挥作用的胶原样肽的结构，似乎信号的强度与聚集在一起的GPVI/Fcγ复合体的数量相关。属于此Ig家族的其它血小板受体包括ICAM-2(CD102)和PECAM(CD31)。
在描述中提及的、与申请专利的本发明不直接相关的所有微生物、细胞系、表达系统、表达宿主、质粒、启动子、抗性标记、复制起点、限制性位点或者载体的其它片段或部分通常可通过商业或其它途径得到。只要没有给出其它暗示，它们只用作实例，并且对本发明而言不是必需的，并且分别可被其它适合的工具和生物材料替代。
根据本发明必需的技术在下面及上面进行详述。其它未详述的技术对应于公知的标准方法，本领域技术人员对此熟知，或者在所引用的参考文献及专利申请和标准文献中较详细地进行了描述(如Sambrook等人，1989，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor)；Harlow，Lane，1988，抗体实验室手册，冷泉港(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor))。
实施例实施例1材料—蛋白质A-Sepharose，过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠和抗-兔抗体、牛血清白蛋白、响尾蛇属(Crotalus)durissusterrifcus毒液、麦胚凝集素(WGA)、氯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的交联4％珠状琼脂糖和Triton X-114来自Sigma ChemicalCo.(圣路易斯，MO)，辛酰基-N-甲基-葡糖胺(ONMG)和壬酰基-N-甲基-葡糖胺(NNMG)来自Oxyl Chemie(Bobingen，德国)。
实施例2从血小板分离GPVI-如以前所述从血小板分离膜糖蛋白质。简而言之，洗血小板(来自40个血沉的棕黄层)并且在蛋白酶抑制剂存在时于2％Triton X-114中裂解。分离Triton X-114和水相，去污剂相上样于麦胚凝集素与Sepharose 4B偶联的柱上。用10mMTris HCl，pH 7.4、30mM NaCl、0.2％辛酰基-N-甲基葡糖胺(ONMG)和2％N-乙酰葡萄糖胺洗脱血小板糖蛋白。透析和浓缩后，糖蛋白溶液上样于柱上，该柱为convulxin与p-硝基氯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯的交联4％珠状琼脂糖(1mg/ml)连接。用四倍体积的10mM TrisHCl，pH 7.4、30mM NaCl、0.2％壬酰基-N-甲基葡糖胺(NNMG)洗，然后用四倍体积的10mM Tris HCl，pH 7.4、30mM NaCl和2％NNMG洗。用0.08％SDS(溶于10mM Tris HCl，pH 7.4)洗脱GPVI。将溶液浓缩并上样至8.5％聚丙烯酰胺的制备型凝胶，使用Model 491 PreCell(BioRad，CA)。按照厂商的指导，在非还原条件下进行制备电泳。GPVI在65kDa处作为单一条带洗脱。级分混合，用Centricon-30(Amicon，Beverly，MA)浓缩并重悬于10mM Tris HCl，pH 7.4和0.1％ONMG。
实施例3GPVI的氨基酸分析—用内切蛋白酶LysC和AspN(Boehringer Mannheim，德国)消化GPVI。通过反相HPLC分离产生的10肽，用Applied Biosystem模式477A脉冲-液相蛋白质测序仪进行测序，其带有120A型联机乙内酰苯硫脲氨基酸分析器。
实施例4从λgt11 cDNA文库中扩增编码部分GPVI的221bp片段—来自人骨髓文库(Clonetech，Palo Alto，CA)的样本(1010pfu)(噬斑形成单位)用四条简并引物中的两组合扩增。最终引物浓度为2μM，dNTP浓度为200μM，每100μl的反应使用2U AmpliTaqGold(Perkin Elmer，Rotkreuz，瑞士)。PCR条件为37℃，5个循环，然后44℃，30个循环。正向19mer 5′TYATHCCNGCNATGAARMG3′及反向20mer 5′TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3′扩增了221bp片段，其被亚克隆至BluescriptKS+(Stratagene，LaJolla，CA)，用T7 Sequence试剂盒(Amersham，瑞士)测序。
实施例5用221bp GPVI探针筛选λgt11 cDNA文库-从质粒上切下该221bp片段，洗净并用High Prime Labelling试剂盒(Boehringer Mannheim， 瑞士)标记α32P-ATP(20MBq/50μl，Hartmann Analytik，Braunschweig，德国)。按照厂商的说明书筛选人骨髓文库。阳性噬菌体生长，分离其DNA，并且用EcoR I或Sal I位点亚克隆至BlueScript并测序。用RACE的ABS系统进行测序，如前所述制备血小板poly A RNA(Power等人，细胞因子(Cytokine)7，479-482，1995)。用5μg poly A RNA、引物 5′TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3′(20μM)、dNTP(1mM)、RNAsin(40U)、1×AMV缓冲液和20U AMV反转录酶反转录(30μl)，45℃，20分钟，然后52℃，20分钟。反应混合液用2μl6N NaOH于65℃处理30分钟，用2μl6N乙酸中和，Centricon 30(Amicon)浓缩。根据Aptes和Siebert的方法(生物技术(BioTechniques)15890-893，1993)将锚连接至第一链DNA。用与锚互补的引物和引物5′TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3′(35个循环，55℃)，然后用引物5′GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3′(30个循环，53℃)进行巢式PCR。通过琼脂糖电泳将最高的条带(350bp)与较低的条带分离开，亚克隆至BlueScript，测序。
实施例6制备抗GPVIFab和F(ab′)2-用兔产生抗人GPVI多克隆抗血清。来自兔抗-GPVI抗血清的IgG如所述纯化。根据供应商提供的标准方法，用固定化木瓜蛋白酶(Pierce)消化IgG，产生Fab片段。用固定化蛋白质A(Sigma)柱将Fab片段与未被消化的IgG和Fc片段分离。流出物转移至透析管，用固体聚乙二醇20,000浓缩，用20mMHepes、140mM NaCl、4mM KCl，pH7.4充分透析，并且在使用前贮存在4℃。用胃蛋白酶消化IgG制备F(ab′)2片段，酶与底物比例(w/w)为1∶50，用0.5M乙酸盐缓冲液，pH4.0，37℃反应18小时。用稀释的NaOH校正pH至7.4。样品用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)透析。用蛋白质A层析法将F(ab′)2片段与未被消化的IgG和Fc片段分离。流出物转移至透析管，用固体聚乙二醇20,000浓缩，用20mM Hepes、140mM NaCl、4mM KCl，pH7.4充分透析，并且分装，贮存在-20℃。洗过的血小板用Triton X-114裂解，对可溶物质进行相的分离，然后如前所述用麦胚凝集素-Sepharose 4B亲和层析，分离与Triton X-114相结合的膜糖蛋白质。由于GPVI代表血小板膜糖蛋白库的很小一部分，我们使用了蛇C-型凝集素convulxin的特异性分离这个受体。偶联Sepharose 4B的Convulxin亲和层析产生的主要产物为65kDa蛋白质。但是，较高和较低Mr的未表征的物质与GPVI共洗脱下来，不能通过对柱的充分洗脱而去除。加入用8.5％聚丙烯酰胺的制备型凝胶电泳步骤作为纯化的最后一步。合并含有GPVI的级分，再次分析显示单一条带。测试纯化的GPVI阻断血小板通过胶原的聚集能力。将等份的GPVI溶液加入血小板悬液，可观察到轻微的抑制效应。但在向血小板悬液加入该混合物前，将GPVI与胶原预孵育，则可以剂量依赖方式抑制凝集。当加入新鲜的胶原时，这些血小板仍然聚集。在非还原条件下，分离的蛋白质具有62kDa的分子量(Mr)，在还原条件下，向稍微高的分子量(65kDa)移动。由于发现GPVI的氨基末端被封闭，用酶LysC和LysC/AspN消化该蛋白质分别产生4和6肽，从中可获得序列。在C4柱上用反向HPLC分离这些肽，用Edman法测序。这些肽的氨基酸序列在翻译的cDNA序列中被下划线(图1)。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>重组血小板胶原受体糖蛋白VI及其药用<130>GlycoproteinVI-Merck<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1249<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(26)..(85)<223>Leader sequence<220><221>CDS<222>(86)..(1042)<223>mature GPVI protein<400>1gagctcagga cagggctgag gaacc atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc 52Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe1 5tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg cgt gtg cca gcg cag agt gga ccg ctc 100Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu10 15 20 25ccc aag ccc tcc ctc cag gct ctg ccc agc tcc ctg gtg ccc ctg gag 148Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu30 35 40aag cca gtg acc ctc cgg tgc cag gga cct ccg ggc gtg gac ctg tac 196Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr45 50 55cgc ctg gag aag ctg agt tcc agc agg tac cag gat cag gca gtc ctc 244Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu60 65 70ttc atc ccg gcc atg aag aga agt ctg gct gga cgc tac cgc tgc tcc 292Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser75 80 85tac cag aac gga agc ctc tgg tcc ctg ccc agc gac cag ctg gag ctc 340Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu90 95 100 105gtt gcc acg gga gtt ttt gcc aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc 388Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly110 115 120ccg gcg gtg tcg tca gga ggg gac gta acc cta cag tgt cag act cgg 436Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg125 130 135tat ggc ttt gac caa ttt gct ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc 484Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro140 145 150tac aag aat ccc gag aga tgg tac cgg gct agt ttc ccc atc atc acg 532Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr155 160 165gtg acc gcc gcc cac agc gga acc tac cga tgc tac agc ttc tcc agc 580Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser170 175 180 185agg gac cca tac ctg tgg tcg gcc ccc agc gac ccc ctg gag ctt gtg 628Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val190 195 200gtc aca gga acc tct gtg acc ccc agc cgg tta cca aca gaa cca cct 676Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro205 210 215tcc tcg gta gca gaa ttc tca gaa gcc acc gct gaa ctg acc gtc tca 724Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser220 225 230ttc aca aac aaa gtc ttc aca act gag act tct agg agt atc acc acc 772Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Thr235 240 245agt cca aag gag tca gac tct cca gct ggt cct gcc cgc cag tac tac 820Set Pro Lys Glu Set Asp Set Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr250 255 260 265acc aag ggc aac ctg gtc cgg ata tgc ctc ggg gct gtg atc cta ata 868Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile270 275 280atc ctg gcg ggg ttt ctg gca gag gac tgg cac agc cgg agg aag cgc 916Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp Trp His Set Arg Arg Lys Arg285 290 295ctg cgg cac agg ggc agg gct gtg cag agg ccg ctt ccg ccc ctg ccg 964Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro300 305 310ccc ctc ccg cag acc cgg aaa tca cac ggg ggt cag gat gga ggc cga 1012Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys Set His Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg315 320 325cag gat gtt cac agc cgc ggg tta tgt tca tgaccgctga accccaggca1062Gln Asp Val His Set Arg Gly Leu Cys Set330 335cggtcgtatc caagggaggg atcatggcat gggaggcgac tcaaagactg gcgtgtgtgg 1122agcgtggaag caggagggca gaggctacag ctgtggaaac gaggccatgc tgcctcctcc 1182tggtgttcca tcagggagcc gttcggccag tgtctgtctg tctgtctgcc tctctgtctg 1242agggcac 1249<210>2<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly1 5 10 15Arg Val Pro Ala20<210>3<211>319<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser1 5 10 15Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro20 25 30Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln35 40 45Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly50 55 60Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser65 70 75 80Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu85 90 95Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu100 105 110Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu115 120 125Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser130 135 140Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys145 150 155 160Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp165 170 175Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu180 185 190Pro Thr Glu Pro Pro Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala195 200 205Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser210 215 220Arg Ser Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro225 230 235 240Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly245 250 255Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp Trp His260 265 270Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln Arg Pro275 280 285Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys Ser His Gly Gly290 295 300Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser305 310 315<160>权利要求
1.DNA，其编码糖蛋白VI或其生物活性片段。
2.根据权利要求1的DNA，其包含部分或全部图2的序列。
3.DNA，其具有图2序列。
4.根据权利要求1-3的DNA，其编码包含图1a和1b氨基酸序列的糖蛋白VI。
5.作为药物的重组人糖蛋白VI，其包含图1b的氨基酸序列。
6.药物组合物，其包含权利要求5的蛋白质及制药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
7.药物组合物，其额外地包含药学活性化合物。
8.重组GPVI的用途，其用于检测血小板-胶原相互作用的特异性抑制剂的筛选工具中。
9.重组GPVI用于制造药物的用途，所述药物用在血栓和心血管疾病以及与血小板-胶原相互作用相关的紊乱的治疗领域中。
10.GPVI之改变的用途，其作为血小板年龄和与血栓性和心血管疾病或事件相关的血小板的标记。
全文摘要
本发明涉及糖蛋白VI(GPVI)、其分离、纯化以及重组生产的方法。特别是,本发明涉及GPVI,优选地重组GPVI的用途,其用于治疗与血液凝固紊乱(如血栓和心血管疾病)直接或间接相关的紊乱和病理事件。胞外重组蛋白质也可用于建立筛选鉴定法,以找到膜结合GPVI潜在的抑制剂,目的在于分别抑制凝血细胞与胶原和血小板与胶原的结合。GPVI的变化可用于监测血小板年龄以及暴露于血栓和心血管疾病的情况。
文档编号G01N33/53GK1350583SQ00807292
公开日2002年5月22日 申请日期2000年4月25日 优先权日1999年5月7日
发明者K·J·克莱米特森 申请人:默克专利股份有限公司