专利名称：二十二碳六烯酸作为维甲酸x受体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及维甲酸X受体，下文称作“RXR”。更具体地说，本发明涉及维甲酸X(retinoid x)受体的配体的识别以及与该识别相关的内容。
背景和现有技术核受体(NR)超家族含有150种以上不同的蛋白质，确信它们之中大部分具有配体激活的转录因子功能，这些转录因子通过调节基因表达而产生广泛的不同的生物学效应(参见Di Croce等EMBO J 186201-6210(1999)；Mangelsdorf等Cell 83825-839(1995)；Perlmann等，Cell 90391-397(1997))。该家族的成员包括针对内源性亲脂小分子的受体，比如类固醇激素受体、维甲酸受体、维生素D受体、甲状腺激素受体。此外，该家族的许多成员缺少已知配体，因而被称作“孤儿受体”(参见Gigère等，Endocrine Rev 20689-725(1999)；Kastner，Cell 83859-869(1995))。
最近几年，已经识别了针对一些孤儿受体的小分子亲脂性配体和激活剂，从而导致对这一领域更新的认识，而这一认识将带来深远的影响。这些研究成果大大增强了人们对内分泌学以及相关疾病的了解(Forman等Cell81687-693(1997)；Xu等，Mlo.Cell 3397-403(1999)；Makashima等，Science2841362-1365(1999)；Parks等，Science 2841365-1368(1999)；Wang等，MolCell 3543-553(1999)；Janowski等，Nature 383728-731(1996)；Kliewer等，Cell9273-82(1998)；Blumberg等，Genes Dev.123195-3205(1998))。然而，大部分孤儿受体的配体及其生物学功能仍有待阐明，使得通过鉴定新的核受体内源性配体来弄清此前尚未鉴定的信号传导途径之重要性变得很重要(参见Mangelsdorf等Cell 83841-850(1995)；Giguère等，如上)。
维甲酸X受体(RXR)由维生素A代谢物9-顺式视黄酸激活，该代谢物以高亲和力结合RXR配体结合域。此外，RXR与包括视黄酸受体(RAR)及一些孤儿受体在内的很多种核受体形成异源二聚体。正如基因敲除(geneabalation)实验所显示的，RXR对于胚胎发育是必要的。此外，突变小鼠的遗传分析显示出RXR在成人，比如在成人中枢神经系统方面具有重要功能。
长期以来一直认为，膳食脂肪酸对于正常生长、发育是必不可少的，可作为能量源、膜成分、以及作为必需的脂代谢物的前体(Salem等，In HealthEffects of Polyunsaturated Fatty Acids in Seafoods(1986)；Neuringer等，AnnRev Nutr 8517-541(1998)；Horrocks等，Pharmacological Res 40211-225(1999)；Xiang and Zetterstrm，Acta Paediatr 8878-82(1999))。脂肪酸被分为“非必需”脂肪酸和“必需”脂肪酸。必需脂肪酸不能在人体内合成，必须通过膳食摄取。这些包括亚油酸(182n-6)，α-亚麻酸(183n-3)以及它们的延长和非饱和产物花生四烯酸(204n-6)，二十二碳六烯酸(DHA；226n-3)。(脂肪酸命名参见Neuringer等的描述，文献同上)。花生四烯酸是二十碳酸化合物的主要前体，这是一个包括前列腺素、前列环素、白三烯、羟基脂肪酸等生物活性因子的大家族。这些代谢物作为细胞内和细胞间的化学递质而发挥作用，并且还显示出调节离子运输、激素分泌和免疫应答的功能。令人感兴趣的是，体内一些花生四稀酸代谢物及其它一些脂肪酸显示出能作为过氧化物酶体增生剂激活的受体的配体，这表明它们在体内核受体信号级联反应中具有递质的作用。
与花生四稀酸代谢物相比，DHA的作用机制尚不清楚。令人感兴趣的是，DHA在出生后的哺乳动物CNS中高水平的积累表明DHA参与了CNS的成熟过程和/或神经学过程。值得注意的是，DNA缺陷将导致人的神经异常和学习能力的丧失(参见Gamoh等Neurosci93237-241(1999)；Femstrom，Lipids 34161-169(1999)；Sheaff Greiner等Lipids Suppl 34239-243(1999))。并且，膳食DHA对于治疗动脉粥样硬化、炎症和癌症都是有益的(Horrocks等Pharmacol Res 40211-225(1999)；Rose等，Pharmacol Theraput 83217-244(1999))。
目前可以肯定的是DHA具有作为RXR配体的功能，正如这里所阐明的，DHA可以以完整或部分的形式通过激活RXR而表现其生物学活性。这种途径在现有技术中没有提及，它是本发明的特征，在此详细阐述。
附图简述
图1A和1B显示经鼠外植体生长过的条件培养基对GAL 4-RAR和GAL4-RXR构建体的激活具有发育阶段特异性。
图2提供了经不同组织生长过的条件培养基激活效果的比较数据。
图3A和3B分别显示不同多不饱和脂肪酸以及它们对RXR激活效果的比较结果(3A)、不同浓度和它们的效果的比较结果(3B)。
图4显示使用二十二碳六烯酸进行蛋白结合研究的结果。
优选实施例的详述实施例1本实施例所述实验旨在确定体内内源维甲酸受体配体的存在。为达到这一目的，使用UAS萤光素酶报告基因构建体和表达载体共转染来源于人绒毛膜癌细胞系JEG-3的细胞。表达载体可以是pCMX-GAL4-RAR或pCMX-GAL4-RXR。表达载体包含一种编码酵母GAL4结合域(氨基酸l-147)的构建体，并与人RAR或人RXR的配体结合域共处一个阅读框内。按照引入本文作参考的Perlmann等，Genes Dev 9769-782(1995)所描述的磷酸钙法在24孔板上进行三份平行转染。每孔使用100ng UAS萤光素酶报告基因构建体，100ng表达质粒，200ng参考质粒，即含有细菌β-半乳糖苷酸酶基因的pCMX-βGal进行转染。培养细胞，转染之后6-8小时，加入含10％活性炭剥离的胎牛血清，1％青霉素/链霉素以及1％L-谷氨酰胺的新鲜培养基以及小鼠组织外植体，其解释如下小鼠组织外植体为本研究提供了潜在的内源配体源。为达到此目的，对成年野生型NMRI小鼠经其升主动脉灌注冷磷酸盐缓冲液以移走血管中的血液。解剖器官，并用剪刀剪成小块，放入极限必需培养基中，采用同样的方式从野生型胚胎(E13.5)中收集胚胎组织。然后或将组织直接放到转染细胞上或在培养基中温育37℃过夜。然后将条件培养基同组织分开，等份后冷冻，直至对转染细胞进行分析。结果如图1所示。
研究发现胚胎CNS包含能激活RAR的配体，即E13.5。如图1A所示，经胚胎脊索和脑生长过的条件培养基都能激活GAL4-RAR但是不激活GAL4-RXR。值得注意的是，使用成人CNS组织获得如图1B所示的相反结果。比如，由8周龄鼠脑组织生长过的条件培养基激活了GAL4-RXR，而仅适度增加了GAL4-RAR的活性。
实施例2RXR是许多核受体共同的异源二聚体配偶体，以下实验旨在确定经成人脑生长过的条件培养基是直接激活RXR配体结合域，还是激活在被转染的JEG-3细胞中表达的RXR异源二聚化配偶体。
实验使用编码受体Nurr-1的配体结合域的构建体，该受体是与RXR异源二聚化的孤儿核受体。RXR是RXR-Nurr-1异源二聚体可以接受的异源二聚化配偶体，在这类复合体中可以被配体有效地激活。
与上述平行的构建体即pCMX-GAL4-NURR1用于作饵，与存在于构建体pCMX-RXR中的野生型RXR在细胞JEG-3中共同表达。如上所述的分析方法同样用于本次分析。GAL4-NURR1或RXR表达载体同UAS萤光素酶报告质粒共转染，在脑组织生长过的条件培养基作用下被有效激活。相比之下，当野生型RXR没有同GAL4-NURR载体共转染时，只能观察到适度的激活作用，推测这是在过表达的GAL4-NURR1和外源RXR之间的异源二聚化所导致的结果。这些数据表明RXR是成人脑所产生的激活作用的直接激活目标。
进行其它实验以检测经源自外周组织的外植体生长过的条件培养基激活GAL4-NURR1/RXR的效果。结果如图2所示。经睾丸和心脏生长过的培养基激活了报告基因250-300倍，在源自脾、肾和肺的CM中表现出中度激活。经脑生长过的条件培养基对报告基因的激活程度最高。这些结果提示使用经成人脑和中枢神经系统生长过的条件培养基进行下述实验。
当对成人中枢神经系统组织进行研究时，经海马回生长过的条件培养基同经其它组织如纹状体、运动皮层、小脑以及脊索组织生长过的条件培养基相比较表现出最强的信号。不过，如图2所示，上述所有组织中都观察到活性，表明RXR激活因子在脑内广泛分布。
实施例3本实验描述了在分离配体方面的其它工作。经脑生长过的条件培养基与等体积的己烷混合，强烈震荡5分钟。混合物以12000rpm离心10分钟以分相。分相之后，将上层相移至一干净管中。重复抽提水相，集中两次所得有机相。随后，己烷抽提物在氮气下蒸发。残余物在小量纯乙醇中重新溶解并如上所述进行检测。
在平行试验中，使用盐酸预处理培养基，结果显示，使用盐酸预处理提高了产量，表明活性物质是亲脂性的带负电荷的分子。
实施例4
进一步的实验用于纯化活性成分至均一。具体地说，蒸发除去条件培养基中的己烷抽体物，残余物重新溶解在200ml己烷中。样品(150ml)注射至标准相HPLC柱上，使用从己烷到己烷/二氯甲烷/异丙醇(85∶10∶5v/v)的线性梯度(这两种洗脱液都含有1％的乙酸)，以0.5ml/min的流率洗脱30分钟。注入样品17分钟后收集30个级份，每一级份包含样品0.25ml。这些级份通过如上所述方法进行分析。集中活性级份、蒸发至干燥，重新溶解在50μl、80％甲烷中，将其中30μl的样品注入到反相HPLC柱上。流动相甲烷/异丙醇/水(80∶10∶10v/v)含有1％乙酸，以0.3ml/min的速率流动。使用如上所述方法在被转染的JEG-3细胞中对等样式份进行检测。
使用电喷射质谱学分析活性级份，结果显示活性分子具有化学结构式C22H31O2。假设该分子是去质子化离子，因此活性化合物的结构式为C22H32O2。这正是二十二碳六烯酸的结构式。顺4，7，10，13，16，19-DHA的[M-H]-离子碰撞诱导解离光谱与上述活性级份有相当大的相似性，就此得出结论上述活性分子是顺4，7，10，13，16，19-DHA。
实施例5鉴于如上所示结果，对各种多不饱和脂肪酸进行了检测，以确定在用GAL4-Nurr1和RXR表达载体共转染细胞中，它们是否激活了报告基因。具体的，取每种多不饱和脂肪酸各20μM加入到细胞中，如上所述方法检测活性。受到检测的多不饱和脂肪酸为亚油酸(18∶2)，亚麻酸(18∶3)，花生四烯酸(20∶4)，二十一碳二烯酸(21∶2)，山嵛酸(22∶0)，二十二碳二烯酸(22∶2)，二十二碳三烯酸(22∶3)，二十二碳四烯酸(22∶4)，二十二碳五烯酸(22∶5)，二十二碳六烯酸(22∶6)，甲基化二十二碳六烯酸(22∶6met)。
结果如图3A所示，并显示出当其它被检测的分子表现为中度活性时，二十二碳六烯酸显示出强烈的激活活性。
在接下来的实验中，改变用于检测的DHA、亚油酸、亚麻酸、油酸的浓度(1μM到250μM)。实验结果如图3B中显示，表示为经标准化后的倍数诱导并与β-半乳糖苷酸酶对照进行比较，这些后续实验表明DHA是最有效的激活剂，它的EC50为约30μM。
实施例6本实验旨在确定DHA是否借助配体与RXR的配体结合域的直接结合而发挥其作用。已知配体激活的核受体与辅激活物结合，辅激活物包括称之为SRC-1的分子。要实现该目的，人RXR和鼠ER的配体结合域作为GST融合蛋白在大肠杆菌中表达，按照Cavailles等Proc.Nat.Acad.Sci USA91(21)10009-13(1994)结合到谷胱苷肽-Sepharose珠上，而基于含SRC-lecDNA的Psa5的构建体被用于通过市售系统产生[35S]甲硫氨酸标记蛋白。标记的SRC-1蛋白与被GST或GST融合蛋白标记的珠，在DMSO、1μM雌二醇或DHA存在下，以不同的浓度，在NETN缓冲液(0.5％NP-40，20mM Tris-HCL，pH8.0，100mM Nacl，1mM EDTA)以及蛋白酶抑制剂中共同温育。混合物温育过夜，用NETN缓冲液将游离蛋白从珠上洗下来。结合的蛋白用加样缓冲液洗脱，SDS-PAGE分离，并用荧光显影观察。
结果如图4所示。当DHA存在时，不能有效结合RXR配体结合域与[35S]甲硫氨酸标记的SRC-1片段有效的结合；当DHA不存在时，不能有效结合。这表明DHA直接结合RXR配体结合域，导致与SRC-1有效的相互作用。
上述实施例表明，二十二碳六烯酸或“DHA”已经被鉴定为维甲酸X受体或“RXR”的天然配体。这使得本领域普通技术人员能确定特定物质是否是RXR的拮抗物或激动剂。简而言之，可以通过感兴趣的物质与受体或其中包含了受体的配体结合域的分子，以及DHA相结合来确定。由于DHA是RXR的配体，人们可以在所感兴趣的分子存在或不存在的条件下，比较DHA与靶分子的结合。通过这种方式，人们可以确定这种感兴趣的分子是否真的与RXR结合。进一步的，通过比较所述分子对RXR分子的效应，可以确定它是激活剂还是拮抗剂。
本文描述的系统可以在细胞或无细胞环境中使用。无细胞系统是已知的，这里无需描述。这些都可以使用与实施例描述相近的方法，用转染细胞确定感兴趣分子的活性。
类似的，认识到DHA是RXR的结合配体，提示出一种确定分子在治疗和/或控制需要调节RXR的状态下的治疗价值的方法。通过使用与识别激活剂或拮抗剂同样的技术，可以鉴别具有治疗用途的可以被用于抑制或激活RXR的物质，也可以确定受体的效应。使用DHA增强信号传递的典型病症是糖尿病和乳腺癌。参见Mukeherjee等，Nature 386407-410(1997)；Gottardis等，Canc.Rec.565566-70(1996)，其显示增强的RXR信号在这些病症中是有益的。天然DHA或合成DHA都可以使用，前者是优选。RXR和许多核受体的异源二聚化配偶体，这一事实显示RXR配体比如DHA的给药，将有益于治疗一些依赖异源二聚化而上调基因的疾病。
应注意到这里使用“RXR”时，包含配体结合域或“LBD”的任何形式的分子也是本发明所期望的，包括LBD本身，完整的RXR分子以及中等大小的分子，即至少包含LBD但并非全部的分子。本文中“LBD”指，与DHA结合所需的分子的最小部分。
本文中“RXR”指任何形式的RXR分子。哺乳动物形式，尤其人的RXR形式都是优选的，但是其它形式如鼠的以及其它啮齿类动物的形式也可使用。“DHA”也指任何形式的分子，如标记形式的等等。
本发明的其它方面对于本领域普通技术人员来说是清楚的，这里无需赘述。
这里所使用的术语和解释作为一种描述用语而并非一种限制，在使用这些术语和解释时，申请人不想排除对其它特征或部分的任何等价形式的描述。可以认识到，各种修改都有可能在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种确定物质是否结合维甲酸X受体(RXR)的方法，包括在二十二碳六烯酸(DHA)存在的情况下将所述物质与维甲酸X受体(RXR)接触，并且确定所述物质是否抑制DHA与RXR的结合，抑制则表明所述物质与RXR结合。
2.权利要求1所述方法，其中所说的RXR包括RXR的配体结合域。
3.权利要求1所述方法，其中所说的RXR是哺乳动物RXR。
4.权利要求3所述方法，其中所说的哺乳动物RXR是人RXR。
5.权利要求1所述方法，其中所说的RXR存在于细胞表面。
6.权利要求1所述方法，其中所说的RXR存在于用编码RXR的核酸分子转化或转染的细胞的表面。
7.权利要求1所述方法，包括确定报告分子的表达，从而确定所述物质的结合。
8.权利要求7所述方法，其中所说的报告分子是荧光分子，化学发光分子或发光分子。
9.权利要求8所述方法，其中所说的报告分子是萤光素酶。
10.权利要求7所述方法，其中所说的报告分子由转化或转染细胞表达。
11.一种增加维甲酸X受体(RXR)活性的方法，包括将所说的RXR与所说的RXR结合配体接触。
12.权利要求11所述方法，其中所说的配体是二十二碳六烯酸。
13.权利要求11所述方法，其中所说的配体是同所说的RXR相结合的分子，该配体与RXR的结合比二十二碳六烯酸与RXR的结合有更大亲和力。
14.一种抑制维甲酸X受体(RXR)活性的方法，包括将所说的RXR与结合所说的RXR的分子相接触，该分子抑制二十二碳六烯酸与RXR的结合。
15.权利要求11所述方法，包括向有需要的受试者给药所说的DHA。
16.权利要求15所述方法，其中所说的受试者患有糖尿病或乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及对维甲酸X受体的配体的鉴别。具体地，将二十二碳六烯酸鉴定为一种RXR配体。并提供了基于这一研究所建立的各种检测方法。
文档编号G01N33/50GK1427952SQ01809212
公开日2003年7月2日 申请日期2001年3月23日 优先权日2000年3月24日
发明者托马斯·珀尔曼, 亚历山大·马塔德厄奎扎, 玛丽亚·肖柏格, 利厄·苏亚, 简·肖瓦尔, 威廉·格里菲思, 罗尔夫·泽特斯特罗姆 申请人:路德维格癌症研究院