抗原呈递细胞的质量分析的制作方法

专利名称：抗原呈递细胞的质量分析的制作方法
背景技术：
抗原呈递细胞(APC)对于引发有效的免疫应答很重要。APC不仅将抗原呈递给具有抗原-特异性受体的T细胞，而且还提供了T细胞活化所必需的信号。这种信号涉及多种细胞表面分子以及细胞因子和/或生长因子的产生。活化原初的或未致敏的T细胞所必需的这种信号被确认不同于预先致敏的记忆T细胞的再活化所必需的信号。
APC包括单核细胞、B细胞和树突细胞。尽管单核细胞和B细胞的抗原呈递能力似乎局限于预先致敏的T细胞的再活化，但是它们已被证实是感受态的APC。这些细胞类型不能直接活化功能性的原初的或未致敏的T细胞群。
另一方面，树突细胞既能活化原初T细胞又能活化预先致敏的T细胞。树突细胞是具有不同形态并具有广泛的包括血液在内的组织分布的异种细胞群(参见，例如Steinman，Ann.Rev.Immunol.9271-96(1991))。树突细胞的细胞表面不同寻常，具有面纱状突起的特征。成熟树突细胞被通称作CD11c+HLA-DR+、CD86+、CD54+、CD3-、CD19-、CD14-、CD11c+和HLA-DR+。
树突细胞吸收、加工并呈递抗原，从而刺激未致敏的原初T细胞和记忆T细胞产生应答。它们对MHC-限制性T细胞的致敏能力很高并能非常有效地将抗原呈递给T细胞。树突细胞既能呈递自身-抗原(例如，在T细胞的发生与耐受过程中)又能呈递外源抗原(例如，在免疫应答过程中)。另外，树突细胞还直接与非淋巴组织发生关系并监测非淋巴组织的损伤信号(例如局部缺血、感染或炎症)或肿瘤生长。一旦有信号，树突细胞就通过释放激活淋巴细胞和单核细胞的细胞因子来启动免疫应答反应。
由于它们能有效进行抗原呈递，所以人们在把树突细胞用作体内和体外免疫刺激剂方面的兴趣愈来愈大。具体地是，针对靶抗原制备出成熟的树突细胞然后再将这些树突细胞施用到受试者(例如患者)身上从而激发针对所述抗原的免疫应答。例如，未成熟的树突细胞可以通过与靶抗原和成熟剂接触来产生特异于所述靶抗原的活化成熟树突细胞。另外，细胞群中的成熟抗原-特异性树突细胞可以通过增殖来增加特异于所述靶抗原的树突细胞的数目。
树突细胞以及树突细胞前体可以通过多种方法来进行分离。这些细胞类型通常以很低的概率(例如通常小于约1％的白血细胞)存在。因此，分离树突细胞和树突细胞前体的方法通常需要单独进行大量的纯化或与体外培养结合进行大量的纯化来提供足够数目的细胞。用于纯化树突细胞及其前体的方法包括，例如密度梯度分离、荧光激活的细胞筛选、免疫学细胞分离技术如淘选技术(panning)、补体溶解、玫瑰花结技术、磁性细胞分离技术、尼龙羊毛分离法以及这些方法的结合(参见，例如，O’Doherty等，J.Exp.Med.1781067-76(1993)；Young和Steinman，J.Exp.Med.1711315-32(1990)；Freudenthal和Steinman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877698-702(1990)；Macatonia等，Immunol.67285-89(1989)；Markowicz和Engleman，J.Clin.Invest.85955-61(1990)；Bernhard等，Cancer Res.551090-104(1995)；Caux等，Nature 360258-61(1992)；美国专利US5994126和US5851756)。
由于可以用来制备树突细胞的方法有多种，所以树突细胞制剂的特征也是多样化的。例如，在针对抗原的应答过程中，树突细胞活化原初T细胞的能力可以不同。T细胞的活化需要两个信号。第一个信号是通过T细胞受体(TCR)来传递的并决定T细胞的抗原特异性(“抗原-特异性信号”)。第二个信号或共-刺激信号可以通过T细胞和树突细胞上的多个受体/配体对(共-刺激对)来传递。这些在T细胞和树突细胞上表达的共-刺激对分别包括CD28/CD152(CTLA-4)和CD80/CD86；4-1BB和4-1BBL；CD27和CD70；LFA-1和CD54。
树突细胞制剂向T细胞呈递抗原的能力可以不同。例如，制剂可以不含呈递靶抗原的树突细胞。另外。树突细胞制剂仅仅向T细胞呈递少量的靶抗原。这种制剂作为体内和体外免疫刺激制剂的实用性已被降低。
多种试验被用来评价树突细胞制剂的质量。这些试验包括，例如，确定制剂中的树突细胞的数目或比例(例如，成熟和/或未成熟的)、某些细胞表面标记的存在、树突细胞呈递靶抗原的能力、刺激T细胞活化的能力等等。
一种确定APC制剂质量的方法是“免疫-表型法”，其确定起着某些APC-特异性标记物(例如，“树突细胞”标记物CD83和/或CD11c)作用的细胞的数目或比例。然而，免疫表型法不能提供有关制剂参与T细胞活化的能力的信息。
混合型白细胞反应(MLR)是一种用来测定白细胞与异源抗原发生反应的试验。同源白细胞(即，具有相同的HLA标记)不发生任何交叉反应，而异源性白细胞(具有不同的HLA标记)则发生不同程度的交叉反应，这些交叉反应取决于HLA标记之间的差异程度。因此，当MLR反应被用于测定异源抗原的交叉反应时，通常不用来确定树突细胞制剂在其它意义上的功能。
因此，仍然需要测定树突细胞制剂质量的方法。本发明满足了这种需要以及满足了更多的需求。
本发明的概述本发明提供了抗原呈递细胞制剂的质量评价方法，该抗原呈递细胞制剂被用于T细胞的刺激或给受试者施用的免疫刺激组合物的制备。
在一个实施方案中，提供了一种用于确定抗原呈递细胞(APC)的抗原-非依赖性的、共刺激活性的方法。该方法包括以下步骤提供具有已知功能活性和基本上不具共刺激活性的T细胞以及提供一种具有未知共刺激活性的抗原呈递细胞(APC)的样品。使所述T细胞与亚最适浓度的抗原模拟物接触。所述T细胞还与未知共刺激活性的APC样品接触。接着确定与抗原模拟物和APC样品接触过的所述T细胞的活化并与T细胞的标准活化指数进行比较从而确定APC的抗原非依赖性共刺激活性。还可以对被细胞吸收、加工和/或呈递的预定抗原进行定性或定量测定。通常，抗原的吸收、加工和/或呈递是通过，例如，western印迹、流式细胞计数或抗原-特异性T细胞的活化来进行确定。
被用于本发明方法中的T细胞与未知活性的抗原呈递细胞可以是同源或异源的。通常，被用于本发明方法中的T细胞分离自外周血单核细胞。被用于该方法中的T细胞含有源自外周血单核细胞样品的T细胞而不含在细胞表面表达MHC II型、CD14、CD54、CD80、CD83和/或CD86分子的细胞。
被用于本发明方法中的抗原模拟物通常是CD3结合剂，诸如，但不限于，特异于CD3的抗体、植物凝集素或非植物源的促细胞分裂原。被用于本发明方法中的抗原呈递细胞通常是未成熟的树突细胞或成熟的树突细胞。成熟的树突细胞可以是那些源自与树突细胞成熟剂进行体外接触的未成熟树突细胞的树突细胞。
本发明方法中的T细胞的活化可以通过以下方法来测定，例如，测定掺入到增殖T细胞的DNA中的放射性标记的胸腺嘧啶脱氧核苷的量，分析T细胞细胞因子即IFNγ(γ-干扰素)或白细胞介素-2的产生，或者分析T细胞活化标记物诸如但不限于CD25、CD69、CD44或CD125的调节。可以确定体外或体内T细胞因子的量。而且，可以例如通过利用特异于T细胞活性标记物的标记性抗体来确定T细胞活化标记物的调节作用。
本发明的方法通过将抗原呈递细胞的T细胞活化与本方法中使用的T细胞标准活化指数进行比较来确定抗原呈递细胞的抗原-非依赖性共刺激活性。所述标准活化指数可以被表示为一种阈值或者也可以被表示为一个数值范围，每个数值都与树突细胞的预定质量有关。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于确定树突细胞制剂的抗原-非依赖性的共刺激活性的方法。该方法包括使第一数量的T细胞与亚最适数量的抗原模拟物进行接触并与未知共刺激活性的树突细胞制剂第一样品接触，其中所述第一数量的T细胞基本不具有共刺激活性并具有已知的功能活性。确定第一数量的T细胞的第一活化值。然后使第二数量的T细胞与树突细胞制剂的第二样品或亚最适数量的抗原模拟物进行接触，从而确定第二数量的T细胞的第二活化值。将第一与第二活化值进行比较从而确定树突细胞制备物的共刺激活性。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于确定树突细胞制剂质量的方法。该方法包括以下步骤提供一种具有未知共刺激活性以及针对预定抗原的未知抗原呈递能力的树突细胞制剂；测定所述树突细胞制剂的共刺激活性；和定性或定量测定所述树突细胞制剂针对预定抗原的抗原呈递能力。通过结合这些值可以评估所述树突细胞制剂活化用于预定抗原的T细胞的质量。
所述树突细胞制剂的共刺激活性可以通过以下方法来确定提供具有已知功能活性而且基本上不具共刺激活性的T细胞，使之与亚最适数量的抗原模拟物以及与第一树突细胞制剂样品接触，然后确定被接触的T细胞的活化，并将确定的被接触T细胞的活化与T细胞的标准活化指数进行比较从而确定树突细胞制剂的共刺激活性。
树突细胞制剂对预测抗原的呈递可以通过以下方法来测定使第二树突细胞制剂样品与预定抗原进行接触并且确定预测抗原的量，而不管预定抗原是否已被树突细胞制剂所吸收、被进行了加工，还是已被呈递到第二树突细胞制剂样品的细胞表面。
本发明的详细描述本发明提供了评价抗原呈递细胞诸如树突细胞制剂用于T细胞刺激或作为给受试者施用的免疫刺激组合物的质量的方法。用于分析T细胞的抗原-非依赖性的共-刺激(也被称作共刺激活性)和APC对预定抗原进行呈递的试验可以被用来确定APC制剂的质量。
一方面，APC制剂的质量可以通过抗原-非依赖性T细胞共-刺激(或效力)分析试验来确定。通常，功能活性已知的T细胞与模拟抗原特异性信号的抗原模拟物接触。该T细胞还与共刺激活性未知的APC接触。然后可以测定T细胞的活化并且将该活化用来确定APC的质量。
另一方面，APC制剂的质量可以根据APC呈递预定抗原的能力来确定。通常，使APC制剂与预定抗原接触。在适当温育一段时间以使抗原吸收后，就可以确定APC呈递的预定抗原。
抗原-非依赖性的T细胞共-刺激(效力)分析试验为了通过抗原-非依赖性的T细胞共-刺激分析试验来确定APC的质量，使功能活性已知的T细胞与模拟抗原特异性信号的抗原模拟物接触。使共刺激活性未知的APC与T细胞接触，然后测定T细胞的活化并将该活化用来确定APC的质量。T细胞的活化可以在T细胞和APC的共培养期间或之后来确定。如本文所使用的，T细胞的活化可以通过检测T细胞在与APC接触而发生应答时的一种或多种功能的变化来确定。适当的T细胞功能包括，例如，DNA复制量的增加以及伴随着的细胞增殖的增强，胞外和/或胞内细胞因子产生的变化，T细胞活化标记物的变化和T细胞对抗原呈递细胞的其它应答反应(例如，抗原-特异性信号和共-刺激信号)。
被用于该试验的T细胞可以是富集的T细胞制剂、APC-缺乏的T细胞制剂或基本上纯化的T细胞制剂(下文)。所述T细胞具有已知功能活性。如本文所使用的，已知功能活性是指T细胞针对相同共-刺激信号(来自APC)和相同浓度的抗原模拟物的可重复应答，例如，所述已知功能活性可以是在针对相同量的共-刺激信号和抗原模拟物的应答中的一种预定的增殖(例如，通过掺入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷所测定的DNA复制)、胞外细胞因子的产生、胞内细胞因子的产生和/或T细胞活化标记物的表达。T细胞的预定功能活性可以在本文记载的方法之前、同时或之后确定。
所述抗原模拟物可以，例如是一种多克隆抗体、一种单克隆抗体、抗体的抗原结合片段或能够与T细胞受体结合而提供抗原模拟信号的其它分子。在某些实施方案中，抗原模拟物是CD3结合物，诸如CD3结合抗体或其抗原结合片段。在一个具体的实施方案中，CD3结合物是一种单克隆抗体，该单克隆抗体与T细胞受体(例如OKT3)的恒定CD3组分结合(参见，例如，Thomas等，J.Immunol.1516840-52(1993)；其公开内容被引入本文作参考)。在另一个实施方案中，CD3结合物可以是一种与CD3或T细胞受体的其它部分结合并模拟抗原特异性信号的多克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述抗原模拟物可以是，例如一种植物凝集素或促细胞分裂原，该凝集素或促细胞分裂原以亚最适浓度与由APC提供的共-刺激信号共同提供一种刺激来激活T细胞。然而，在没有共-刺激信号存在的情况下，该亚最适浓度或量的凝集素或促细胞分裂原不足以刺激最大化的T细胞活化。合适的植物凝集素包括，例如，伴刀豆凝集素A、植物凝集物、小麦胚芽凝集素、美洲商陆细胞分裂原等。非植物源的合适促细胞分裂原包括，例如，葡萄球菌内毒素A、链球菌蛋白A、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)等。
T细胞通常与亚最适浓度或量的抗原模拟物接触。如本文所使用的，“亚最适浓度”或“亚最适量”是指本身不能刺激最大化的T细胞活化的抗原模拟物的浓度或量。在一个典型的实施方案中，所述亚最适浓度或量的抗原模拟物使得T细胞对一个由APC提供的所需范围的共-刺激信号产生线性应答(即，激活)。在另一个实施方案中，在来自APC的共-刺激信号的阈值水平之上，所述亚最适浓度或量的抗原模拟物使得T细胞活化。
在某些实施方案中，抗-CD3抗体的适量范围可以是约0.05至约20ng/100μl，或约50ng/100μl，或更高。在其它实施方案中，使用亚最适浓度或量的植物凝集素和非植物源的促细胞分裂原。在其它实施方案中，所使用的植物凝集素或非植物源的促细胞分裂原的亚最适浓度或量取决于所选择的组分。通常采用的植物凝集素或非植物源的促细胞分裂原的最适浓度对于本技术领域的技术人员是已知的并且可以容易地选出亚最适浓度。例如，PHA的最适浓度是1至5μg/μl，在本发明的一个实施方案中，小于1μg/μl将被用作亚最适浓度。适量的T细胞与APC可以进行接触。在某些实施方案中，以低比例的APC/T细胞来进行分析试验。所述APC与T细胞的比例范围，例如约为1∶3至约1∶100。
与APC共培养前，T细胞可以与抗原模拟物接触。例如，T细胞可以与被固定在组织培养板或微滴板孔中的亚最适浓度的抗原模拟物接触。或者，所述T细胞、APC和抗原模拟物可以在同一时间或大约同一时间进行接触。
在一个范例性质的实施方案中，所述抗原模拟物可以被固定在培养皿(例如，平底96孔板)中。96孔板的每个孔中的抗原模拟物，例如抗-CD3单克隆抗体的适量范围，例如，约0.1至约50ng，或更多。固定后，通常冲洗所述的孔从而除去未结合的抗原模拟物。在其它实施方案中，可以采用不同的培养时间和条件。
合适的APC制剂包括，例如，树突细胞和单核细胞。在其它的实施方案中，APC可以是被活化的非标称APC，诸如B细胞、T细胞或上皮细胞或内皮细胞。APC可以是未成熟的或成熟的。APC和T细胞通常进行约6小时至约48小时的共培养，然而较长或较短的时间也在本发明的保护范围内。共培养通常进行足够长的时间以使T细胞活化，但是大量的未成熟APC或APC前体的分化和/或成熟则需要较短的时间。
T细胞的活化可以在T细胞与APC的共培养期间和/或之后来确定。用于T细胞活化的合适试验包括，例如DNA复制试验(例如，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法)，胞外和/或细胞因子的产生试验(例如，ELISA，流式细胞计数等)和T细胞活化标记物试验(例如，流式细胞计数)。
T细胞的活化可能与T细胞的增殖如DNA复制有关，DNA复制可以通过，例如被标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(例如，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷或其它合适的标记物)来进行测定。T细胞与APC的共培养物可以进行约6至约24小时的脉冲标记(例如，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷，约1μCi/孔)。然后收集所述细胞(例如利用细胞收集器)并通过液体闪烁光谱测定所掺入的放射量。在某些实施方案中，可以在与T细胞进行共培养之前使APC失活从而阻止APC的DNA复制。或者，在确定掺入标记物量之前可以将所述T细胞与APC分离。
还可以通过胞外或胞内细胞因子的产生来测定T细胞的活化，所述细胞因子的产生例如是IFNγ和/或IL-2等的产生。胞外细胞因子的产生可以通过测定培养基中的一种或多种细胞因子的浓度变化来测定。通常可以采用免疫分析试验(例如，ELISA试验、三明治试验、免疫沉淀试验或western印迹)，然而其它试验也是适用的(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1999)，其公开内容被引入本文作为参考)。针对胞内细胞因子水平，可以采用免疫分析试验或其它试验。在分析胞内细胞因子水平之前，任选地将T细胞与APC分离(例如，通过基于T细胞标记物表达收集)(参见，例如，Harlow和Lane，见上文)。
在其它实施方案中，T细胞活化可以通过T细胞活化标记物的调节作用来确定。这种标记物包括，例如CD25(也被称作白介素-2受体α链)、CD69(也被称作VEA或AIM)、CD44(也被称作Pgp-1)、CD125(也被称作IL-2受体β链)等。T细胞活化标记物的调节作用可以通过，例如确定蛋白质或mRNA的水平变化来测定。例如，蛋白质的水平变化可以采用抗T细胞活化标记物、转录因子或与T细胞活化有关的其它蛋白质的标记性抗体通过免疫分析试验如ELISA或western印迹等试验经流式细胞计数来测定。mRNA水平的变化可以确定编码T细胞活化标记物、转录因子等的信息。mRNA水平可以通过，例如，Northern印迹、聚合酶链式反应(例如RT-PCR)、其它杂交试验(例如利用GeneChipe探针阵列等的分析试验)或其它分析试验来确定(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratozy Manual，第三版，Cold Spring Harbor Publish.，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，第四版，John Wiley和Sons，纽约(1999)；美国专利US5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734；和5,700,637；其公开内容被引入本文作参考)。
由活化分析试验确定的T细胞的活化(确定的活化)可任选地通过与抗原模拟物和/或APC单独接触的T细胞的背景活化来调节(即，降低)。
另外，可以任选地将所述活化针对T细胞制剂中的非-T细胞(例如，B细胞、NK细胞等)的背景水平调节。
所确定的活化(消除或没有消除背景活化)可与T细胞的标准活化指数进行比较从而确定APC(例如树突细胞)的共刺激活性。如本文所使用的，标准活化指数是指一种量值或系列值，可能与抗原非依赖性、APC的共刺激活性有关。例如，标准活化指数可以是一种阈值(例如，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入水平、胞外或胞内细胞因子的产生水平、或一种或多种T细胞活化标记物的存在与否)。标准活化指数还可以是一系列与由APC对T细胞产生的不同水平的共-刺激有关的值(例如，不同的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入量、不同的胞外或胞内细胞因子的产生量、或T细胞活化标记物的存在与否)。在其它实施方案中，所述标准活化指数可以是定性的(例如，一种或多种T细胞活化标记物的存在与否、细胞因子的产生与否等)。例如，在某些实施方案中，所述标准活化指数可以与15000cpm的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入有关，该3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入用于测定T细胞活化的程度或水平，其可能与APC的共-刺激的程度或水平(或效力)成正比。
在某些实施方案中，标准活化指数可以被计算成由T细胞和抗-CD3抗体与APC(未知效力的)的接触而产生的活化(例如，cpm)相对由T细胞与抗-CD3抗体接触(没有APC)而产生的活化之比。所得到的值可以是APC共刺激活性或效力的指标。
标准活化指数可以利用单个的T细胞制剂来确定，或者可以基于一种或多种T细胞制剂被标准化。在某些实施方案中，标准活化指数可以利用对照T细胞制剂或T细胞系和对照APC制剂或APC细胞系来确定。
被确定的活化以及相应的标准活化指数(或指标)通常与APC的共刺激活性成正比。因此，APC共刺激活性可以被用于，例如，对研究用途、动物研究用途的、临床试验用途的以及其它非临床用途的APC进行定性。另外，APC共刺激活性分析试验可以被用来确定APC制剂的一致性或作为APC产品的质量对照试验(例如细胞疫苗产品)。
APC抗原呈递试验根据本发明的另一个方面，提供了用于确定APC制剂的质量的方法，该方法通过确定APC制剂对预定抗原的呈递来实现。如上文所讨论的，APC制剂在吸收、加工和呈递抗原方面的能力可以不同。例如，成熟的树突细胞一般在吸收、加工和呈递新抗原方面的能力较低。相反，未成熟树突细胞一般能够有效地吸收抗原，但直到成熟后才能有效地加工和呈递抗原。根据待分析细胞的类型，抗原呈递可以是确定APC吸收、加工和呈递某些预定抗原或一组抗原或抗原样品的能力的尺度，或与APC吸收、加工和呈递某些预定抗原或一组抗原或抗原样品的能力有关。
为了确定抗原的呈递，使APC样品与一种或多种预定抗原接触。对所述APC进行培养以便吸收以及任选地加工和/或呈递预定抗原(或其表位)。由APC呈递的预定抗原的量可能与通过例如测定在APC内部进行装载和/或加工的呈递、和/或通常有MHC分子参与的在APC表面进行的呈递有关。这些分析试验被统称为“呈递试验”或“呈递”。
所述预定抗原可以例如是细菌或病毒抗原，肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如肿瘤细胞溶胞产物、肿瘤细胞膜制剂、肿瘤分离抗原、融合蛋白或脂质体)或其它抗原。在一个范例性的实施方案中，所述抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在某些实施方案中，预定抗原呈递的量可能与APC对抗原的装载有关。例如，APC可以装载抗原，收集细胞并任选地冲洗掉保留在细胞外部的抗原。可以制备细胞溶解产物并通过免疫试验来对所述溶胞产物进行分析从而确定由APC装载的预定抗原的量。这种试验包括western印迹、ELISA试验，免疫沉淀等(参见例如，Harlow和Lane，见上文)。
在另外的实施方案中，预定抗原的呈递可以通过检测在APC表面上呈递的抗原(或其表位)来确定。例如，与预定抗原接触的APC可以采用增溶剂(例如TWEEN，十二烷基磺酸钠或NP40)通过渗透压休克等来进行处理。释放出的抗原(或其表位)可以通过例如免疫试验(例如ELISA，免疫沉淀等)来检测。所述预定抗原或抗体可任选地进行检测性标记(例如利用放射性同位素、荧光团、化学发光标记物、酶等)，而且释放出的抗原可以利用适当的检测手段(例如闪烁计数器)来检测。
在相关的实施方案中，抗原呈递可以通过流式细胞计数来确定。例如APC可以与预定抗原接触，而且是在培养一段时间后，可以采用抗原-特异性标记物对被接触的APC进行染色从而可以检测出细胞表面所呈递的抗原量。合适的标记物可以包括，例如被标记的抗体或其它对所述抗原或其片段具有特异性的结合试剂。
抗原呈递还可以利用抗原-特异性T细胞如抗原-特异性T细胞系来进行确定。可以将APC与预定抗原进行接触并一直培养到进行抗原的吸收、加工和呈递。如本文所讨论的，抗原呈递可以通过测定抗原-特异性T细胞的活化(例如通过确定DNA的复制、胞外或胞内细胞因子的产生、T细胞的活化等)来确定。
T细胞和APC制备物用于本发明的T细胞可以按照本技术领域中已知的方法来制备。对于抗原-非依赖性的共-刺激试验来说，T细胞可以是一种富集的T细胞制剂、一种APC-缺乏的T细胞制剂或基本纯的T细胞制剂(见下文)。T细胞或亚型T细胞可以从多种淋巴组织中得到。这些组织包括，但不限于脾、淋巴结和外周血。T细胞可以是一种混合的T细胞群或一种纯化的T细胞亚型。
在某些实施方案中，所述T细胞是一种富集的细胞制剂，其中细胞的数目或百分比针对分离的T细胞群而增加。在其它实施方案中，所述T细胞基本上不含APC，其中大多数(例如＞75％)的APC已被从T细胞中分离出来。在一个范例性的实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)可以利用诸如肝素化小瓶从血液中得到。PBMC可以通过离心(例如利用HISTOPAQUE1077(Sigma Aldrich Co.))来从血红细胞中分离并且从界面回收PBMC。可以任选地冲洗(如用PBS)回收到的PBMC。
T细胞的纯化可以通过例如正或负筛选来实现，所述正或负筛选包括但不限于使用针对CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD19和/或MHC II型分子的抗体。本发明使用的T细胞制剂通常是CD4+或D4+与CD8+的混合群。在某些实施方案中，T细胞制剂至少含有约50％的T细胞。在另外的实施方案中，所述T细胞可以是一种分离的T细胞系。
可以制备其中已去除了共-刺激信号的APC-缺乏的T细胞。共-刺激信号可以通过例如利用抗MHC II型分子的抗体而进行的“淘选(panning)”来去除。例如，T细胞或PBMC可以与偶联了MHC II型分子-特异性抗体的磁珠子接触以便去除共-刺激信号。如本文所采用的，基本上不含共-刺激信号的T细胞一般具有微乎其微的T细胞活化(例如，小于约5％，或小于约1％的完全被激活的T细胞的活性)。
APC可以由多种来源制备，包括人和非人灵长目、其它哺乳动物和脊椎动物。在某些实施方案中，APC可以由人或非人脊椎动物的血来制备。APC还可以分离自富集的白细胞群体。白细胞群体可以通过本技术领域中的技术人员已知的方法来制备。这些方法通常包括收集肝素化血液、单采血液成分术(apheresis)或白细胞提取法(leukopheresis)、血沉棕黄层的制备、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如利用Ficoll(诸如FICOLL-PAQUE)、PERCOLL(胶体硅石颗粒)、蔗糖等)、非白细胞的差异溶胞、过滤等。白细胞群体还可以通过以下步骤来制备收集受试者的血液、去纤维蛋白化以去除血小板并将血红细胞溶胞来制备。所述白细胞群体可以任选地富集单核的树突细胞前体。
根据富集的白细胞群体的所需用途，可以从多种受试者身上获得血细胞群体。受试者可以是健康的受试者。或者，可以从需要进行免疫刺激的受试者，诸如癌症患者或其它将受益于免疫刺激的患者身上获取血细胞。同样，血细胞还可以从需要进行免疫抑制的受试者，诸如患有自身免疫疾病(例如类风湿关节炎、糖尿病、狼疮、多发硬化症等)的患者身上获取。白细胞群体还可以从HLA-匹配的健康个体身上获取。
在某些实施方案中，单核的树突细胞前体可以通过例如使富集的白细胞或单细胞与单核树突细胞前体粘附底物接触来分离(参见，例如美国临时专利申请60/307,978(2001年7月25日申请的)；其公开内容被本文引入作为参考)。简单地说，当富集的白细胞或单核细胞群与底物接触时，细胞群中的单核树突细胞前体或单核细胞粘附到底物上。其它白细胞对底物则表现出较低的结合力，因此使得单核树突细胞前体优先富集在底物的表面上。
合适的底物包括微粒型底物，诸如玻璃微粒、塑料微粒、玻璃包被的塑料微粒、玻璃包被的聚苯乙烯微粒、微毛细血管的膜和微绒毛状的膜。任选地可对底物表面进行处理以便增强单核树突细胞前体对底物的粘附力。底物表面可以包被一层例如蛋白质；细胞因子，诸如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4和/或白细胞介素13；血浆，诸如自体或异体血浆；结合单核细胞的蛋白等。
在富集了白细胞或单核细胞的细胞群与粘附单核树突细胞前体的底物接触后，单核树突细胞前体则与底物粘合从而形成在底物表面上含单核树突细胞前体的复合体。可以对单核树突细胞前体的结合力进行监测，例如通过采用抗细胞表面标记物抗体，例如抗-CD14抗体的抗体检测法，FACS正向和侧散射分析等来进行监测。在某些实施方案中，白细胞群与底物接触约5至约300分钟，更典型地约30至约120分钟。
单核树突细胞前体复合体可任选地用适当的冲洗缓冲液进行冲洗以便去除非特异结合的白细胞。合适的冲洗缓冲液包括组织培养基(例如AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO 15等)、磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水等。所述培养基可以添加氨基酸、维生素和/或激素以便提高单核树突细胞前体的存活率和/或增殖力。冲洗的效力可以通过对冲洗缓冲液进行的FACS正和侧散射分析、对洗脱细胞染色检测细胞表面标记等来监测。典型地，将所述复合体冲洗几次从而去除非特异结合的白细胞。
可以将粘附的单核树突细胞前体从底物上洗脱下来。例如，可以采用含0.4％EDTA的磷酸盐缓冲盐水或其它非毒性螯合剂进行处理以便将所述前体从底物上洗脱下来。典型地。不需要使用胰蛋白酶或其它蛋白酶而将所述单核树突细胞前体从底物上洗脱下来。
在其它实施方案中，可以根据本技术领域的技术人员已知的其它方法来分离所述树突细胞(参见，例如O′Doherty等，J.Exp.Med.1781067-76(1993)；Young和Steinman，J.Exp.Med.1711315-32(1990)；Freudenthal和Steinman，Proc.Natl.Acad Sci.USA 877698-702(1990)；Macatonia等，Immunol.67285-89(1989)；Markowicz和Engleman，J.Clin.Invest.85955-61(1990)；美国专利US 5,994,126和5,851,756；其公开内容被本文引入作为参考)。用于免疫选择树突细胞的方法包括，例如利用针对与树突细胞前体相关的细胞表面标记的抗体，诸如偶联在底物上的抗-CD34和/或抗-CD14抗体(参见例如Bernhard等，Cancer Res.551099-104(1995)；Caux等，Nature 360258-61(1992))或与完全分化的树突细胞相关的细胞表面标记，诸如CD11c，CD54，CD83，CD80，CD86等的抗体。
在其它实施方案中，APC可以是炎症或其它活化条件下的非-标称的APC。例如，非-标称的APC可以包括受γ-干扰素刺激的上皮细胞、T细胞、B细胞和/或被因子或诱导APC活化条件激活的单核细胞。这种非-标称APC可以根据本技术领域已知的方法来制备。
APC的培养、扩增和分化根据需要，按照APC的类型，APC可以被培养、扩增、分化和/或熟化。可以在任何合适的培养器，诸如培养板、培养瓶、培养袋、培养反应器等中对APC进行培养(参见例如美国临时专利申请US60/307,978(2001年7月25日申请的))。
在某些实施方案中，可以在合适的培养或生产培养基中培养APC以便维持和/或扩增制剂中的APC数目。所述培养基可以根据分离的APC类型来选择。例如成熟的APC，诸如成熟的树突细胞可以在适于其维持和扩增的生长培养基，例如AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15等中进行培养。所述培养基中可以添加氨基酸、维生素、抗生素、双价阳离子等。另外，所述生长培养基中也可含有细胞因子、生长因子和/或激素。例如，为了维持和/或扩增成熟树突细胞，细胞因子，诸如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白细胞介素-4(IL-4)典型地是以约500单位/ml的浓度进行添加。
在其它实施方案中，可以对未成熟的APC进行培养和/或扩增。因为未成熟的树突细胞保留了摄取和加工新抗原的能力所以它们在本发明的某些方面是优选的(参见例如Koch等，J.Immunol.15593-100(1995))。在一个范例性的实施方案中，未成熟的树突细胞可以在适于其维持和培养的培养基中进行培养，所述培养基是诸如AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15等。所述培养基中可以添加氨基酸、维生素、抗生素、双价阳离子等。另外，所述培养基中还可含有细胞因子、生长因子和/或激素。例如，为了维持和/或扩增未成熟的树突细胞，细胞因子，诸如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白细胞介素-4(IL-4)典型地是以约500单位/ml的浓度进行添加。
其它未成熟的APC可以根据技术人员已知的方法进行类似的培养或扩增。
可以使未成熟APC的制剂成熟而形成成熟的APC。根据未成熟APC的类型，APC可以在暴露给抗原(例如预定抗原)期间或之后成熟。
在某些实施方案中，未成熟树突细胞的制剂可以被成熟。合适的成熟因子包括，例如细胞因子(例如TNF-α)、细菌产物(例如BCG)等。
在本发明的某些方面，需要制备特异于预定抗原的APC。这种抗原可以是，例如细菌和病毒抗原、肿瘤特异性的或肿瘤相关抗原(例如肿瘤细胞溶胞产物、肿瘤细胞膜制剂、从肿瘤分离出的抗原、融合蛋白或脂质体)或其它抗原。在一个范例性的实施方案中，未成熟的树突细胞是在癌症免疫疗法和/或肿瘤生长抑制的前列腺特异性膜抗原(PSMA)存在的条件下进行培养的。APC典型地是与预定抗原一起进行培养并且培养适当时间以便吸收和加工抗原。
另一方面，分离的APC前体被用来制备未成熟或成熟的APC制剂。按照技术人员所知道的，APC前体可以培养、分化和/或成熟。
在某些实施方案中，单核树突细胞前体可以在有适当培养基(例如AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO 15等)存在的条件下进行培养，所述培养基中添加了添加氨基酸、维生素、细胞因子(例如GM-CSF和/或IL-4)、双价阳离子等以便促进单核树突细胞前体向未成熟树突细胞的分化。典型的细胞因子组合是约各500单位/ml的GM-CSF和IL-4。
下面的实施例只是提供用来说明本发明的各个方面而无论如何不应当被解释为是对本发明的限制。
实施例实施例1共-刺激试验在该实施例中，一种抗原-非依赖性的共-刺激试验被用来测定树突细胞制剂的质量。
按照以下方法由26个不同的人受试者制备树突细胞制剂将PBMC从每位患者的白细胞提取法(leukophereses)血中分离出来后在添加了5％的自体血浆的OptiMEM培养基(Gibco-BRL)中培养6天，接着在有BCG(一种树突细胞成熟剂)存在的条件下再培养一天。
按照以下方法制备外周血单核细胞(PBMC)白细胞提取法(Leukopheresed)血用缓冲盐水稀释后覆盖上FICOLL溶液并以2000rpm旋转20分钟。界面处的白细胞被分离出来。利用磁珠子筛选法将共-刺激成分从PBMC中除去。简单地说，就是MCH II型的抗体被偶联到磁珠子上(Dynal Corp.，纽约)。将磁珠子加到PBMC中以便除去含有MHC II型分子的细胞以2-10个珠子/细胞的密度将珠子加到PBMC中并温育1小时。温育后，利用磁性装置将结合了珠子的细胞(APC)除去。所得到的PBMC群大部分不含APC而且含有大于50％的T细胞。
按照以下方法进行增殖试验将1×104的树突细胞加到96-孔培养板的每个孔中并与1ng的抗-CD3抗体进行接触(BD Pharmingen，San Diego，加利福尼亚)。然后，加入1×105的富集T细胞(见上文)，结果使得每孔的最终体积达到0.2ml。将所述板温育26小时，然后用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷进行脉冲。将该板继续温育18小时，然后进行收集并测定掺入的标记物。
T细胞增殖(δcpm)的测定为在有抗-CD3抗体存在下受树突细胞制剂的样品刺激的T细胞中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量与只受树突细胞制剂的样品刺激的T细胞中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量的差值。每一树突细胞制剂的平均δcpm为一式三份样品的平均值。
下面的表1显示了该试验的结果。
表1共-刺激试验
只与抗-CD3抗体一起进行温育的T细胞的平均cpm约为370。这种低水平的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量表明抗-CD3的抗体是以亚最适浓度加入的。只与树突细胞制剂样品进行共培养的T细胞的平均cpm为约2281cpm。相反，与抗-CD3的抗体和树突细胞进行共培养的T细胞的平均δcpm是39747cpm，其标准差为14972cpm。δcpm值的分布是正常的，但明显偏向δcpm值范围的较高端值。
得自正常人供体的树突细胞制剂对照样品的平均δcpm约为51260，其标准差为12,911cpm。基于这些数据，增殖程度为15000δcpm或大于15000δcpm的树突细胞制剂被发现具有可接受的质量。
实施例2抗原非依赖性共-刺激试验的特异性该共-刺激试验基于某些类型的APC刺激抗原-非依赖性的T细胞增殖的能力。进行以下研究以便确定该试验的特异性。
树突细胞制剂中最常见的非-树突细胞类型制备好后被单独用于共-刺激试验并被掺入到特征(对照)树突细胞制备物中。通过利用抗体进行负筛选的磁珠子分离方法由外周血单核细胞(PBMC)纯化出T细胞、B细胞和单核细胞。对于T细胞来说，使用的是针对HLA-DR、CD19和CD56的抗体，对于B细胞使用针对CD2、CD3和CD14的抗体。对于单核细胞来说，使用的是针对CD3、CD19和CD56的抗体。
按照以下步骤实施所述试验如实施例1所记载的，只是在增殖试验中，以T细胞、B细胞核单核细胞代替树突细胞。取代树突细胞使用的T细胞经照射以避免增殖。然后加入同种异体的指示T细胞并且在40小时后按照上文所述方法对增殖情况进行测定。
在共-刺激试验中取代树突细胞而使用的T和B淋巴细胞在任何测试浓度下都不能刺激T细胞。如下表2所示，当以树突细胞的细胞数目的2.5倍加入从PBMC中分离的单核细胞时，该单核细胞能够刺激T细胞的增殖(3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法)。然而，该增殖比利用同等数目的树突细胞所获得的增殖低得多。
表2单核细胞 树突细胞的细胞数目δCPM的细胞数目δCPM5×103～1600050×103～3900025×103～6000 25×103～4300013×103～2000 13×103～320006.3×103～06.3×103～160003.1×103～03.1×103～70001.6×103～01.6×103～20000.8×103～00.8×103～00.4×103～00.45×103～0树突细胞制剂中的CD14阳性、CD11c阳性细胞和CD14阴性、CD11c阳性细胞被发现具有同等的共刺激活性并且两者被认为都属于树突细胞。
实施例3树突细胞的定性CD11c阳性、CD14阳性细胞和CD11c阳性、CD14阴性细胞的共刺激出活性是通过利用抗CD14的标记抗体(Pharmingen)的荧光激活细胞分类法(FACS)从树突细胞制备物中分离出来的。
在这些试验中，得自树突细胞制剂的CD11阳性、CD14阳性细胞和CD11c阳性、CD14阴性细胞似乎具有同等的共刺激活性。因此，两种细胞类型被统称作树突细胞。
实施例4树突细胞的存活力对共-刺激试验的影响根据本发明，测定了死亡细胞对试验的可能影响。简要地说，通过利用1％的甲醛处理30分钟或通过加热到56℃保持1小时将树突细胞杀死。在共-刺激试验中检测这些死亡(被杀死的)细胞悬浮液。将死亡细胞与活的树突细胞以一定的比例混合。除了以下记载的不同方面以外，其它按照上述实施例1中所记载的方式实施该试验，如下列表3和表4所示，加热杀死的树突细胞基本上没有保留本发明共-刺激试验中的活性。正如碘化丙锭染色所测定的结果，甲醛处理的树突细胞仍然保留了约20％的活性树突细胞；这些细胞保留了低水平的共刺激活性。在第三个试验中，被杀死细胞的加入没有对该试验产生干扰。
表3细胞存活力对共-刺激试验的影响
表4死亡细胞对共-刺激试验的影响
实施例5抗原-非依赖性的共-刺激试验的线性加入数目增加的树突细胞至固定数目的指示T细胞确定树突细胞数目与3H-胸腺嘧啶脱氧核苷试验之间的关系。将0，2000，6000或10000个树突细胞加到各孔中。如实施例1所记载的(例如每孔1ng的抗-CD3抗体与105个T细胞)，采用以下培养条件。总培养时间是40小时；最后18小时的培养是在有3H-胸腺嘧啶脱氧核苷存在的条件下进行的。
指示T细胞对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的吸收量基本上是随着树突细胞数目的增加而线性增大的。特别是，观测到的δ分别为0，约7000cpm，约15000cpm和约27000cpm。公式y＝2.7183-134.13(R2＝0.9879)接近该线性关系。这些结果表明共-刺激试验可线性依赖于DC的数目。
实施例6精确度实施例1的共-刺激试验的精确度是通过三个操作者对同-批次(lot)的树突细胞进行试验测定的。每个操作者对所述批次的树突细胞做三次试验，在连续的三天里每天做一次。数据分析是一式两份(试验内方差)、可重复的(试验间方差(variance))和可再现的(操作者间方差)。原始数据如下表5所示。方差系数(CV)范围是从1.25至16.18，低水平的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量观察到较高的CV。
表5共-刺激试验的精确度-原始数据
所有条件都是按一式三份进行的，三份cpm值是以一式两份测量值测定的。利用δcpm分析可重复性和可再现性。每个操作者的δcpm的平均值、标准误差和试验间方差(CV)系数如以下表6所示。1号操作者的CV是57.8％，2号操作者的是14.4％以及3号操作者的是19.6％。再现性是由三个操作者的δcpm的平均值的CV表示的并且为14％。
表6重复性和再现性
实施例6按照以下方式分析负载PSMA的树突细胞将该负载的树突细胞用洗涤剂溶胞，并在7.5％SDS PAGE凝胶的每条泳道中对相当于5×105个细胞的溶胞物进行电泳。在150伏特下电泳约1小时将所述溶胞蛋白离解后，将所述蛋白转移到PVDF或尼龙膜上。利用PSMA-特异性单克隆抗体，4D8(ATCC HB 12487；美国专利US6150508)进行western印迹分析。通过化学发光并对胶片曝光来观测抗体的结合情况。通过共-定位跑胶的标准PSMA蛋白来确定PSMA。
以上提供的实施例是用来进行说明的，而不是用来限制本发明的保护范围的。针对本发明的其它变化形式对于本技术领域的的技术人员来说是显而易见的并且都被包含在所附的权利要求内。因此本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献只是被引入作为参考。
权利要求
1.一种用于确定抗原呈递细胞(APC)的抗原-非依赖性的、共刺激活性的方法，包括提供具有已知功能活性和基本上不具有共刺激活性的T细胞；提供未知共刺激活性的APC的样品；使所述T细胞与亚最适浓度的抗原模拟物接触；使所述T细胞与未知共刺激活性的APC样品接触；确定与抗原模拟物和APC样品接触过的所述T细胞的活化；和将确定的T细胞的活化与T细胞的标准活化指数进行比较从而确定APC的共刺激活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞和APC是同源的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞和APC是异源的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原模拟物是CD3结合剂、植物凝集素或促细胞分裂原。
5.如权利要求4所述的方法，其中CD3结合剂是抗-CD3的抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其中APC是树突细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中树突细胞是源自与树突细胞成熟剂进行体外接触的未成熟树突细胞的成熟树突细胞。
8.如权利要求6所述的方法，其中树突细胞是未成熟树突细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中T细胞基本上不含在其细胞表面表达CD14、CD54、CD80、CD83或CD86分子的外周血单个核细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中T细胞基本上不含在细胞表面表达MHC II型分子的外周血单个核细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷吸收试验确定的。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过分析T细胞的细胞因子的产生来确定的。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述被分析的T细胞细胞因子的产生是IFNγ或白介素2的产生。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述被分析的T细胞细胞因子的产生是胞外细胞因子的产生。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述被分析的T细胞细胞因子的产生是胞内细胞因子的产生。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过检测T细胞活化标记物表达的调节作用来确定的。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述T细胞活化标记物是CD25、CD69、CD44或CD125。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述T细胞活化标记物是利用能够与T细胞活化标记物结合的标记的抗体进行检测的。
19.如权利要求1所述的方法，其中将所确定的活化与标准活化指数进行的比较包括将所确定的T细胞活化与仅接触过树突细胞样品的T细胞的活化进行比较从而确定树突细胞的性质。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述标准活化指数是一个阈值。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述标准活化指数是一个数值范围，每一数值与预定的树突细胞的性质有关。
22.如权利要求1所述的方法，进一步包括确定APC对预定抗原的呈递。
23.如权利要求23所述的方法，其中预定抗原的呈递是通过western印迹、流式细胞计数或抗原-特异性T细胞的活化来确定的。
24.一种用于确定树突细胞制剂的抗原-非依赖性的共刺激活性的方法，包括使第一数量的T细胞与亚最适数量的抗原模拟物进行接触并与未知共刺激活性的树突细胞制剂的第一样品接触，其中所述第一数量的T细胞基本不具有共刺激活性并具有已知的功能活性；确定第一数量的T细胞的第一活化值；使第二数量的T细胞与树突细胞制剂的第二样品或亚最适数量的抗原模拟物进行接触；确定第二数量的T细胞的第二活化值；和将第一与第二活化值进行比较从而确定树突细胞制剂的共刺激活性。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述T细胞与树突细胞制剂是异源的。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述T细胞与树突细胞制剂是同源的。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述抗原模拟物是抗-CD3的抗体、植物凝集素或促细胞分裂原。
28.如权利要求24所述的方法，进一步包括确定树突细胞对预定抗原的呈递。
29.如权利要求28所述的方法，其中预定抗原的呈递是通过western印迹、细胞计数或抗原-特异性T细胞的活化来确定的。
30.一种用于确定树突细胞制剂质量的方法，包括(1)提供共刺激活性未知以及针对预定抗原的抗原呈递能力未知的树突细胞制剂；(2)确定所述树突细胞制剂的共刺激活性，所述共刺激活性的确定包括(a)提供已知功能活性和基本上不具共刺激活性的T细胞；(b)使所述T细胞与亚最适数量的抗原模拟物和树突细胞制剂第一样品接触；(c)确定被接触的T细胞的活化；和(d)将被确定的接触T细胞的活性与T细胞的标准活化指数进行比较从而确定树突细胞制剂的共刺激活性。(3)测定所述树突细胞制剂对预定抗原的呈递，所述呈递的确定包括(a)使树突细胞制剂的第二样品与预定抗原接触；和(b)确定由所述树突细胞呈递的预定抗原的量；和(4)在确定的共刺激活性和确定的预定抗原的抗原-特异性呈递的基础上确定树突细胞的质量。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗原模拟物是CD3结合物、植物凝集素或促细胞分裂原。
32.如权利要求31所述的方法，其中CD3结合物是抗-CD3的抗体。
33.如权利要求30所述的方法，其中树突细胞是源自与成熟剂进行体外接触的未成熟树突细胞的成熟树突细胞。
34.如权利要求30所述的方法，其中树突细胞是未成熟树突细胞。
35.如权利要求30所述的方法，其中T细胞基本上不含在细胞表面表达MHC II型、CD14、CD54、CD80、CD83或CD86分子的外周血单个核细胞。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷增殖试验测定的。
37.如权利要求30所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过分析T细胞的细胞因子的产生来确定的。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述的T细胞细胞因子的产生是IFNγ或白介素2的产生。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述的T细胞细胞因子的产生是胞外细胞因子的产生。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述T细胞细胞因子的产生是胞内细胞因子的产生。
41.如权利要求30所述的方法，其中所述T细胞的活化是通过至少一种T细胞活化标记物的表达来确定的。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述T细胞活化标记物是CD25、CD69、CD44或CD125。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述T细胞活化标记物是利用能够与T细胞活化标记物结合的标记的抗体进行检测的。
44.如权利要求30所述的方法，其中测定共刺激活性包括将所确定的T细胞活化与T细胞的标准活化指数进行比较。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述标准活化指数是一个阈值。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述标准活化指数是一个数值范围，所述数值与不同的预定共刺激活性有关。
47.如权利要求30所述的方法，其中预定抗原的呈递是通过westen印迹、流式细胞计数或抗原-特异性T细胞的活化来确定的。
全文摘要
本发明提供了评估抗原呈递细胞制剂，诸如树突细胞制剂的质量的方法。提供了用于测定T细胞的抗原－非依赖性共－刺激作用和用于测定APC对预定抗原的呈递的试验。
文档编号G01N33/569GK1659285SQ03812711
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月8日 优先权日2002年5月8日
发明者V·G·尚卡, P·A·洛奇, A·N·布鲁内勒 申请人:西北生物治疗药物公司