诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法

专利名称：诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法
技术领域：
概括地说，本发明涉及患有先兆子痫或子痫的被试者的检测和治疗。
背景技术：
先兆子痫是高血压、水肿和蛋白尿的综合征，可影响5-10％的孕妇并导致很多产妇和胎儿发病及死亡。先兆子痫造成全世界每年至少200,000名产妇死亡。先兆子痫的症状通常在怀孕第20周后出现且通常是通过常规监测妇女的血压和尿液而检测出来的。然而，这些监测方法不能有效诊断早期综合征，如果采取有效的治疗，就可减少被试者或发育中胎儿的危险。
目前还没有已知的先兆子痫疗法。先兆子痫的严重程度可从轻度直至威胁生命。轻度的先兆子痫可通过卧床休息和经常监测来治疗。对于中度至重度的病例，建议住院并接受血压药物治疗或抗惊厥药物治疗以防止癫痫发生。如果情况威胁到母亲或婴儿的生命，则要终止怀孕并在足月前分娩出婴儿。
胎儿和胎盘的适当发育是由若干生长因子介导的。这些生长因子中的其中一个是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是内皮细胞-特异性促分裂原、血管生长诱导剂、和血管渗透性的介质。VEGF已经表现出对于肾小球毛细血管修复很重要。VEGF以同型二聚体与两个同源跨膜酪氨酸激酶受体-fms-样酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶结构域受体(KDR)中的一个结合，它们在从很多不同组织获得的内皮细胞中的表达有所不同。Flt-1，而不是KDR由形成胎盘的滋养层细胞高水平表达。胎盘生长因子(P1GF)是VEGF家族的成员，也涉及胎盘的发育。P1GF由细胞滋养层及合胞体滋养层表达且能够诱导内皮细胞的增殖、迁移及活化。P1GF以同型二聚体与Flt-1受体结合，但不与KDR受体结合。P1GF和VEGF均可对促分裂原活性和血管生成作出贡献，而这对于胎盘发育是至关重要的。
近来已经在人脐带静脉内皮细胞的培养基中鉴定了可溶性形式的Flt-1受体(sFlt-1)，且随后在胎盘组织中证实了体内表达。sFlt-1是Flt-1受体的剪接变体，其缺少跨膜和胞质结构域。sFlt-1以高亲和性与VEGF结合，但不会刺激内皮细胞分裂。据信sFlt-1可作为“生理库”发挥作用而负调节VEGF信号途径。因此调节sFlt-1水平可调节VEGF和VEGF信号途径。通过正在发育胎盘中的滋养层细胞小心调节VEGF和PlGF信号途径对于维持适宜的增殖、迁移和血管生成是至关重要的。因此需要一种方法能够准确诊断可能患有或患有先兆子痫的被试者，特别是在最严重的症状发生之前诊断。还需要进行治疗。
发明概述我们已经发现一种在症状发展前，诊断和有效治疗先兆子痫和子痫的方法。
利用基因表达分析，我们已经发现在患有先兆子痫孕妇的胎盘组织样品中，sFlt-1水平显著提高。已知sFlt-1通过起“生理库”的作用而拮抗VEGF和PlGF且，在先兆子痫或子痫妇女中，在含有必需量的这些重要的血管生成和促分裂原因子的胎盘中可能缺少sFlt-1。过量的sFlt-1还可通过破坏维持血脑屏障的内皮细胞和/或排列于脑脉络丛的内皮细胞而导致脑水肿和在子痫中见到的癫痫发生而导致子痫。在本发明中，将提高VEGF和PlGF水平的化合物给予被试者，从而通过拮抗提高的sFlt-1的作用而治疗或预防先兆子痫或子痫。此外，针对sFlt-1的抗体可用于竞争性抑制VEGF或PlGF与sFlt-1的结合，由此提高游离VEGF和PlGF的水平。RNA干扰和反义核酸碱基(nucleobase)寡聚物也可用于降低sFlt-1水平。最终，本发明提供sFlt-1、VEGF、和PlGF作为先兆子痫或子痫、或其倾向的早期诊断和治疗的检测工具的用途和监测。
因此，一方面，本发明提供一种通过给予被试者能够结合sFlt-1的化合物而治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，其中所述给药时间和用量足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。
在相关方面，本发明提供一种通过给予被试者提高能够结合sFlt-1的生长因子水平的化合物(例如，烟碱、茶碱、腺苷、硝苯地平、米诺地尔、或硫酸镁)而治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，其中所述给药时间和用量足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。
另一方面，本发明提供一种通过给予被试者纯化的sFlt-1抗体或其抗原结合片段而治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，其中所述给药时间和用量足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。
在另一相关方面，本发明提供一种通过给予被试者与至少一部分sFlt-1核酸序列互补的反义核酸碱基寡聚物而治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，其中所述给药足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。在其中一个实施方案中，反义核酸碱基寡聚物的长度为8-30个核苷酸。
在另一相关方面，本发明提供一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法。该方法包括给予被试者含有至少一部分sFlt-1核酸序列的双链RNA(dsRNA)的步骤，其中所述给药足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。在其中一个实施方案中，将双链RNA加工成19-25个核苷酸长的小分子干扰RNA(siRNA)。
在上述方面的各实施方案中，所述候选化合物是生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)，包括所有同种型如VEGF189、VEGF121、或VEGF165；胎盘生长因子(P1GF)，包括所有同种型；或其片段。在优选实施方案中，候选化合物是结合sFlt-1的抗体。在上述方面的其它实施方案中，该方法还包括给予被试者抗-高血压的化合物。在上述方面的其它实施方案中，所述被试者是怀孕的人、产后的人、或非-人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗、或猫)。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防先兆子痫或子痫的方法。该方法包括给予需要这种治疗的被试者有效量的含VEGF或PlGF多肽的药物组合物。在其中一个实施方案中，所述组合物含有VEGF多肽。在另一实施方案中，所述组合物含有PlGF多肽。
在相关方面，本发明提供一种治疗或预防先兆子痫或子痫的方法。该方法包括给予需要这种治疗的被试者有效量的含编码VEGF或PlGF的核酸分子的药物组合物。在其中一个实施方案中，所述组合物含有VEGF核酸分子。在另一实施方案中，所述组合物含有PlGF核酸分子。
在另一相关方面，本发明提供一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法。该方法包括给予被试者抑制sFlt-1多肽结合生长因子的化合物(例如，化学化合物、多肽、肽、抗体或其片段)的步骤，其中所述给药足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。在其中一个实施方案中，所述化合物结合sFlt-1并阻断生长因子的结合。
在上述方面的各实施方案中，该方法还包括给予被试者抗-高血压化合物(例如，腺苷、硝苯地平、米诺地尔、和硫酸镁)的步骤。在上述方面的其它实施方案中，被试者是怀孕的人、产后的人、或非-人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗、或猫)。
另一方面，本发明提供一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法包括测量被试者样品中的sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽水平。
在相关方面，本发明提供一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，通过测定被试者样品中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽中至少两个的水平，并使用度量计算sFlt-1、VEGF、或P1GF水平之间的关系，其中被试者样品相对于对照的改变可诊断被试者的先兆子痫或子痫。在其中一个实施方案中，度量是先兆子痫抗-血管生成指数(PAAI)[sFlt-1/VEGF+P1GF]，其中PAAI可用作抗-血管生成活性的指标。在其中一个实施方案中，大于20的PAAI表示先兆子痫或子痫。在另一实施方案中，sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平是通过免疫学测定法，如ELISA测定的。
在上述方面的各实施方案中，样品是体液，如血清或尿液。在其中一个实施方案中，大于2ng/ml的sFlt-1水平可表示先兆子痫或子痫。在上述方面的优选实施方案中，所测量的sFlt-1多肽水平是游离的、结合的或总的sFlt-1多肽水平。在上述方面的其它优选实施方案中，VEGF或P1GF的水平是游离的VEGF或PlGF的水平。
另一方面，本发明提供一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法。该方法包括测量被试者样品中的sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子水平，并把它与参照样品进行比较，其中该水平的改变可诊断被试者的先兆子痫或子痫，或诊断发展先兆子痫或子痫的倾向。
另一方面，本发明提供一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法。该方法包括测定被试者中sFlt-1、VEGF或P1GF基因的核酸序列，并把它与参照序列进行比较，其中被试者核酸序列的改变是被试者中基因产物水平的改变，可诊断患有先兆子痫或子痫的被试者，或发展先兆子痫或子痫的倾向。在其中一个实施方案中，所述改变是核酸序列多态性。
在上述方面的各实施方案中，所述样品是被试者的体液(例如，尿液、羊水、血清、血浆或脑脊液)，其中sFlt-1、VEGR或P1GF可正常检测。在其它实施方案中，所述样品是组织或细胞。非限制性例子包括胎盘组织或胎盘细胞、内皮细胞和白细胞(例如，单核细胞)。在上述方面的其它实施方案中，被试者是未怀孕的人、怀孕的人、或产后的人。在上述方面的其它实施方案中，被试者是非-人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗、或猫)。在上述方面的其它实施方案中，至少一种所测量水平是sFlt-1(游离的、结合的或总的)的水平。在上述方面的其它实施方案中，在测量VEGF水平时，还测量了sFlt-1或PlGF的水平。在上述方面的各实施方案中，sFlt-1核酸或多肽水平相对于对照的提高是先兆子痫或子痫的诊断指标。在上述方面的其它实施方案中，游离VEGF多肽或VEGF核酸水平相对于对照的降低是先兆子痫或子痫的诊断指标。在上述方面的其它实施方案中，游离PlGF多肽或PlGF核酸水平相对于对照的降低是先兆子痫或子痫的诊断指标。
在上述方面的其它实施方案中，两次或多次测量所述水平，而测量之间水平的改变是先兆子痫或子痫的诊断指标。在其中一个优选实施方案中，从第一次测量到下一次测量，sFlt-1的水平提高了。在另一优选实施方案中，从第一次测量到下一次测量，VEGF或PlGF的水平降低了。
另一方面，本发明提供一种用于诊断被试者先兆子痫或子痫的诊断试剂盒，其中包含选自sFlt-1、VEGF及PlGF核酸分子的核酸序列或其片段，或与其互补的序列，或其任意组合。在优选实施方案中，所述试剂盒包含用于检测sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的至少两个探针。
在相关方面，本发明提供一种用于诊断被试者先兆子痫或子痫的试剂盒，它包含检测sFlt-1、VEGF或PlGF多肽及其任意组合的工具。在其中一个实施方案中，检测方法选自免疫学测定、酶测定以及比色测定。在上述方面的其它实施方案中，该试剂盒可诊断出怀孕或未怀孕的被试者发展先兆子痫或子痫的倾向。在上述方面的优选实施方案中，所述试剂盒检测sFlt-1或P1GF。在上述方面的其它优选实施方案中，在试剂盒检测VEGF时，还可检测sFlt-1或PlGF。
另一方面，本发明提供一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，该方法包括使表达sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的细胞与候选化合物接触，并将核酸分子在与候选化合物接触过的细胞中的表达水平和在没有与候选化物接触过的对照细胞中的表达水平进行比较，其中sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子表达水平的改变可鉴定候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
在其中一个实施方案中，所述改变是sFlt-1水平的降低。在其它实施方案中，所述改变是VEGF或PlGF水平的提高。在其它实施方案中，所述改变是转录或翻译的改变。在另一实施方案中，当所述方法鉴定出候选化合物可提高VEGF表达水平时，则该候选化合物还可提高PlGF的表达水平或降低sFlt-1的表达水平。
另一方面，本发明提供一种在药学可接受的载体中配制的、含有VEGF或PlGF多肽或其一部分的药物组合物。
在相关方面，本发明提供一种在药学可接受的载体中配制的、含有PlGF核酸分子或其一部分的药物组合物。在其中一个实施方案中，所述组合物还含有VEGF核酸分子或其一部分。
另一方面，本发明提供一种含有特异性结合sFlt-1的纯化抗体或抗原结合片段的组合物。在其中一个优选实施方案中，所述抗体阻止生长因子与sFlt-1结合。在另一实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在其它优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人类抗体或人源化抗体。在其它实施方案中，所述抗体缺少Fc部分。在其它实施方案中，所述抗体是F(ab′)2、Fab、或Fv结构。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段存在于药学可接受的载体中。
另一方面，本发明提供一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法。该方法包括使表达sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽的细胞与候选化合物接触，并把多肽在与候选化合物接触过的细胞中的表达水平和多肽在没有与候选化合物接触过的对照细胞中的表达水平进行比较，其中sFlt-1、VEGF或PlGF多肽表达的改变可鉴定候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在其中一个实施方案中，表达的改变是利用免疫学测定法、酶测定法或免疫测定法测定的。在其中一个实施方案中，表达的改变是sFlt-1水平的降低。在另一实施方案中，表达的改变是VEGF或PlGF水平的提高。
另一方面，本发明提供一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法。该方法包括使表达sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的细胞与候选化合物接触，并将多肽在与候选化合物接触过的细胞中的生物学活性和在没有与候选化合物接触过的对照细胞中的生物学活性水平进行比较，其中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽生物学活性的提高可鉴定该候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在其中一个实施方案中，生物学活性的提高是用免疫学测定法、酶测定法或免疫测定法测定的。在其中一个实施方案中，表达的改变是sFlt-1活性的降低。在另一实施方案中，表达的改变是VEGF或PlGF活性的提高。
另一方面，本发明提供一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法。该方法包括在有候选化合物存在的条件下检测sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，其中相对于没有候选化合物存在的条件下sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，所述结合的降低可鉴定该候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在其中一个实施方案中，所述生长因子是VEGF。在另一实施方案中，所述生长因子是PlGF。
另一方面，本发明提供一种鉴定可阻止sFlt-1多肽与生长因子之间结合的多肽或其片段的方法。该方法包括检测有候选多肽存在条件下的sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，其中相对于没有候选多肽存在条件下的sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，所述结合的降低可鉴定该候选多肽为可阻止sFlt-1多肽与生长因子之间结合的多肽。在其中一个实施方案中，所述生长因子为VEGF。在另一实施方案中，所述生长因子为PlGF。
另一方面，本发明提供一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，包括检测sFlt-1多肽与候选化合物的结合，其中结合sFlt-1多肽的化合物可改善先兆子痫或子痫。
在相关方面，本发明提供一种根据前述方面鉴定的化合物，其中所述化合物是特异性结合sFlt-1多肽且阻止sFlt-1多肽与VEGF或PlGF结合的多肽。在其中一个优选实施方案中，所述多肽是抗体。在另一优选实施方案中，所述多肽是sFlt-1、VEGF或P1GF的片段。
在上述方面的优选实施方案中，可改善先兆子痫或子痫的化合物可降低sFlt-1的表达水平或生物学活性。在上述方面的优选实施方案中，可改善先兆子痫或子痫的化合物可提高VEGF或PlGF的表达水平或生物学活性。
就本发明的目的而言，在现面定义了下列缩略语和术语。
“改变”是指通过标准的本领域已知的方法，如上面描述的那些检测的基因或多肽表达水平的改变(提高或降低)。此处所用的，提高或降低包括表达水平10％的改变、优选表达水平25％的改变、更优选40％的改变、且最优选50％或更大的改变。“改变”还指本发明任一多肽(例如，sFlt-1、VEGF或P1GF)的生物学活性的改变(提高或降低)。PlGF或VEGF生物学活性的例子包括通过免疫测定法、配体结合测定法或斯卡查德图分析测量的与受体的结合，以及通过BrdU标记、细胞计数实验、或DNA合成的定量测定法，如3H-胸腺嘧啶核苷掺入测量的细胞增殖或迁移的诱导。sFlt-1生物学活性的例子包括通过免疫测定法、配体结合测定法或卡查德图分析测量的与PlGF和VEGF的结合。此处描述了每种多肽生物学活性的其它例子。此处所用的提高或降低包括生物学活性的10％改变、优选生物学活性的25％改变、更优选40％改变、且最优选50％或更大改变。
“反义核酸碱基寡聚物”是指核酸碱基寡聚物，不管多长，其与sFlt-1基因的编码链或mRNA互补。“核酸碱基寡聚物”是指包括至少8个核酸碱基、优选至少12个、且最优选至少16个碱基链的化合物，它们是通过键连接在一起的。包括在此定义中的是天然和非天然的寡核苷酸，修饰和未修饰的，以及寡核苷酸模拟物如蛋白核酸、闭锁的核酸、以及阿拉伯核酸。很多核酸碱基和连接基团都可用于本发明的核酸碱基寡聚物中，包括在美国专利申请号Nos.20030114412和20030114407中描述的那些，它们引入此处作为参考。所述核酸碱基寡聚物还可指向翻译的起始和终止位点。优选所述反义核酸碱基寡聚物包含约8-30个核苷酸。该反义核酸碱基寡聚物还可包含至少40、60、85、120或更多连续的核苷酸，它们与sFlt-1 mRNA或DNA互补，且可像全长mRNA或基因一样长。
“化合物”是指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、多肽、或其片段。
“嵌合抗体”是指至少含有与至少一部分其它蛋白相连的抗体分子的抗原结合部分的多肽(通常，免疫球蛋白的恒定结构域)。
“双链RNA(dsRNA)”是指由正义和反义链组成的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介导RNA干扰。
“表达”是指通过标准的本领域已知的方法检测基因或多肽。例如，多肽表达常常通过蛋白质印迹检测，DNA表达常常通过DNA印迹或聚合酶链反应(PCR)检测，而RNA表达常常通过RNA印迹、PCR、或RNA酶保护测定法检测。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。该部分包括，优选，对照核酸分子或多肽整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％。片段可包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。
“同源的”是指就比较序列的长度而言，具有与已知基因或蛋白序列至少30％同源性、更优选40％、50％、60％、70％、80％，且最优选90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列。“同源性”蛋白还可具有比较蛋白的至少一种生物学活性。就多肽而言，比较序列的长度通常为至少16个氨基酸、优选至少20个氨基酸、更优选至少25个氨基酸、且最优选35个氨基酸或更多。就核酸而言，比较序列的长度通常为至少50个核苷酸、优选至少60个核苷酸、更优选至少75个核苷酸、且最优选至少110个核苷酸。“同源性”还指用于产生抗体的表位与抗体针对的蛋白或片段之间的高度相似性。加入这样的话，同源性是指足以引发特异性识别争论蛋白的抗体产生的相似性。
“人源化抗体”是指能够结合预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段。通常，所述抗体包含两个轻链以及至少一个重链的可变结构域。所述抗体还包括重链的CH1、铰链区、CH2、CH3、或CH4区。所述人源化抗体包括主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的构架区(FR)以及主要具有非-人类免疫球蛋白氨基酸序列(“输入”序列)的互补决定区(CDR)。
通常，人源化抗体具有引入其中的一个或多个氨基酸，其来源是非-人类。通常，人源化抗体基本上包含至少一个、且通常两个，可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR区与非人类免疫球蛋白的那些相对应且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体最优选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的一部分。
“互补决定区(CDR)”是指每个免疫球蛋白的轻链和重链内，可变区中的三个高变序列。
“构架区(FR)”是指位于免疫球蛋白轻链和重链的三个高变序列(CDR)任何一侧上的氨基酸序列。
人源化抗体的FR和CDR区无需与亲代序列准确对应，例如，输入CDR或共有FR可通过至少一个残基的置换、插入或缺失而被诱变，这样该位点的CDR或FR残基不与共有或输入抗体相对应。这种突变，然而，不会不会扩展。通常，至少75％、优选90％、且最优选95％的人源化抗体残基与亲代FR和CDR序列的那些相对应。
“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列或其一部分之间形成双链分子的对(见，例如，Wahl和Berger(1987)MethodsEnzymol.152399；Kimmel，Methods Enzymol.152507，1987)。例如，严格的盐浓度通常低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且最优选低于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。严格性差的杂交可在没有有机溶剂，例如甲酰胺存在的条件下获得，而严格杂交可在有至少约30％甲酰胺，且最优选至少约50％甲酰胺存在的条件下获得。严格的温度条件通常包括至少约30℃，更优选至少约37℃，且最优选至少约42℃的温度。各种其它参数，如杂交时间，洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，以及是否包括载体DNA都是本领域技术人员熟知的。各种严格水平是通过根据需要把这些不同条件结合完成的。在优选实施方案中，杂交是30℃下，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中进行的。在更优选的实施方案中，杂交是37℃下，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中进行的。在最优选的实施方案中，杂交是42℃下，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺、和200μg/ml ssDNA中进行的。这些条件的有效改变对于本领域技术人员是显而易见的。
对于绝大多数应用而言，杂交之后的洗涤步骤还可根据严格程度不同而改变。洗涤的严格条件可由盐浓度和温度来限定。如上所述，洗涤的严格程度可通过降低盐浓度或提高温度来提高。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选低于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、且最优选至少约68℃的温度。在优选实施方案中，洗涤步骤在25℃下，30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的实施方案中，洗涤步骤在42℃下，15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在最优选的实施方案中，洗涤步骤在68℃下，15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。这些条件的其它改变对于本领域技术人员是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723961，1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NewYork，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等人，Molecular CloizingA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。
“子宫内生长停滞(IUGR)”是指导致出生重量相对于胎儿孕龄的预测胎儿重量低10％的综合征。目前世界卫生组织有关低出生重量的标准是重量低于2,500gm(5lbs.8oz.)或与美国根据有关种族、经产情况和婴儿性别，相对于孕龄制订的出生重量表格低于10％(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86200-208，1995)。这些低出生重量的婴儿还被称作“孕龄小(SGA)”。已知先兆子痫是与IUGR或SGA有关的病症。
“度量”是指一种测量。度量可用于，例如，比较目标多肽或核酸分子的水平。举例性的度量包括但不限于，数学公式或算法，如比例。所用度量可最好地区别患有先兆子痫或子痫的被试者与正常对照被试者之间的sFlt-1、VEGF、或PlGF水平。根据所用度量不同，子痫或先兆子痫的诊断指标可明显高于或低于对照值(例如，与未患先兆子痫或子痫的对照患者相比)。
sFlt-1水平是通过测量游离的、结合的(即与生长因子结合的)、或总的sFlt-1(结合的+游离的)量而测量的。VEGF或P1GF水平是通过测量游离的PlGF或游离的VEGF(即，未与sFlt-1结合)的量而测定的。其中一个举例性的度量是[sFlt-l/(VEGF+P1GF)]，也被称作先兆子痫抗-血管生成指数(PAAI)。
“先兆子痫抗-血管生成指数(PAAI)”是指用作抗-血管生成活性指标的sFlt-1/VEGF+P1GF的比例。大于20的PAAI被认为可指示先兆子痫或有患先兆子痫的危险。
“可操纵连接”是指在适宜的分子(例如，转录激活蛋白)与调节序列结合时，基因和调节序列以允许基因表达的方式连接。
“药学可接受的载体”是指对于所治疗的哺乳动物而言是生理学可接受的且仍然保留了所给予化合物的治疗性的载体。其中一个举例性的药学可接受的载体物质是生理盐水。其它生理可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的且在下列文献中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盘生长因子(PlGF)”是指哺乳动物生长因子，它与Genebank登记号P49763限定的蛋白同源且具有PlGF生物学活性。P1GF是属于VEGF家族的糖基化同型二聚体且可通过选择性剪接机理在两个不同的同种型中发现。P1GF被胎盘中的细胞-及合胞体滋养层表达，且PlGF生物学活性包括内皮细胞，特别是滋养层细胞增殖、迁移、及活化的诱导。
“先兆子痫”是指多-系统疾病，其特征在于具有蛋白尿或水肿、或两者、肾小球功能异常、脑水肿、肝水肿、或凝血异常的高血压，这是由于怀孕或新近怀孕的影响。先兆子痫通常发生在妊娠第20周后。先兆子痫通常被定义为下列症状的一些组合(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)，(2)新发生的蛋白尿(利用测验片进行尿液分析为1+，24-小时尿液收集品中的蛋白＞300mg，或单次随机的尿液样品的蛋白/肌酐比例＞0.3)，和(3)产后12周高血压及蛋白尿消失。严重的先兆子痫通常被定义为(1)舒张BP＞110mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)或(2)蛋白尿，其特征在于24-小时尿液收集品中的蛋白测量值为3.5g或更高，或利用测验片测量，2份随机的尿液样品具有至少3+蛋白。在先兆子痫中，高血压和蛋白尿通常彼此在7天内发生。在严重的先兆子痫中，可同时出现严重的高血压、严重的蛋白尿和HELLP综合征(溶血、肝酶升高、血小板较低)或子痫或每次仅出现一个症状。有时候，严重的先兆子痫可导致癫痫发生进一步发展。这种严重的综合征形式被称作“子痫”。子痫还可包括若干器官或组织，如肝脏(例如，肝细胞损害、门静脉周坏死)和中枢神经系统(例如，脑水肿和脑出血)的功能异常或损害。癫痫发生的病因被认为继发于脑水肿和肾脏小血管病灶痉挛。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”是指任何多于2个氨基酸的链，不管翻译后的修饰(例如，糖基化或磷酸化)，构成天然存在的多肽或肽的全部或一部分，或构成非天然存在的多肽或肽。
“降低或抑制”是指通过前述测定法(见“表达”)检测的，与没用RNA干扰所用的反义核酸碱基寡聚物或dsRNA处理过的样品相比，引起蛋白或核酸水平整体降低优选20％或更多、更优选50％或更多、且最优选75％或更多的能力。
“小分子干扰RNA(siRNA)”是指分离的dsRNA分子，优选长度超过10个核苷酸，更优选长度超过15个核苷酸，且最优选长度超过19个核苷酸，其用于鉴定将要降解的靶基因或mRNA。19-25个核苷酸是siRNA的最优选大小。siRNA还可包括短发夹RNA，其中siRNA双螺旋的两个链包括在单一的RNA分子中。siRNA包括任何形式的dsRNA(较大的dsRNA、部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA的蛋白酶裂解产物)以及不同于天然存在的RNA、通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而被改变的RNA。这种改变可包括非-核苷酸物质的添加，例如向21 to 23 nt RNA的末端添加或内部添加(在RNA的一个或多个核苷酸上)。在优选实施方案中，所述RNA分子包含3′羟基。本发明RNA分子中的核苷酸还可包括无链的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。共同地，所有这种改变过的RNA被称作RNA的类似物。本发明的siRNA只需与天然RNA充分相似，它具有介导RNA干扰(RNAi)的能力。此处所用的RNAi是指通过在细胞或生物中引入小分子干扰RNA或dsRNA所致的特异性mRNA分子的ATP-依赖性靶向裂解和降解。此处所用的“介导RNAi”是指区别或鉴定所降解RNA的能力。
“可溶性Flt-1(sFlt-1)”(也称作VEGF-R1)是指可溶性形式的Flt-1受体，其与Genebank登记号U01134定义的蛋白同源，且具有sFlt-1生物学活性。sFlt-1多肽的生物学活性可使用任何标准方法测定，例如，通过测定与VEGF结合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受体的跨膜结构域和胞质酪氨酸激酶结构域。sFlt-1可以高亲和性结合VEGF和PlGF，但不能诱导增殖或血管生成，且因此与Flt-1和KDR受体在功能上有所不同。sFlt-1最初是从人脐带内皮细胞纯化的且随后显示出在体内由滋养层细胞产生。此处所用sFlt-1包括任何sFlt-1家族成员或同种型。
“特异性结合”是指识别并结合本发明多肽但基本上不识别并结合样品，例如生物学样品中其它分子的化合物或抗体，其自然包括本发明多肽。其中一个例子是特异性结合sFlt-1但不结合Flt-1的抗体。
“被试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人类或除人类以外的哺乳动物，如牛、马、狗、羊或猫。包括在该定义中的是怀孕、产后和未怀孕的哺乳动物。
“基本上相同”是指仅仅由于保守氨基酸置换而不同的氨基酸序列，例如，用一个氨基酸置换相同种类的另一氨基酸(例如，用缬氨酸置换甘氨酸，用精氨酸置换赖氨酸等)或位于不会破坏蛋白功能的氨基酸序列位置上的一个或多个非-保守置换、缺失或插入。优选，所述氨基酸序列与另一氨基酸序列至少70％、更优选至少约80％、且最优选至少约90％同源。测定同一性的方法可在公共可得到的计算机程序中实现。测定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12387，1984)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。BLAST程序可从NCBI和其它来源公开得到(BLAST Manual，Altschul等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；BLAST 2.0，http//www.nobi.nlm.nih.gov/blast/)。这些软件程序通过排列与各种置换、缺失和其它修饰的同源性程度而匹配相似的序列。保守置换通常包括下列组内的置换甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子痫的症状”是指下列任何一个(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg，(2)新发生的蛋白尿(利用测验片进行尿液分析为1+，24小时尿液收集品中的蛋白＞300mg，或随机尿液的蛋白/肌酐比＞0.3)，和(3)产后12周高血压及蛋白尿消失。先兆子痫的症状还可包括肾功能异常和肾小球内皮增生或肥大。“子痫的症状”是指由于怀孕或新近怀孕所致的下列症状中任何一个的发展癫痫发生、昏迷、血小板减少症、肝水肿、肺水肿和脑水肿。
“治疗量”是指给予患有先兆子痫或子痫的患者时，足以引起此处所述先兆子痫或子痫症状的定性或定量减轻的用量。“治疗量”还指当给予患有先兆子痫或子痫的患者时，通过此处所述的测定法测量，足以引起sFlt-1表达水平降低或VEGF或PlGF表达水平提高的用量。
“治疗”是指为了预防和/或治疗的目的，给予化合物或药物组合物。“治疗疾病”或“治疗性处理”是指给已经患病的被试者进行治疗以改善被试者状况。优选，以下述任何一个特征症状的鉴定为基础或使用此处所述的诊断方法，诊断被试者是否患有先兆子痫或子痫。“预防疾病”是指还没有发病，但被怀疑，或有发展特定疾病危险的被试者的预防性处理。优选，使用此处所述的诊断方法确定被试者是否有发展先兆子痫或子痫的危险。因此，在权利要求和实施方案中，治疗是为了治疗或预防目的而对哺乳动物给药。
“滋养层”是指覆盖胚泡的中外胚细胞层，胚泡可侵蚀子宫粘膜且胚胎通过它从母体接受营养；该细胞有助于胎盘的形成。
“血管内皮生长因子(VEGF)”是指与下列文献中定义的生长因子同源的哺乳动物生长因子美国专利号Nos.5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等人(Biol.Reproductoion，481120-1128，1993)，且具有VEGF生物学活性。VEGF以糖基化同型二聚体的形式存在且包括至少4种不同的可选择性剪接同种型。天然VEGF的生物学活性包括促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长并诱导血管生成。正如此处所述，VEGF包括任何VEGF家族成员或同种型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165、或VEGF121)。优选，VEGF是VEGF121或VEGF165同种型(Tischer等人，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等人，Cancer Metastasis 15153-158，1996)，其在美国专利号Nos.6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述，它们引入此处作为参考。还包括VEGF的突变体形式，如在Gille等人(J.Biol.Chem.2763222-3230，2001)中描述的KDR-选择性VEGF和Flt-选择性VEGF。虽然优选人的VEGF，但本发明不限于人类的形式且包括VEGF的其它动物形式(例如，小鼠、大鼠、狗、或小鸡)。
“载体”是指DNA分子，通常来源于质粒或噬菌体，其中可插入或克隆DNA片段。重组载体包括一个或多个独特的限制位点，且能够在规定的宿主或载体生物中自主复制，这样克隆序列就可再生了。载体包括与基因或编码区可操纵连接的启动子这样，转染到受体细胞中后，就可表达RNA了。
从下列优选实施方案以及权利要求的描述，可很容易地了解本发明的其它特征和优点。
附图简述

图1表示sFlt-1在先兆子痫中的mRNA和蛋白表达。图1A表示通过RNA印迹分析测定的，来源于3名先兆子痫患者(P1、P2、P3)和3名血压正常的足月孕妇(N1、N2、N3)的胎盘sFlt-1的mRNA表达。上面的带(7.5kb)是全长flt-1 mRNA，而下面更丰富的带(3.4kb)是可选择性剪接的sFlt-1 mRNA。GAPDH作为对照包括在内且箭头表示28S RNA。患者P1和P2患有重度先兆子痫，而患者P3患有轻度先兆子痫。图1B表示轻度先兆子痫(轻度PE)患者、重度先兆子痫(重度PE)患者以及血压正常的足月孕妇血清中sFlt-1水平的图形。sFlt-1水平是通过相对于sFlt-1进行的ELISA测量的，其中使用可商业得到的试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)。由于其它原因在足月前分娩的患者(足月前)也包括在内作为附加对照，以排除孕龄特异性改变。所试验的患者数在X轴的括号中表示。在分娩前(t＝0)和分娩后(t＝48)采集样品。图1C是表示分娩时抗-血管生成指数比例(PAAI＝sFlt-1/(VEGF+P1GF))的图形，这是通过ELISA相对于图1B中描述的所有患者测定的。
图2A-2F是表示过量sFlt-1在先兆子痫中的抗-血管生成作用。内皮管测定法是使用来源于4名正常孕妇对照和4名患有先兆子痫患者的血清进行的。给出了1名正常对照和1名先兆子痫患者的代表性实验。图2A、2B、和2C表示使用正常患者血清进行的测定，而图2D、2E、和2F表示使用先兆子痫患者的血清进行的测定。在图2A中，t＝0(来源于足月正常孕妇的10％血清)；在图2B中，t＝48(来源于分娩后48小时的正常孕妇的10％血清)；在图2C中，t＝0+外源性sFlt-1(10ng/ml)；在图2D中，t＝0(来源于分娩前先兆子痫妇女的10％血清)；在图2E中，t＝48(来源于分娩后48小时先兆子痫妇女的10％血清)；在图2F中，t＝0+外源性VEGF(10ng/ml)+P1GF(10ng/ml)。管测定法是定量的且平均管长度+/-SEM在每组底部以像素表示。
图3A和3B是表示sFlt-1对VEGF和PlGF诱导的肾微血管舒张的抑制的图形。图3A表示在3个不同剂量下测量的，大鼠肾小动脉对sFlt-1(S)、VEGF(V)、PlGF(P)的舒张反应的提高。V+和P+代表在有100ng/ml sFlt-1存在的条件下，各试剂的血管舒张反应。所有实验是在6只不同的解剖过的大鼠肾微血管中进行的，数据以平均值+/-SEM表示。*代表与单独的各试剂相比，具有p＜0.01的统计学显著性。图3B表示生理学剂量下舒张反应的提高VEGF 100pg/ml(V)、P1GF500pg/ml(P)、sFlt-1 10ng/ml(S)、VEGF(100pg/ml)+P1GF500pg/ml(V+P)或VEGF(100pg/ml)+P1GF 500pg/ml+sFlt-110ng/ml(V+P+S)。所有实验都是在6只不同的解剖过的大鼠肾微血管中进行的且数据以平均值+/-SEM表示。*代表与V+P相比，具有p＜0.05的统计学显著性。
图4A和4B表示肾小球内皮增生的sFlt-1诱导。图4A是表示与对照相比，在具有扩大的肾小球和膨胀的胞质的sFlt-1处理过的动物中，毛细管闭塞的苏木紫和曙红(H&E)染色的显微照片。具有起泡胞质的“肾小球内皮增生”在sFlt-1处理过的动物中表示，其中进行定期席夫酸(PAS)染色。所有浅的显微照片都是在60X原始放大倍数下拍摄的。图4B是sFlt-1处理过的肾小球电子显微照片，它证实了内皮毛细管细胞的胞质膨胀。纤维蛋白的免疫荧光(IF)照片是在40X下拍摄的，EM照片是在2400X的原始放大倍数下拍摄的。所有照片在相同的放大倍数下是可再现的。
图5A-5C表示先兆子痫发生之前和之后，依据孕龄测量的sFlt-1水平。图5A是表示血压正常的对照(具有空心三角形的较浅的线)、先兆子痫之前的病例(实心圆形)、和先兆子痫之后的病例-分娩前4-5周孕龄窗口内的“终点”样品(实心正方形)的平均血清浓度pg/ml的曲线图。括号表示平均值的标准差。星号表示对数转换后，相对于相同孕龄窗口内的参照样品的显著性差异*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。图5B是表示在先兆子痫发生前以周为间隔的时间内，先兆子痫发生之前和之后病例的sFlt-1平均血清浓度pg/ml的曲线图。PE表示43份样品的算术平均值(在先兆子痫发生时或发生后获得的)。平均孕龄(天)在下面每个时间间隔下用圆括号表示。水平线表示终点样品水平。垂直线区分先兆子痫前的周期≤5周。图5C是表示以孕龄为窗口表示sFlt-1平均血清浓度pg/ml的曲线图，其中包括血压正常的对照和先兆子痫之前的病例，排除了先兆子痫发生5周内获得的样品。没有显著性差异。
图6A-6C表示按孕龄，先兆子痫之前和之后的PlGF水平。图6A是表示分娩和生产之前获得的所有样品的PlGF水平的曲线图。方括号表示平均值的标准差。星号表示进行对数转换后，相对于同一时间间隔内的参照样品的显著性差异**p＜0.01、***p＜0.001。图6B是表示在先兆子痫发生前以周为间隔的时间内，先兆子痫发生之前和之后的病例PlGF平均血清浓度pg/ml的曲线图。PE表示43份终点样品的算术平均值(先兆子痫发生时或发生之后获得的)。平均孕龄(天)在每个时间间隔下面的圆括号中表示。水平线表示终点样品的水平。垂直线表示先兆子痫发生之前的周期≤5周。图6C是表示以孕龄为窗口，PlGF的平均血清浓度pg/ml，其中包括血压正常的对照和先兆子痫发生的病例。
图7A和7B表示根据先兆子痫的状况和严重程度，sFlt-1和P1GF的水平。图7A是表示妊娠第23-32周时，sFlt-1(黑条)和P1GF(白条)的算术平均血清浓度，其中包括对照和下列病例(临床疾病发生前)患有轻度先兆子痫、重度先兆子痫、发生＜37周的先兆子痫、婴儿孕龄较小(SGA)的先兆子痫、和发生＜34周的先兆子痫。在下面每对栏下记录了样品数。对孕龄和体重指数的校正导致微小改变，但不会影响显著性水平。图7B是表示妊娠第33-41周时，sFlt(黑条)和PlGF(白条)算术平均血清浓度的曲线图，其中包括对照和下列病例(临床疾病发生前)患有轻度先兆子痫、重度先兆子痫、发生＜37周的先兆子痫、具有SGA婴儿的先兆子痫。在下面每对栏下记录了样品数。对孕龄和体重指数的校正导致微小改变，但不会影响显著性水平。
详述我们已经发现在从先兆子痫妇女采集的血清样品中sFlt-1水平提高。sFlt-1以高亲和性结合VEGF和P1GF并阻断这些生长因子的促分裂和血管生成活性。因此，sFlt-1是先兆子痫极好的诊断标记，且VEGF和PlGF可用于治疗先兆子痫。此外，我们已经发现干扰sFlt-1与纯化VEGF或PlGF结合的治疗剂、或提高生物活性的VEGF或PlGF水平的药剂可用于治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。这类药剂包括，但不限于，降低sFlt-1水平的sFlt-1抗体、反义或RNAi的寡核苷酸，提高VEGF或PlGF水平的化合物，以及结合sFlt-1并阻断生长因子结合位点的小分子。本发明还提供用于测量生长因子水平的方法；可用作早期检测先兆子痫或发展先兆子痫或子痫的危险增加的诊断工具的方法。
而此处提供的详细描述特别涉及sFlt-1、VEGF、或PlGF，该详述还可用于sFlt-1、VEGF、或PlGF家族的成员、同种型、和/或变体、以及结合sFlt-1的生长因子对于本领域技术人员是显而易见的。下列实施例用于举例说明本发明，而不能被解释为对本发明的限制。
实施例1.先兆子痫孕妇中的sFlt-1 mRNA和蛋白水平提高在鉴定新的分泌因子的尝试中，该分泌因子在先兆子痫中发挥病理学作用，我们使用Affymetrix U95A微排列晶片完成了患有或没有先兆子痫妇女的胎盘组织的基因表达分布。我们发现sFlt-1的基因在患先兆子痫的妇女中被正调节。
为了证实sFlt-1在先兆子痫中的正调节，我们进行RNA印迹以分析胎盘sFlt-1 mRNA水平(图1A)并进行ELISA测定以测量先兆子痫孕妇中sFlt-1的血清蛋白水平(图1B)，并与血压正常的孕妇进行比较。先兆子痫被定义为(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张BP＞90mmHg，(2)新发生的蛋白尿(利用测验片进行尿液分析为1+，24小时尿液收集品中的蛋白＞300mg，或随机的尿蛋白/肌酐比例＞0.3，和(3)产后12周，高血压及蛋白尿消失。排除潜在的高血压、蛋白尿、或肾病患者。以是否存在肾脏范围的蛋白尿(24小时尿液收集品中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酐比例大于3.0)为基础，将患者分成轻度先兆子痫和重度先兆子痫。轻度先兆子痫组中的平均尿蛋白/肌酐比例为0.94+/-0.2，而重度先兆子痫组为7.8+/-2.1。各组的平均孕龄如下正常38.8+/-0.2周、轻度先兆子痫34+/-1.2周、重度先兆子痫31.3+/-0.6周、和足月前29.5+/-2.0周。分娩后立即获得胎盘样品。从每个胎盘随机采集4份样品，然后放在RNA稳定溶液(Ambion，Austin，TX)中并在-70℃贮藏。使用Qiagen RNAeasy Maxi Kit(Qiagen，Valencia，CA)进行RNA分离。
我们检测到与血压正常的孕妇相比，在先兆子痫孕妇中，胎盘sFlt-1 mRNA和产妇的血清sFlt-1蛋白均提高了。与正常的对照孕妇相比，重度先兆子痫患者中sFlt-1的平均血清水平几乎要高4倍。为了排除这种作用是由于先兆子痫病例孕龄较早的可能性，我们还测量了由于其它原因早产的孕龄匹配、血压正常妇女的sFlt-1水平(孕龄23-26周)，我们发现与血压正常的足月孕妇相比该组没有显著性差异。RNA印迹所用的探针是通过PCR获得的，且在源于pUC118人flt-1 cDNA的编码区中包括一个500bp的片段，及用作标准化对照的GAPDH cDNA。
在正常孕妇中，由胎盘分泌的促-和抗-血管生成因子之间存在着一种平衡，这是适当胎盘发育所需的。我们假设在先兆子痫中，sFlt-1产生的提高和VEGF及PlGF产生的降低可改变有利于抗-血管生成的平衡。为了研究净抗-血管生成活性，我们测量了VEGF和P1GF血清水平并发现与正常对照患者相比，先兆子痫患者的P1GF和VEGF血清水平更低(平均PlGF，235.3+/-45.3pg/ml对464+/-116.6pg/ml)，正如已经描述过的(Tidwell等人，Am.J.Obstet.Gynecol.，1841267-1272，2001)。当我们把sFlt-1、VEGF和PlGF水平引入到抗-血管生成指数或PAAI中时，作为净抗-血管生成活性的指标，我们发现我们可很清楚地将先兆子痫患者与正常患者区别开来且PAAI似乎与先兆子痫的严重程度有关(图1C)。该PAAI可用作检测孕妇先兆子痫的诊断工具。
实施例2.在体外内皮管测定法中，先兆子痫妇女的血清可抑制血管生成我们假设先兆子痫患者中的过量循环sFlt-1可引起内皮功能异常并导致抗-血管生成状态。为了解决这个问题，我们使用内皮管测定法作为血管生成的体外模型。将生长因子减少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在预冷的48孔细胞培养平板的孔(100μl/孔)中，37℃下培养25-30分钟进行聚合。用平板接种在涂有Matrigel孔上的10％患者血清处理通道3-5上的人脐带静脉内皮细胞(30,000+，300μl没有血清的内皮基础培养基，Clonetics，Walkersville，MD)，并在37℃下培养12-16小时。然后通过倒置相差显微镜(Nikon Corporation，Tokyo，Japan)在4X下评价管的形成，使用Simple PCI成像分析软件进行定量分析(管的面积和总长度)。
调节管形成测定法的条件，使正常的人脐带静脉内皮细胞仅在有外源性生长因子，如VEGF存在的条件下形成管。在这些条件下，我们发现来源于血压正常妇女的血清可诱导内皮细胞形成规则的管-样结构，来源于先兆子痫妇女的血清抑制管的形成(图2)。特别是产后48小时，这种抗-血管生成作用消失，表明先兆子痫患者的血清对管的抑制可能是由于胎盘释放的循环因子所致。当以和在先兆子痫患者中发现的那些相似的剂量将sFlt-1加入到血压正常的血清中时，不会发生管的形成，类似使用先兆子痫妇女血清见到的作用。当把外源性VEGF和P1GF加入到使用先兆子痫血清的测定法中时，管的形成恢复(图2)。重组人VEGF、人P1GF、和人Flt-l Fc用于这些测定法中。这些结果表明先兆子痫血清的抗-血管生成性是由于内源性sFlt-1对VEGF和PlGF的拮抗作用。这些结果还表明加入纯化VEGF和/或PlGF可逆转或减轻先兆子痫的情况并可治疗性使用。
实施例3.sFlt-1可抑制VEGF和P1GF诱导的肾微血管舒张sFlt-1在血管收缩中的成因作用是利用体外微血管反应性实验测定的。微血管反应性实验是按照先前所述，使用大鼠肾微血管进行的(Sato等人，J.Surg.Res.，90138-143，2000)。使用10x-60x解剖显微镜(Olympus Optical，Tokyo，Japan)从大鼠肾脏解剖肾动脉微血管(70-170μm内径)。将微血管放在单独的微血管室中，用测量30-60μm直径的双玻璃微量吸管插管，并用10-0尼龙单丝缝线(Ethicon，Somerville，NJ)缝合。通过血管室及含有总共100ml溶液的贮器连续循环温热至37℃的氧化(95％氧和5％二氧化碳)Krebs’缓冲溶液。使用填充了Kreb’s缓冲溶液的滴定管压力计将血管加压至40mmHg非流动状态。用与摄像机连接的倒置显微镜(40x-200x；Olympus CK2，Olympus Optical)，将血管的像投射在黑白电视监测器上。电子维数分析器(Living System Instrumentation，Burlington，VT)用于测量内腔直径。用带状图表记录器(Graphtec，Irvine，CA)记录测量值。在进行任何干预之前，将血管在微血管室中浸至少30分钟。在所有实验组中，肾脏微血管的舒张反应是在微血管预-收缩后，用U46619(血栓烷激动剂)检测的，在40mmHg的扩张压下达到它们基线直径的40-60％。一旦达到稳定的状态，检测VEGF、PlGF和sFlt-1对各种试剂的反应。重组大鼠VEGF、小鼠P1GF和小鼠Flt-l Fc用于这些测定法。所有药物都是腔外应用的。当反应达到稳定时进行测量(通常是给药后2-3分钟)。对每个血管进行1-4次干预。用Krebs’缓冲溶液洗涤血管并在干预之间，在没有药物的Krebs’缓冲溶液中平衡20-30分钟。
我们发现单独的sFlt-1不会引起显著的血管收缩，然而它可阻断VEGF或PlGF诱导的血管收缩的剂量反应性提高(图3A)。此外，我们发现在孕妇中见到的生理学水平的VEGF和P1GF可诱导显著的剂量依赖性小动脉舒张，且该作用可通过加入10ng/ml sFlt-1而被阻断，这是一种在重度先兆子痫妇女中观察到的浓度(图3B)。该结果表明先兆子痫患者中的循环sFlt-1可拮抗血管舒张，由此导致高血压。这些结果可支持sFlt-1导致先兆子痫的许多临床和病理学症状，包括高血压的结论。通过定向抗体的使用所致的sFlt-1抑制，例如，可逆转蛋白在先兆子痫妇女中的作用，且这种sFlt-1抑制剂可有效用作治疗剂。
实施例4.sFlt-1在先兆子痫动物模型中的作用以上述结果为基础，我们假设加入外源性sFlt-1可在动物模型中产生高血压和蛋白尿。表达sFlt-1的腺病毒已经显示出可产生与显著的抗-肿瘤活性有关的持续全身sFlt-1水平(Kuo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，984605-4610，2001)。将该编码鼠sFlt-1的重组腺病毒注射到怀孕第8-9天的Sprague Dawley大鼠的尾部静脉中。将相等剂量的编码鼠Fc和sFlk1 Fc的腺病毒(小鼠VEGF受体1 Flkl胞外结构域和Fc蛋白的融合蛋白)用作对照。Flkl已经显示出可结合VEGF，但不结合PlGF。因此，将sFlk-l Fc选作对照以帮助区别sFlt1的抗-VEGF活性与抗-PlGF活性。
通过尾部静脉注射，给怀孕和未怀孕的Sprague-Dawley大鼠注射1×109pfu的Ad Fc、Ad sFlt-1、或Ad sFlk-1 Fc。这些腺病毒先前已经描述过(Kuo等人，supra)且在Harvard Vector Core Laboratory生产。在怀孕第8-9天，给怀孕的大鼠注射腺病毒(早期中三月)并在怀孕第16-17天测量血压(早期末三月)。在未怀孕的动物中，在注射腺病毒后第8天测量BP。用戊巴比妥钠(60mg/kg，i.p.)麻醉之后，测量大鼠的BP。分离颈动脉并用与压力传感器(MillarInstruments，Houston，TX)相连的3-Fr高保真度微尖导管插管。将Millar Mikro-Tip导管插入到动脉中记录血压。通过带状图表记录器(56-1X 40-006158型，Gould Instrument Systems，Cleveland，OH)记录血压和心率并求10分钟时间内的平均值。在安乐死之前得到血液、组织和尿液样品。正如别处(Cohen等人，Kidney Intl.，451673-1679，1994)所述，利用标准测验片测量尿白蛋白，并通过竞争性酶-联免疫测定法(ELISA)量化。尿肌酐是利用苦味酸比色方法试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)测量的。我们测量了妊娠早期末三月的动脉内血压，以模拟先兆子痫的自然病状。这些实验还在未怀孕的雌性Sprague-Dawley大鼠中进行以通过sFlt-1对胎盘的作用确定其作用是直接的还是间接的。测量血压那天sFlt-1的全身水平是通过蛋白质印迹加以证实的，测量BP那天，在各种sFlt-1处理过的动物中的水平为25-350ng/mL。不同实验组的血压和蛋白尿在表1中表示。
表1.大鼠的血压和蛋白尿
给予怀孕(P)和未怀孕(NP)的大鼠表达Fc(对照)、sFlt-1、或sFlk-1Fc蛋白的腺病毒。平均动脉血压(MAP＝舒张+1/3脉压，mmHg)±S.E.M和尿白蛋白∶Cr比例(mg白蛋白/g肌酐)±S.E.M是在8天后测量的，与怀孕大鼠的早期末三月相对应。N＝每个实验组的动物数。*代表与对照组(Fc)相比，具有p＜0.01的统计学显著性。
与Fc对照相比，用sFlt-1处理过的怀孕大鼠具有显著的高血压和肾病范围的蛋白尿。给予sFlt-1的未怀孕大鼠还可发展高血压和蛋白尿。特别是，sFlk-Fc处理过的未怀孕大鼠发展了高血压和蛋白尿，而sFlk-Fc处理过的怀孕大鼠则没有。在怀孕时，因此，单独VEGF的拮抗作用不足以产生先兆子痫，这可能是由于高水平PlGF的存在。在未怀孕的状态下，当PlGF事实上不存在时，单独VEGF的拮抗作用足以破坏促/抗-血管生成平衡且产生和与先兆子痫相关的那些相似的肾病变。各种染色技术用于检验在所有sFlt-1处理过的大鼠中观察到的肾损害(图4)。把从大鼠采集的肾脏固定在Bouin’s溶液中，切片并用H&E和PAS染料染色。就电子显微镜而言，将肾脏组织固定在戊二醛中，包埋在araldite-epon混合物中，切成超薄的肾切片(1μm)，并用甲苯蓝染色，使用Zeiss EM 10在各种放大倍数下评价。肾小球内纤维蛋白沉淀物的免疫荧光是使用多克隆抗-纤维蛋白抗体进行的(ICN，Switzerland)。球形和扩散的肾小球内皮增生是通常在sFlt-1处理过的大鼠中观察到的肾损害。我们通过内皮毛细管细胞的膨胀和肥大检测具有毛细管袢闭合的肾小球扩大。在肾小球上皮细胞中可见到若干明显的蛋白再吸收小滴。没有观察到节段性肾小球硬化症。在肾小球内见到纤维蛋白的分离“双重轮廓”和病灶沉积。在没有显著的肾小球系膜插入的条件下，纤维蛋白沉积的这种发现与典型的人类疾病产前阶段描述的相似(Kincaid-Smith，Am.J.Kidney Dis.，17144-148，1991)。纤维蛋白的免疫荧光在sFlt-1处理过的动物而不是Fc处理过的动物的肾小球内显示出纤维蛋白沉积病灶。sFlkl处理过的未怀孕大鼠发展相同的损害。事实上，在与sFlt-1相同的水平下使用sFlk1时，未怀孕大鼠的肾损害更加严重，这是因为sFlt-1拮抗的循环促-血管生成分子更少。这些结果表明sFlt-1水平的提高可导致与先兆子痫有关的肾小球内皮增生，但这种作用与胎盘无关，这是因为在未怀孕及怀孕的大鼠中均可检测到肾小球的改变。这些结果还表明VEGF和PlGF的拮抗作用在先兆子痫的病理学中较为重要，因为当PlGF水平较高时，在sFlk-1处理过的未怀孕小鼠中出现高血压和蛋白尿，而在sFlk-1处理过的怀孕小鼠中则没有。
此处建造的动物模型可用作实验模型，从而测试新的治疗化合物。有效治疗化合物的功效以及药理学和毒性均可使用该动物模型进行研究。
实施例5.sFlt-1在子痫动物模型中的作用给处于妊娠早期中三月的怀孕大鼠注射外源性sFlt-1。然后对大鼠进行监测，并在子痫发展的早期妊娠末三月进行测试。检测子痫所用的试验可包括用于水肿发展的大鼠脑MRI、用于癫痫发作的大鼠脑EEG、以及大鼠脑的组织学，从而使用特异性内皮标记测定沿着血脑屏障和脉络丛是否已经发生内皮损害。
此处建立的动物模型可用作实验模型，从而测试新的治疗化合物。有效治疗化合物的功效以及药理学和毒性均可使用该动物模型进行研究。
实施例6尿液的PlGF/肌酐比例可诊断先兆子痫获得妊娠第16周的10名妇女的尿液样品(5名正常，4名轻度先兆子痫，1名重度先兆子痫)。这些样品由Massachusetts GeneralHospital的Dr.Ravi Thadhani提供。正常孕妇的尿液平均游离PlGF/肌酐比例(pg PlGF/mg肌酐)为78+/-10.7，4名轻度先兆子痫为33+/-5.0，1名重度先兆子痫患者为17。因此，尿液中PlGF与肌酐比例的改变可用作患者先兆子痫的诊断指标。
实施例7作为妇女先兆子痫和子痫诊断指标的sFlt-1和P1GF蛋白水平就该项研究而言，我们使用Calcium for Preeclampsia Prevention试验的存档样品，分析血压正常和先兆子痫孕妇中循环sFlt-1、游离PlGF、和游离VEGF的妊娠模式。Calcium for Pre-eclampsiaPrevention、或CPEP是在1992-1995进行的随机双盲临床试验，以评价每日补充2g元素钙或安慰剂对先兆子痫发生率和严重程度的作用(Levine等人，N.Engt.J.Med.37769-76，1997；Levine等人，ControlClin.Trials 17442-469，1996)。5名健康未经产的妇女和妊娠13-21周的单身孕妇也加入美国医疗中心，直到产后24小时，其中使用通用的方案和相同的数据收集方式。登记时，所有CPEP参加者的血压都＜135/85mmHg，且没人患有肾功能异常或蛋白尿。孕龄是通过超声检查确定的。在加入到试验中前，获得参与者的血清样品(13-21周)，在第26-29周，在第36周，如果仍然怀孕，且在记录高血压或蛋白尿时。“终点样品”是在先兆子痫症状和征兆发生时或发生后，但分娩和生产前获得的样品，正如别处所述(Levine等人，1996，supra)。CPEP试验的存档血液样品是通过与NIH的Dr.Richard Levine合作得到的。
参加者我们选择具有完全输出信息的被试者，血清样品从＜22周的活产男性婴儿获得。在4,589名CPEP参加者中，我们排除了不能继续进行的253人，其中21人在20周前怀孕终止，13人遗漏了产妇或产期的输出数据，4人没有吸烟史，9人被图表评论小组证实没有高血压，32人死产，剩下4,257名妇女具有合适的信息且活产。其中有2,156名男性婴儿。排除了1名婴儿染色体异常的妇女后，381人患有妊娠高血压，43人没有基准血清样品，剩下1,731名妇女。这些之中，175人在怀孕过程中发展先兆子痫且1,556人的血压仍然保持正常。
因为钙的补充对先兆子痫的危险和严重程度没有作用，且与促-和抗-血管生成分子的浓度无关，因此在与CPEP无关的情况下选择病例和对照。相对于每个先兆子痫病例选择一个血压正常的对照，登记地点以及第一次采集血清样品(1周内)时的孕龄以及-70℃下的冷冻贮存时间(12个月内)相匹配。随机选择120个匹配对(“病例”和“对照”)，分析分娩前获得的全部657份血清样品(表2，下面)。病例和对照第一次采集血清样品时的平均孕龄分别为112.8和113.6天；冷冻贮存的平均持续时间为9.35和9.39年。
表2CPEP登记时病例和对照以及它们新生婴儿的特征
除非另有说明，否则为平均值±标准差*p＜0.05**p＜0.01进行此项研究时，高血压被定义为以4-168小时为间隔测量两次，舒张压至少为90mmHg。重度高血压被定义为以4-168小时为间隔测量两次，舒张压至少为110mmHg，如果该妇女已经接受了抗-高血压治疗，则测量一次时的舒张压至少为110mmHg。蛋白尿被定义为在24-小时尿液收集中含300mg或更多蛋白，两份间隔4-168小时的随机尿液样品通过测验片测量含至少1+蛋白，单一尿液样品具有至少0.35的蛋白/肌酐比例，或单一随机的尿液样品通过测验片测量含至少2+蛋白。重度蛋白尿被诊断为24-小时尿液收集样品含至少3.5g蛋白，或2份随机的尿液样品通过测验片测量具有至少3+蛋白。先兆子痫被定义为彼此7天内出现高血压和蛋白尿，重度先兆子痫被定义为具有重度高血压、重度蛋白尿、HELLP综合征(溶血、肝酶提高、血小板降低)、或子痫的先兆子痫。先兆子痫的发生是第一次检测到血压提高或尿液样品中蛋白尿提高的时间，从而诊断先兆子痫。
孕龄较小(SGA)被定义为根据种族、经产状况、和婴儿性别的不同，出生重量比US出生重量表低10％(Zhang和Bowes 1995，supra)。
过程测定法是在Beth Israel Deaconess Medical Center由不知道患者的诊断或其它相关信息的实验室工作人员进行的。进行分析的样品是随机安排的。按照制造商的说明，使用从R&D Systems(Minneapolis，MN)购买的试剂盒相对于人sFlt-1、游离PlGF、和游离VEGF进行酶联免疫吸附测定法(ELISA)。将在-70℃贮存的血清样品等分试样融化至室温，用BSA/Tris-缓冲生理盐水稀释，并在96-孔平板中培养2小时，该平板已经用sFlt-1、PlGF、或VEGF的捕获抗体预先涂覆。然后将上述孔洗涤3次，与含有过氧化氢和四甲基联苯胺的底物溶液培养20分钟，并用2N硫酸终止反应。测定450nm处(波长校正550nm)的光密度。所有测定都是一式两份进行的。使用标准曲线计算蛋白浓度，标准曲线是从各重组蛋白的已知浓度得到的。如果两份之间的差异超过25％，则重复测定并放弃原始结果。该测定法相对于sFlt-1、PlGF和VEGF分别具有5、7和5pg/ml的灵敏度，相对于sFlt-1具有7.6％和3.3％的测定间-和测定内-变异系数，PlGF为11.2％和5.4％，VEGF为7.3％和5.4％。
统计学分析在分析产妇或婴儿特征时使用卡方和t试验，从而分别比较绝对或连续变量。虽然在正文和附图中给出了浓度的算术平均值，但除非另有说明，统计学试验是在对数转换后进行的。校正是用对数回归，相对于对数转换浓度进行的。
结果在120个病例之中，80人发展成轻度先兆子痫，40人发展成重度先兆子痫，包括3人具有HELLP综合征，3人具有子痫。病例患者少于对照患者，具有较高的体重指数和较高的基础血压(表2)。此外，有很大比例的病例患者在怀孕时还具有足月前分娩或婴儿孕龄较小(SGA)。病例患者为研究贡献平均2.9份血清样品；对照为2.6份样品。
我们首次证实了与该CPEP研究组中妊娠匹配的对照相比，发病时，先兆子痫患者中sFlt-1、P1GF和VEGF均发生改变。与孕龄和前面公开的报告相似的对照相比，在建立临床先兆子痫时获得样品(终点样品)的sFlt-1水平显著提高，PlGF水平降低，且VEGF水平降低(在23个孕龄匹配对中，病例和对照分别为4382 vs.1643pg/ml，sFltl，p＜0.0001；137 vs.669pg/ml P1GF，p＜0.0001；6.41 vs.13.86pg/mlVEGF，p＝0.06)(Maynard等人，J.Clin.Invest.111649-658，2003)。
为了评价sFlt-1、PlGF和VEGF水平的妊娠模式，我们测量了各孕龄窗口内的病例患者和对照患者血清样品的循环sFlt-1、PlGF、和VEGF浓度。120名先兆子痫和120名对照妇女的sFlt-1蛋白的妊娠模式在图5A中表示。对照患者的sFlt-1水平保持恒定直到33-36周，它们每周升高约145pg/ml直到分娩和生产。在出现临床症状前的病例患者中，sFlt-1似乎在第21-24周时开始急剧升高，并在第29-32周时与对照组具有统计学显著性差异(图5A)。总的说来，妊娠中，在临床症状发生前测量的病例和对照患者之间的差异为17％(p＜0.05)。与发病前获得的样品相比，终点样品显著升高。为了评价临床疾病发生前sFlt-1升高的机理，我们绘制了先兆子痫发生前，以周为单位，sFlt-1浓度对所有先兆子痫的图(图5B)。在先兆子痫发生前，绘制所有周的病例患者样品中的平均sFlt-1浓度。从先兆子痫前第5周开始，sFlt-1浓度显著升高直到疾病发生前1周，当它们达到在终点样品中观察到的浓度时。在平均孕龄改变较小的情况下，先兆子痫发生前第4、3、2和1周，sFlt-1水平提高，但这不能通过随着孕龄提前后期末三月增长来解释。从先兆子痫前8-6至5周，sFlt-1升高了962pg/ml，而平均孕龄提前了31天。sFlt-1这种升高的约1/3不能归因于妊娠提前。在除去先兆子痫发生前≤5周获得的样品后，根据对照组和病例组孕龄和sFlt-1绘制的曲线图中，没有观察到较大的差异(图5C)。这些数据表明先兆子痫发生前，病例患者中sFlt-1浓度较高是由于在临床疾病发生前的5周内sFlt-1急剧升高。
然后我们按照图6A所示，绘制同一患者组中PlGF蛋白的妊娠模式。在前六个月内对照PlGF蛋白浓度升高，在第29-32周达到峰值，并在后期妊娠过程中下降。在先兆子痫发生前的病例患者中，PlGF蛋白浓度遵循相似的妊娠模式，但明显低于1316周的对照组。总的说来，在妊娠中，临床症状发生前测量的病例患者与对照之间的PlGF差异为35％(p＜0.0001)。先兆子痫发生前病例的P1GF水平是在先兆子痫发生前以周为单位描述的(图6B)，而在除去先兆子痫发生前＜5周的样品后，是以孕龄为单位描述的(图6C)。先兆子痫发生前1周，浓度达到了先兆子痫发生后观察到的那些浓度(图6B)。与对照组相比，病例患者的PlGF水平适当降低，与分娩时的水平相距较远，在分娩前第5和3周大大降低。对照患者的浓度从分娩前17-15到3周保持较高，然后迅速下降。排除了先兆子痫前≤5周获得的样品后，表示PlGF水平的曲线图表明在妊娠第29-32周，相对于对照，病例组稍稍降低，且在第33-36周，从病例患者获得的样品中则完全没有了(图6C)。这表明发病前几周内PlGF浓度的下降是导致疾病发生时PlGF水平明显较低的原因(或图6A所示的终点样品)。
怀孕过程中的VEGF浓度非常低，且与先兆子痫发生前对照和病例的相似，只是在第37-41周，病例患者中的VEGF浓度明显降低。排除了先兆子痫前5周获得的样品的病例中，第23-32周时的平均VEGF浓度与对照组没有明显不同(11.6 vs.12.8pg/ml)，而包括分娩前≤5周样品的病例组浓度则有明显不同(5.1 vs.12.8pg/ml，p＜0.01)。在第33-41周，先兆子痫发生前＞5或≤5周的病例VEGF浓度分别高于和低于对照组(11.2pg/ml和8.3 vs.9.7pg/ml)，虽然这些差异并不显著。
图7描述根据先兆子痫状态和严重状态，第23-32周(图7A)和第33-41周(图7B)的sFlt-1和PlGF。该曲线图表明先兆子痫发生前的sFlt-1提高和PlGF降低与疾病严重程度、发生时间、以及SGA婴儿是否存在有关。在第23-32周，先兆子痫发生前，具有SGA婴儿的病例患者的sFlt-1和P1GF分别明显高于或低于具有SGA婴儿的对照患者的相应浓度。此外，与足月前分娩的对照患者相比，足月前分娩的病例患者具有更高的sFlt-1和明显更低的PlGF。
然后我们测定我们是否可使用首三月的PlGF和/或sFlt-1循环浓度来鉴定妇女是否有发展先兆子痫的危险。在第8-20周，校正孕龄、体重指数和sFlt-1后，与在三个更高四分点中具有PlGF的病例相比，在对照值分布的最低四分点中具有PlGF的病例患者的在＜34周时，患先兆子痫的危险几乎增加了12-倍(Odds Ratio[OR]11.7，p＜0.05)(表3)。与最高的四分点相比，在最低四分点中，＜34周时患先兆子痫的危险几乎增加了16倍(OR 15.8，p＜0.01)。
表3利用第8-20周时对照PlGF分布的四分点得到的早期发生先兆子痫的优势比(OR)
*针对孕龄、体重指数、log sFlt-1校正的优势比(OR)**p＜0.01***p＜0.001 95％CI＝95％置信限这些结果证实sFlt-1水平在先兆子痫症状发生前约5周迅速提高。与sFlt-1提高相比，游离PlGF和游离VEGF水平降低，表明PlGF及VEGF降低可能至少部分是由于sFlt-1的拮抗作用，而不是由于PlGF和VEGF胎盘产生的降低。与对照或患有轻度先兆子痫的妇女相比，在第23-32周和第33-41周，3个先兆子痫小组-严重的先兆子痫、疾病早期发生、以及SGA婴儿-具有较高的sFlt-1和较低的PlGF浓度。我们还证实了在可能发展先兆子痫的妇女中，中三月开始较早的游离PlGF稍稍降低，但不显著。这些结果证实PlGF水平的降低可以成为早期发生的先兆子痫的有效预测值。
在这里我们首次描述了sFlt-1在正常孕妇中的妊娠模式，在妊娠过程中观察到相对稳定的水平，接着在第33-36周开始观察到稳定的升高。这种升高与其他人(Torry等人，J.Soc.Gyfaecol.Invest.10178-188，1998；Taylor等人，Am.J.Obstet.Gynecol.188177-182，2003)在正常孕妇中观察到晚期妊娠PlGF降低相对应，结果在此处描述。临时联合，连同sFlt-1干扰PlGF ELISA测量的知识(Maynard等人，supra)表明后期妊娠过程中游离PlGF水平的降低可能是由于sFlt-1水平提高。在首三月及中三月，当胎盘生长需要跟上胎儿要求的增加时，PlGF浓度较高而sFlt-1浓度较低，产生相对促-血管生成的状态。妊娠后期，当需要调节并停止胎盘血管生长时，抗-血管生成的sFlt-1升高且PlGF降低。在先兆子痫妇女中，sFlt-1在妊娠早期开始升高，症状发生前约5周，平均约在妊娠第29-32周。因此，在先兆子痫中，抗-血管生成“闸”可很快且很有效地使用，导致正常生理过程夸大，其阻止胎盘生长。似乎很清楚的是，表征先兆子痫的病理性胎盘改变在妊娠早期(10-14周)，以及sFlt-1迅速提高前出现。所致胎盘局部缺血本身可提高sFlt-1产生，最终引发sFlt-1爆发。
除了在临床症状发展前5周内见到的较大差异外，可能发展先兆子痫的妇女人数较少，但统计学显著，在早至妊娠13-16周的游离PlGF降低。PlGF的这种降低通常并不伴有sFlt-1水平的相等增加。然而，虽然不是统计学显著的，但在首三月过程中，病例的sFlt-1水平具有稍稍提高的倾向(例如，在第17-20周窗口，病例的平均sFlt-1水平为865.77pg/ml，对照组为795.25)。妊娠早期PlGF水平的这种降低可反映出在伴有疾病，如先兆子痫或SGA的孕妇中PlGF的少量胎盘产生。重要的是，在伴有SGA的先兆子痫患者中，我们发现疾病出现前，sFlt-1提高和PlGF降低的统计学显著性增加。还有可能的是，先兆子痫中PlGF的胎盘产生没有改变，且胎盘中局部sFlt-1水平的提高可导致循环游离PlGF降低。这可由下列发现支持，即通过免疫组织化学测量的胎盘PlGF在先兆子痫中没有改变(Zhou等人，Am.J.Ptathol.1601405-1423，2002)。
总之，我们已经说明在临床疾病发生前至少5周，先兆子痫中的sFlt-1开始升高，其伴有循环游离PlGF和游离VEGF的降低。首三月PlGF的降低可预测先兆子痫且sFlt-1升高可预测接近临床疾病。该数据结合上述证实了单独sFlt-1在啮齿动物中诱导先兆子痫样症状的动物试验表明了sFlt-1在先兆子痫发病中的可能病原作用。作为与病例患者的对照，我们有关对照组中SGA婴儿和足月前分娩的有限数据表明在具有SGA婴儿的先兆子痫孕妇中观察到的蛋白水平比差异提高很多，只是由于子宫内生长的限制或没有先兆子痫情况下的足月前分娩。
诊断学本发明涉及用于检测先兆子痫、子痫、或发展这种病的倾向的诊断测定法。测量被试者样品中的游离或总的VEGF、P1GF、或sFlt-1水平并用作先兆子痫、子痫、或发展这种病的倾向的指标。
在其中一个实施方案中，度量用于确定至少两种蛋白水平之间的关系是否可指示先兆子痫或子痫。标准方法可用于测量任何体液，包括但不限于，尿液、血清、血浆、唾液、羊水、或脑脊液中VEGF、PlGF、或sFlt-1多肽的水平。这类方法包括免疫测定法、ELISA、使用VEGF、PlGF或sFlt-1抗体的蛋白质印迹、以及定量酶免疫测定技术，如Ong等人(Obstet.Gynecol.98608-611，2001)和Su等人(Obstet.Gynecol.，97898-904，2001)描述的那些。ELISA测定法是测量VEGF、PlGF、或sFlt-1水平的优选方法。大于2ng/ml的sFlt-1血清水平被认为是先兆子痫的阳性指标。此外，sFlt-1、VEGF、或PlGF水平相对于正常水平的任何可检测改变是子痫、先兆子痫、或发展这种病倾向的指标。优选，测量sFlt-1，更优选将VEGF和PlGF的测量与这种测量结合，且最优选测量全部三种蛋白(或指示蛋白水平的mRNA水平)。
在另一实施方案中，将PAAI(sFlt-1/VEGF+P1GF)用作抗-血管生成指数，诊断先兆子痫、子痫、或发展这类病的倾向。如果PAAI大于20，那么被试者被认为患有先兆子痫或有即将发展这类病的危险。PAAI(sFlt-l/VEGF+PlGF)比例仅仅是可用作诊断指标的有效度量的其中一个例子。它不用来限制本发明。事实上，可检测患有子痫的被试者中抗-血管生成指数相对于正常对照的改变的任何度量都可用作诊断指标。
特定核酸或多肽的表达水平可能与特定的疾病状况(例如，先兆子痫或子痫)相关联，且因此用于诊断。来源于sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或较长片段可用作探针，不仅可监测表达，而且可鉴定sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子具有基因变异、突变、或多态性的被试者，而这些是先兆子痫发展成疾病的指标。这种多态性是本领域技术人员已知的且由Parry等人(Eur.J.Immunogenet.26321-3，1999)描述。这种基因改变可存在于sFlt-1基因的启动子序列、可读框、内含序列、或未翻译的3’区中。有关基因改变的信息可用于诊断患有先兆子痫、子痫、或发展这类病倾向的被试者。正如全文所述，sFlt-1、VEGF、和/或PlGF生物学活性水平的特定改变可能与先兆子痫或子痫或发展这类病的可能性有关。结果，本领域技术人员在检测了已知的突变后，可测定蛋白生物活性的一个或多个度量，从而确定突变是否可引起或增加先兆子痫或子痫的可能性。
在其中一个实施方案中，患有先兆子痫、子痫、或具有发展这类病倾向的被试者将表现出编码sFlt-1核酸的表达水平的提高或PlGF或VEGF水平的改变。用于检测这种改变的方法是本领域的标准方法且由Ausubel等人，supra描述。在其中一个实施例中，RNA印迹或实时PCR用于检测sFlt-1、PlGF或VEGF mRNA水平。
在另一实施方案中，与能够检测sFlt-1核酸分子，包括基因组序列或紧密相关分子的PCR探针杂交可用于和来源于患有先兆子痫或子痫或具有发展这类病危险的被试者的核酸序列杂交。探针的特异性，不论是从高度特异性区，例如5’调节区，还是从特异性较低的区，例如，保守基序制造的，以及杂交或扩增的严格程度(最高、高、中等、或低)，都可确定探针是否与天然存在的序列、等位基因变体、或其它相关序列杂交。杂交技术可用于鉴定表示先兆子痫或子痫的sFlt-1核酸分子的突变，或可用于监测编码sFlt-1多肽的基因表达水平(例如，通过RNA印迹，Ausubel等人，supra)。
在另一实施方案中，通过直接分析sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的序列可诊断人类是否具有发展先兆子痫或子痫的倾向。
患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者将表现出sFlt-1多肽表达水平的提高。特异性结合sFlt-1多肽的抗体可用于诊断先兆子痫或子痫或用于鉴定被试者是否有发展这类病的危险。用于测量这类多肽表达水平改变的各种方案是已知的，包括免疫学方法(如ELISA和RIA)，并提供诊断先兆子痫或子痫或是否具有发展这类病危险的基础。又，该多肽水平的提高可诊断患有先兆子痫、子痫、或具有发展这类病倾向的被试者。
在其中一个实施方案中，sFlt-l、VEGF或P1GF多肽或核酸，或其任意组合的水平至少测量两次，且与正常参考水平相比，其水平随时间的改变可用作先兆子痫、子痫、或发展这类病倾向的指标。
患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者体液中的sFlt-1、VEGF或PlGF水平相对于正常对照组的sFlt-1、VEGF、或PlGF水平可改变少至10％、20％、30％或40％，或多至50％、60％、70％、80％或90％。存在于患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者体液中的sFlt-1水平相对于正常对照被试者的水平可提高1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍，甚或多至10倍或更多。
在其中一个实施方案中，在先兆子痫症状发生前的怀孕早期，收集被试者的体液样品(例如，尿液、血浆、血清、羊水)。在另一实施例中，样品可以是先兆子痫症状发生前，在怀孕早期收集的组织或细胞。非限制性例子包括胎盘组织、胎盘细胞、内皮细胞和白细胞如单核细胞。在人类中，例如，在妊娠的首三月、中三月或后三月中，收集孕妇肘前静脉的产妇血清样品。优选，测定是在首三月，例如第4、6、8、10或12周进行的，或在中三月，例如第14、16、18、20、22或24周进行的。这种测定还可在中三月结束时或末三月开始时(约28周)进行。优选，在该时间周期内，将sFlt-1、VEGF或PlGF水平测量两次。就产后先兆子痫或子痫的诊断而言，sFlt-1、VEGF或P1GF的测定可在产后进行。
在其中一个特定实施例中，可在怀孕过程中收集连续的血液样品并通过ELISA测定可溶性sFlt-1水平。在使用该技术的其中一项研究中，编码sFlt-1的可选择性剪接mRNA由滋养层细胞表达，且在孕妇血浆中很容易检测到该蛋白。在20-36周妊娠期间，观察到sFlt-1水平提高了大约3倍。在随后继续发展先兆子痫的高危妇女中，观察到该水平明显更高(Charnock-Jones等人，J.Soc.GyiiecoL Investig.10(2)230，2003)。
在兽医实践中，可在怀孕过程中的任何时间进行测定，但优选在怀孕早期，先兆子痫症状发生前进行。已知怀孕时间随着物种不同而广泛变化，测定时间由兽医决定，但通常与人类怀孕过程的测定时间相对应。
此处所述的诊断方法可单独使用或与此处所述的任何其它诊断方法结合使用，以更准确地诊断先兆子痫或子痫是否存在、严重程度或可能的发生时间。此外，此处所述的诊断方法可与用于准确诊断先兆子痫或子痫是否存在、严重程度、或可能的发生时间的任何其它诊断方法结合使用。
此处所述诊断方法还可用于监测并处理被试者的先兆子痫或子痫。在其中一个实施例中，如果被试者被测定具有10ng/mL的血清sFlt-1蛋白水平和100pg/mL的游离PlGF血清水平，那么可给予VEGF直到血清PlGF水平升高到约400pg/mL。在该实施方案中，反复测量sFlt-1、P1GF和VEGF，或这些的任一或全部水平，该方法不仅能诊断疾病而且可监测先兆子痫和子痫的治疗和处理。
诊断试剂盒本发明还提供一种诊断试验试剂盒。例如，诊断试验试剂盒可包括sFlt-1、VEGF或P1GF抗体，用于检测，且更优选用于评价抗体与sFlt-1、VEGF或P1GF多肽之间结合的工具。进行检测时，标记抗体或sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽，且抗体或sFlt-1、VEGF或P1GF多肽是底物-结合的，这样sFlt-1、VEGF或P1GF多肽-抗体的相互作用可通过在抗体与sFlt-1、VEGF或PlGF多肽结合后，测定与底物结合的标记量而建立。常规的ELISA是本领域已知的通用方法，用于检测抗体-底物的相互作用并与本发明试剂盒一起提供。sFlt-1、VEGF或P1GF多肽可在任何体液，包括但不限于尿液、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液中实际检测。测定sFlt-1、VEGF或PlGF多肽水平相对于对照，如正常对照水平的改变的试剂盒可用作本发明方法中的诊断试剂盒。
筛选测定法正如上面所讨论的，sFlt-1核酸或多肽的表达水平在患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者中提高。基于这些发现，本发明的组合物可用于候选化合物的高通量底成本筛选，从而鉴定可调节sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸分子表达的那些，其中它们的表达在患有先兆子痫或子痫的被试者中被改变。
许多方法都可进行筛选测定从而鉴定改变sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子表达的新的候选化合物。在其中一个可实行的实施例中，将各种浓度的候选化合物加入到表达sFlt-1、VEGF或PlGF核酸序列的培养细胞的培养基中。然后测量基因表达，例如，通过微排列分析、RNA印迹分析(Ausubel等人supra)或RT-PCR，其中使用从核酸制备的任何适宜片段作为杂交探针。将有候选化合物存在条件下的基因表达水平与在缺少候选化合物的对照培养基中测量的水平进行比较。促进改变，如VEGF或PlGF基因、核酸分子或多肽表达水平提高，或sFlt-1基因、核酸分子或多肽或其功能等价物表达水平降低的化合物被认为可用于本发明中；可使用这类分子作为治疗被试者先兆子痫或子痫的疗法。
在另一可实行的实施例中，候选化合物的作用可使用相同的一般方法和标准免疫学技术，以多肽产生水平测量，如使用sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的特异性抗体进行的蛋白质印迹或免疫沉淀。例如，免疫测定法可用于检测或监测本发明至少一种多肽在生物中的表达。能够结合这种多肽的多克隆或单克隆抗体(如上所述产生的)可用于任何标准免疫测定形式(例如，ELISA、蛋白质印迹或RIA测定)中，以测量所述多肽的水平。在某些实施方案中，促进改变，如VEGF或PlGF多肽的表达或生物活性提高或sFlt-1多肽的表达或生物活性降低的化合物被认为特别有效。又，可使用这类分子，例如，作为延迟、缓和、或治疗被试者先兆子痫或子痫，或先兆子痫或子痫症状的疗法。
在另一可实行的实施例中，可筛选候选化合物中特异性结合sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的那些。这种候选化合物的功效取决于它与这类多肽或其功能性等价物相互作用的能力。这种相互作用可很容易地使用许多标准结合技术和功能测定法(例如，Ausubel等人，supra描述的那些)测定。在其中一个实施方案中，可体外测试候选化合物特异性结合本发明多肽的能力。在另一实施方案中，可通过降低sFlt-1多肽与生长因子，如VEGF或PlGF的结合而测试候选化合物降低sFlt-1多肽生物学活性的能力。
在另一可实行实施例中，sFlt-1、VEGF或PlGF核酸表达为与可检测报道基因的转录或翻译融合体，并在异源启动子，如诱导型启动子的控制下在分离的细胞(例如，哺乳动物或昆虫细胞)中表达。然后使表达融合蛋白的细胞与候选化合物接触，将可检测报道基因在该细胞中的表达与可检测报道基因在未处理过的对照细胞中的表达进行比较。降低sFlt-1可检测报道基因表达、或提高VEGF或PlGF可检测报道基因表达的候选化合物是用于治疗先兆子痫或子痫的化合物。在优选实施方案中，所述候选化合物改变与核酸融合的报道基因或核酸的表达。
在其中一个特定的可实行实施例中，结合sFlt-1多肽的候选化合物可使用色谱技术鉴定。例如，本发明的重组多肽可通过标准技术从被改造表达所述多肽的细胞纯化(例如，上述那些)且可固定在柱上。然后使候选化合物的溶液通过柱子，以其结合多肽并固定在柱上的能力为基础鉴定对sFlt-1多肽特异的化合物。为了分离该化合物，洗涤柱子以除去非-特异性结合的分子，使目标化合物从柱上释放出来并收集。类似的方法可用于分离与多肽微排列结合的化合物。通过该方法(或任何其它适宜方法)分离的化合物可，如果需要，被进一步纯化(例如，通过高效液相色谱)。此外，还可测试这些候选化合物降低sFlt-1多肽活性或提高VEGF信号途径的能力(如此处所述)。可使用通过该方法分离的化合物，例如，作为治疗人类被试者先兆子痫或子痫的疗法。具有小于或等于10mM亲和常数的、被鉴定结合本发明多肽的化合物被认为可特别用于本发明中。可选择性地，任何体内蛋白相互作用检测系统，例如，任何二-杂种测定均可用于鉴定结合本发明多肽的化合物或蛋白。
有效的拮抗剂包括结合sFlt-1核酸序列或sFlt-1多肽的有机分子、肽、肽类似物、多肽、核酸、以及抗体。
sFlt-1 DNA序列还可用于治疗先兆子痫或子痫的治疗化合物的发现和研究。编码蛋白，在表达后，可用作药物筛选的目标。此外，编码所编码蛋白氨基末端区的DNA序列或Shine-Delgarno序列或促进各mRNA翻译的其它序列可用于构建降低sFlt-1编码序列表达的序列。这类序列可通过标准技术分离(Ausubel等人，supra)。
任选地，在上述任何测定法中鉴定的化合物被证实在降低sFlt-1生物学活性或提高VEGF信号途径活性的化合物测定法中有效。
本发明的小分子优选具有低于2,000道尔顿，更优选300-1,000道尔顿、最优选400-700道尔顿的分子量。优选这些小分子是有机分子。
针对VEGF信号途径的治疗VEGF是有效的内皮细胞-特异性促分裂原，可刺激血管生成、血管渗透性过高以及血管舒张。已经鉴定了VEGF的三种酪氨酸-激酶信号受体。VEGF-受体的结合可引发信号级联，使得磷脂酶Cγ1发生酪氨酸磷酸化，导致肌醇1，4，5-三磷酸的胞内水平提高和胞内钙提高，从而激活一氧化氮合酶产生一氧化氮(NO)。NO的形成可激活血管平滑肌细胞和内皮细胞内的鸟苷酸环化酶，引起cGMP产生。这种NO/cGMP级联被认为可介导VEGF的血管作用。似乎涉及介导VEGF血管作用的其它途径是前列腺环素释放途径。VEGF经由磷脂酶A2的活化而诱导PGI2产生，这是由于MAPK级联的开始。
VEGF水平的提高可用于治疗先兆子痫或子痫。针对VEGF信号途径或VEGF信号途径组分，且提高VEGF信号途径活性的治疗化合物也可用于治疗先兆子痫和子痫。这类化合物包括西地那非、前列腺环素类似物，如依前列醇钠、Remodulin、和Tracleer。
试验化合物和提取物通常，能够降低sFlt-1多肽活性或提高VEGF或PlGF活性的化合物是根据本领域已知的方法，从天然产物或合成(半-合成)提取物的大型库或化学库或多肽或核酸库中鉴定的。药物研发领域的技术人员应当了解试验提取物或化合物的准确来源对于本发明的筛选过程并不特别重要。用于筛选的化合物可包括已知化合物(例如，用于其它疾病或病症的已知治疗)。可选择性地，事实上使用此处所述方法可筛选许多未知的化学提取物或化合物。这种提取物或化合物的例子包括但不限于，植物-、真菌-、原核生物-或动物提取物、发酵肉汤、及合成化合物，以及现有化合物的改变。还有很多方法也可用于产生许多化学化合物，包括但不限于糖-、脂类-、肽-、及核酸化合物的随机或定向合成(例如，半-合成或总合成)。合成化合物库可从BrandonAssociates(Merrimack，NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)商业得到。可选择性地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库可从很多来源商业得到，包括Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，FL)和PhannaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，按照本领域已知的方法，例如，通过标准提取和分离方法产生天然及合成产生的库。此外，如果需要，可使用标准的化学、物理、或生物化学方法很容易地改变任何库或化合物。
此外，药物研发领域的技术人员可很容易地理解不论何时，都可应用脱复制(例如，分类脱复制、生物学脱复制、以及化学脱复制、或其任意组合)或除去脱-破裂活性已知的物质的复制或重复的方法。
当发现粗提物可降低sFlt-1多肽活性，或结合sFlt-1多肽时，确实很重要的提取物的进一步分级分离是分离导致所观察作用的化学组分所必需的。因此，提取、分级分离、和纯化的目的是认真描述和鉴定可降低sFlt-1多肽活性的粗提物内的化学实体。这种异源提取物的分级分离和纯化方法是本领域已知的。如需要，根据本领域已知方法，对可有效治疗人先兆子痫或子痫的化合物进行化学改变。
治疗本发明提供用于治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法。优选在怀孕过程中给予治疗，用于治疗或预防先兆子痫或子痫，或在怀孕后给予以治疗产后先兆子痫或子痫。用于给药的技术和剂量根据化合物(抗体、反义、核酸载体等)的类型而变化，且是本领域技术人员熟知的或很容易确定的。
本发明的治疗化合物可在单位剂量形式中，与药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起给予。给药可以是肠胃外、静脉内、皮下、口服或局部直接注射到羊水中。通过连续输注而静脉内送递是给予本发明治疗化合物的优选方法。
所述组合物可以是口服给药的丸剂、片剂、胶囊剂、液体或持续释放的片剂；或用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体；或用于局部给药的聚合物或其它持续释放的赋形剂。
用于制备制剂的本领域熟知的方法见，例如，“RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.Gennaro AR.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。用于肠胃外给药的制剂可，例如，包含赋形剂、无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、或氢化萘。生物相容的、可生物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。毫微颗粒制剂(例如，可生物降解的毫微颗粒、固体脂类毫微颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它可能有效的肠胃外送递系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的融合系统及脂质体。制剂中化合物的浓度取决于多种因素，包括所给予药物的剂量以及给药途径。
所述化合物可任选以药学可接受的盐，如制药工业通常使用的无毒酸加成盐或金属络合物的形式给药。酸加成盐的例子包括有机酸如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟醋酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。
用于口服使用的制剂包括混合物中含有活性成分和无毒的药学可接受赋形剂的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、glidants、和抗-粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油、或滑石粉)。
口服使用的制剂还可以咀嚼片的形式给药，或以硬明胶胶囊的形式给药，其中将活性成分与惰性固体稀释剂混合，或以软明胶胶囊的形式给药，其中将或形成与水或油性介质混合。
给予化合物的剂量和时间取决于多种临床因素，包括被试者的整体健康状况和先兆子痫症状的严重程度。一般而言，一旦检测出先兆子痫或具有发展先兆子痫的倾向，则纯化蛋白的连续输注用于治疗或预防所述疾病的进一步发展。治疗可持续1-100天，更优选1-60天，且最优选1-20天，或直到怀孕结束。剂量可根据每种化合物以及疾病的严重程度不同而变化，且被滴定获得稳态的血清浓度，即1-500ng/mLVEGF或P1GF，或两者、优选1-100ng/mL、更优选5-50ng/mL且最优选5-10ng/mL VEGF或P1GF，或两者。
提高VEGF或PlGF蛋白表达的方法本发明提供用于提高被诊断患有先兆子痫或子痫的被试者中VEGF和PlGF水平的方法。VEGF或PlGF水平的提高可使用下面所述的若干不同方法获得。
纯化蛋白在本发明的优选实施方案中，将纯化形式的VEGF或PlGF或两者给予被试者，从而治疗或预防先兆子痫或子痫。
纯化的VEGF或VEGF-样蛋白包括所具有的氨基酸序列与VEGF或任何VEGF家族成员的氨基酸序列同源，更优选基本相同的蛋白，其可诱导血管生成或能够促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长。纯化VEGF化合物的例子是来源于Genentech，Inc.(SanFrancisco，CA)的人重组VEGF。
纯化的P1GF或PlGF-样蛋白包括所具有的氨基酸序列与PlGF或任何PlGF家族成员的氨基酸序列同源，更优选基本相同的蛋白，其可诱导血管生成或能够促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长。可商业得到的纯化PlGF的例子是来源于R&D Systems(目录号264-PG，R&D Systems，Minneapolis，MN)的人重组PlGF形式。ThromboGenics Ltd也正在研制一种纯化形式的PlGF，用于治疗局部缺血性中风；推测这种形式的PlGF可有效用于本发明描述的应用中。
提高VEGF或PlGF活性的治疗化合物本发明提供已知刺激或提高VEGF或PlGF血清水平，或这些多肽的生物活性的任何化合物用于治疗或预防被试者先兆子痫的用途。这些化合物可单独使用或与上述纯化蛋白或此处所述用于提高VEGF或PlGF蛋白水平的任何其它方法联合使用。
可刺激VEGF产生的化合物的其中一个例子是烟碱。虽然吸烟可危害孕妇以及她正在发育中的胎儿的整体健康，但据信烟碱本身比烟草要安全且可用于高危被试者的短期治疗。例子包括Nicorette(烟碱polacrilex)，其是由Smith Kline Beecham和NicoDerm CQ制造的买卖双方直接交易的烟碱树胶产品，由Hoechst Marion RousselInc.(formerly Marion Merrell Dow)制造的买卖双方直接交易的烟碱膏。经由烟草送递的烟碱被特别排除在本发明的方法之外，其中还没有使用本发明方法诊断所述患者。
烟碱是在先兆子痫或子痫诊断之后，使用膏或树胶给予的。剂量取决于疾病的严重程度以及被试者的整体健康状况。通常，按照制造商的说明获得5-500ng/mL、更优选5-100ng/mL、且最优选50-100ng/mL的烟碱血清水平。
茶碱是可用于治疗或预防先兆子痫或子痫的其它化合物的又一例子。茶碱是支气管扩张药，常常用于治疗哮喘，且有很多商标名(例如，Aerolate Sr、Asmalix、Elxophyllin等)以及总名称。给药方法和剂量取决于每位制造商，且根据被试者的整体健康状况和疾病的严重程度来选择。通常，每日剂量为1-500mg、更优选100-400mg、且最优选250-350mg，每天给药两次，以达到5-50μg/mL的茶碱血清水平。
腺苷是可用于治疗或预防先兆子痫或子痫的其它化合物的又一例子。腺苷(Fujisawa Pharmaceutical Co.)通常被用作抗-高血压药物。给药方法和剂量取决于每位制造商且根据被试者的整体健康状况和疾病的严重程度来选择。通常，腺苷的每日剂量为50mg/kg，每天给药两次。
硝苯地平是可用于治疗或预防先兆子痫或子痫的其它化合物的又一例子。硝苯地平(Bayer Pharmaceuticals)通常被用作抗-高血压药物。给药方法和剂量取决于每位制造商且根据被试者的整体健康状况和疾病的严重程度来选择。通常，硝苯地平的每日剂量为1-2mg/kg，每天口服或皮下给药两次。
米诺地尔是可用于治疗或预防先兆子痫或子痫的其它化合物的又一例子。米诺地尔(Pfizer，Inc.)通常被用作抗-高血压药物。给药方法和剂量取决于每位制造商且根据被试者的整体健康状况和疾病的严重程度来选择。通常，米诺地尔的每日剂量为0.25-1.0mg/kg，每天口服或皮下给药两次。
硫酸镁是可用于治疗或预防先兆子痫或子痫的其它化合物的又一例子。硫酸镁是普通药物，通常被用作抗-高血压的药物。给药方法和剂量取决于每位制造商且根据被试者的整体健康状况和疾病的严重程度来选择。通常，硫酸镁的每日剂量为1-2gm，每四小时静脉内给药一次。
除了使用可提高VEGF或PlGF血清水平的化合物之外，本发明提供与任何一种针对VEGF或PlGF的化合物结合使用的任何慢性高血压药物治疗的用途。用于治疗怀孕过程中高血压的药物包括甲基多巴、盐酸肼苯哒嗪、或拉贝洛尔。对于这些药物治疗中的每一种而言，给药方式和剂量可由医师或按照制造商的说明确定。
治疗性核酸近来的研究表明，将能够表达内皮细胞促分裂原，如VEGF的核酸(DNA或RNA)送递到血管损伤部位可诱导受损血管的增殖和再次内皮化。虽然本发明不涉及血管损伤，但是这些研究中使用的、用于送递编码内皮细胞促分裂原如VEGF和PlGF的核酸的技术也可用于本发明中。这些技术在美国专利号Nos.5,830,879和6,258,787中描述，它们引入此处作为参考。
在本发明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包括编码VEGF或P1GF或任何VEGF或P1GF家族成员的基因组DNA、cDNA、和mRNA。所述核酸还可包括编码结合sFlt-1受体的蛋白的任何核酸。编码所需蛋白的核酸可使用本领域的常规过程，例如，重组DNA、PCR扩增获得。
抑制sFlt-1表达的治疗性核酸本发明还提供反义核酸碱基寡聚物直接负调节sFlt-1 mRNA表达的用途。通过结合互补核酸序列(正义或编码链)，反义核酸碱基寡聚物能够抑制蛋白表达，这大概是通过RNA酶H对RNA链的酶裂解。优选反义核酸碱基寡聚物能够降低sFlt-1蛋白在表达过量水平sFlt-1的细胞中的表达。优选，相对于用对照寡核苷酸处理的细胞，sFlt-1蛋白的表达降低至少10％、更优选25％、且最优选50％或更高。选择和制备反义核酸碱基寡聚物的方法是本领域熟知的。使用反义核酸碱基寡聚物负调节VEGF表达的例子见美国专利号No.6,410,322，其引入此处作为参考。测定蛋白表达水平的方法是本领域熟知的且包括蛋白质印迹、免疫沉淀、和ELISA。
本发明还提供RNA干扰(RNAi)抑制sFlt-1表达的用途。RNA干扰(RNAi)是近来发现的翻译后基因沉默(PTGS)的机理，其中与目标基因或mRNA相对应的双链RNA(dsRNA)被引入到生物中，导致相应的mRNA降解。在RNAi反应中，dsRNA分子的正义和反义链被加工成21-23个核苷酸长且具有2-核苷酸3’尾部的小分子RNA片段或节段。可选择性地，合成dsRNA，它们长21-23nt，且具有2-核苷酸3’尾部，可被合成，纯化并用于反应中。这些21-23 nt dsRNA被称作“导向RNA”或“短的干扰RNA”(siRNA)。
然后siRNA双螺旋与核酸酶复合物结合，该核酸酶复合物由针对和破坏内源性mRNA的蛋白构成，所述内源性mRNA与复合物内的siRNA具有同源性。虽然复合物内的蛋白同一性仍然不清楚，但复合物的功能是通过其中一个siRNA链和内源性mRNA之间的碱基对相互作用而针对同源性mRNA分子的。然后从siRNA的3’末端裂解下一个大约12nt的mRNA并降解。以这种方式，可针对特异性基因并降解，由此导致蛋白自靶基因的表达水平损失。
dsRNA的特殊要求和修饰在PCT公开号No.WO01/75164(引入此处作为参考)中描述。因为dsRNA分子的长度可发生变化，因此最优选使用siRNA分子，其是21-23核苷酸dsRNA，具有特殊的2-3-核苷酸3’突出末端，通常为(2’脱氧)胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3’羟基。还可使用单链的siRNA以及钝头形式的dsRNA。为了进一步提高RNA的稳定性，可使3’突出端稳定以防止降解。在其中一个这类实施方案中，RNA是通过包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟苷稳定的。可选择性地，用修饰类似物置换嘧啶核苷酸，例如，用(2’-脱氧)胸苷置换尿苷2-核苷酸突出端是可耐受的，不会影响RNAi的效能。没有2’羟基可显著提高组织培养基中突出端的核酸酶抗性。
可选择性地，siRNA可使用PCT公开号No.WO01/75164(引入此处作为参考)中提出的方法或使用RNA体外转录的标准过程和Elbashir等人(Genes & Dev.，15188-200，2001)描述的dsRNA退火过程的任何一种制备。siRNA还可按照Elbashir等人所述获得，即在加工dsRNA产生约21-约23个核苷酸的siRNA的条件下，培养与合胞体胚盘果蝇胚胎的没有细胞的果蝇溶解产物中的靶基因序列相对应的dsRNA，然后使用本领域技术人员已知的技术分离。例如，凝胶电泳可用于分离21-23nt RNA，并从凝胶切片上将RNA洗脱下来。此外，色谱(例如，大小排阻色谱)、甘油梯度离心、及用抗体进行亲和纯化都可用于分离21-23nt RNA。
在本发明中，dsRNA或siRNA与sFlt-1 mRNA的mRNA序列互补，可降低或抑制sFlt-1的表达。优选，相对于用对照dsRNA或siRNA处理过的细胞，sFlt-1蛋白的表达降低了至少10％、更优选至少25％、且最优选至少50％。测定蛋白表达水平的方法也是本领域熟知的且包括蛋白质印迹、免疫沉淀和ELISA。
在本发明中，所用核酸包括以任何方式提高核酸稳定性或功能的任何修饰。例子包括对磷酸主链、核苷酸之间的键或糖部分的修饰。
为了简化编码sFlt-1结合蛋白的核酸的操纵和处理，优选将该核酸插入到与启动子可操纵连接的基因盒中。启动子必须能够驱动sFlt-1结合蛋白在所需靶宿主细胞中的表达。适宜启动子的选择可很容易实现。优选，可使用高水平表达的启动子。适宜启动子的例子是763-碱基-对巨细胞病毒(CMV)启动子。还可使用鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等人，Hum.Gene Ther.4151-159，1993)和小鼠乳癌病毒(MMTV)启动子。某些蛋白可使用它们的天然启动子表达。还可包括可提高表达的其它元件(例如，产生高水平表达的增强子或系统，如tat基因和tar元件)。重组载体可以是质粒载体如pUC118、pBR322、或其它已知的质粒载体，包括，例如大肠杆菌复制源(见，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory press，1989)。质粒载体还可包括可选择标记，如氨苄西林抗性β内酰胺酶基因，条件是标记多肽不会不利地影响所治疗生物的代谢。所述基因盒还可与合成送递系统，如PCT公开号No.WO95/22618中公开的系统中的核酸结合部分结合。
可通过适于所用载体的任何方法将核酸引入到细胞中。许多这类方法都是本领域熟知的(Sambrook等人，supra和Watson等人，“Recombinant DNA”，Chapter 12，2d edition，Scientific AmericanBooks，1992)。重组载体可通过如磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体-介导的转染、基因枪、微量注射、病毒衣壳-介导的转移、聚凝胺-介导的转移、或原生质体融合等方法转移。关于脂质体制备、内含物的靶向和送递过程见Mannino和Gould-Fogerite(Bio Techniques，6682-690，1988)，Felgner和Holm(Betliesda Res.Lab.Focus，1121，1989)以及Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，1125，1989)。
重组载体(质粒载体或病毒载体)的转移可通过直接注射到羊水中或通过静脉内送递完成。
还可使用腺病毒载体或腺伴随病毒载体(AAV)进行基因送递。腺病毒存在于许多动物中，致病性并不高，且可在分裂和静止的细胞中相等复制。通常，基因送递所用的腺病毒缺少病毒复制所需的一个或多个基因。用于VEGF、PlGF或任何sFlt-1结合蛋白送递的复制-缺损型重组腺病毒载体可根据本领域已知的技术生产(见，Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sco.USA，892581-2584，1992；Stratford-Perricadet等人，J Clin.Invest.，90626-630，1992；和Rosenfeld等人，Cell，68143-155，1992)。基因疗法在子宫中使用的实施例见美国专利号No.6,399,585。
可使用各种方法将dsRNA或寡核苷酸转染或引入到哺乳动物细胞中。例如，有若干可商业得到的转染试剂，包括但不限于TransIT-TKOTM(Mirus，目录号MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目录号301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目录号MIR12252-011)。每种转染试剂的方案都可从制造商处获得。
一旦转染，核酸由损伤部位的细胞表达一段时间，这段时间足以提高VEGF、PlGF、或任何其它sFlt-1结合蛋白的血清水平。因为通常含有所述核酸的载体没有被掺入到细胞基因组中，因此目标蛋白的表达只进行一段有限的时间。通常，所述蛋白以治疗水平表达约2天到几周，优选约1-2周。DNA的再次应用可用于提供治疗性蛋白表达的额外时间。近来使用VEGF治疗哺乳动物血管疾病的基因疗法的例子可在Deodato等人(Gene Ther.，9777-785，2002)；Isner等人(HumanGene Ther.，121593-1594，2001)；Lai等人(Gene Ther.，9804-813，2002)及Freedman和Isner(Ann.Intern.Med.，13654-71，2002)和IsnerJM(Nature，415234-239，2002)中找到。
基因和蛋白表达的测定法下列方法可用于评价蛋白或基因表达并测定用于提高VEGF、PlGF或任何其它sFlt-1结合蛋白水平，或降低sFlt-1蛋白水平的上述任何一种方法的功效。
测量被试者血清中已知结合sFlt-1的VEGF、PlGF、或任何蛋白配体的水平。用于测量蛋白血清水平的方法包括ELISA、蛋白质印迹、或使用特异性抗体的免疫测定法。此外，可进行体外血管生成测定法以确定被试者的血液是否已经从抗-血管生成状态转化至促-血管生成状态。这种测定法在上面实施例2中描述。阳性结果被认为已知结合sFlt-1的VEGF、PlGF或任何蛋白配体的血清水平提高了至少20％、优选30％、更优选至少50％且最优选至少60％。使用体外血管生成测定法获得的阳性结果还可被认为从抗-血管生成状态转化为促-血管生成状态。
本领域已知的测定基因表达的方法有很多。一些例子包括分离被试者血液样品的RNA，并使用RNA进行RNA印迹、PCR扩增或RNA酶保护测定法。
抗体用于治疗性处理的用途在从患有先兆子痫孕妇采集的血清样品中发现的sFlt-1水平提高表明sFlt-1可作为“生理库”与功能性VEGF和PlGF的滋养层细胞和产妇内皮细胞结合并使其缺失。结合sFlt-1并阻断VEGF或PlGF结合的化合物，如抗体的使用可通过增加游离的VEGF或PlGF而帮助预防或治疗先兆子痫或子痫。这种增加将使滋养层的增殖、迁移和胎盘发育及胎儿营养所需的血管生成增加，且使全身的产妇内皮细胞健康。
本发明提供特异性结合sFlt-1配体-结合结构域的抗体。所述抗体用于抑制sFlt-1，且最有效的机理据信是通过直接阻断VEGF或PlGF的结合位点，然而，不排除其它机理。用于治疗目的的抗体的制备和使用方法在许多专利中描述，包括美国专利号6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，它们引入此处作为参考。抗体可以是多克隆的或单克隆的；优选单克隆抗体。
单克隆抗体，特别是来源于啮齿动物包括小鼠的那些已经用于治疗各种疾病；然而，它们的使用有限，包括诱导引起快速清除和治疗功效降低的人抗-小鼠免疫球蛋白。例如，啮齿动物单克隆抗体临床使用的主要限制是治疗过程中的抗-球蛋白反应(Miller等人，Blood，62988-995 1983；Schroff等人，Cancer Res.，45879-885，1985)。
现有技术已经尝试通过构建“嵌合”抗体克服这个问题，其中动物抗原-结合可变结构域与人恒定结构域偶联(美国专利号No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984；Boulianne等人，Nature，312643-646，1984；Neuberger等人，Nature，314268-270，1985)。这种嵌合抗体的生产和使用在下面描述。
结合sFlt-1的配体的竞争性抑制可用于预防或治疗先兆子痫或子痫。sFlt-1的抗体可阻断VEGF或PlGF与sFlt-1结合，导致VEGF或PlGF水平提高。这种提高可援救内皮功能异常，并使促-血管生成/抗-血管生成因子的平衡向着血管生成方向转变。
本发明单克隆抗体的混合物可用作先兆子痫或子痫的有效治疗。该混合物可包括少至2、3或4种不同抗体或多至6、8或10种不同抗体。此外，本发明抗体可与抗-高血压药物(例如，甲基多巴、盐酸肼苯哒嗪、或拉贝洛尔)或用于治疗先兆子痫、子痫或与先兆子痫或子痫有关的症状的任何其它药物结合使用。
抗体的制备特异性结合sFlt-1受体的单克隆抗体可通过本领域已知的方法生产。这些方法包括由Kohler和Milstein(Nature，256495-497，1975)以及Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，The Productionand Characterization of Rodent and Human Hybridomas”，Burdon等人，Eds.，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Volume 13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985)描述的免疫学方法，以及Huse等人(Science，246，1275-1281，1989)描述的重组DNA方法。
单克隆抗体可从培养杂交瘤细胞的上清液或从通过将杂交瘤细胞腹膜内接种到小鼠中诱导的腹水制备。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol，6，511-519，1976)描述的杂交瘤技术已经广泛用于生产杂种细胞系，分泌高水平的抗许多特异性抗原的单克隆抗体。
宿主动物或从其培养的抗体-产生细胞的途径和程序通常是用于抗体刺激和产生的已建立和常规的技术。通常，将小鼠用作试验模型，然而，任何哺乳动物被试者包括人类被试者或来源于它的抗体产生细胞可按照本发明方法被操纵以作为哺乳动物，包括人杂种细胞系产生的基础。
免疫之后，免疫淋巴样细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂种细胞系，它们可被无限培养和亚培养，从而产生大量单克隆抗体。就本发明的目的而言，相对于融合体选择的免疫淋巴样细胞是淋巴细胞和它们正常的分化后代，采集自免疫动物的淋巴结组织或脾脏组织。优选使用脾细胞，这是因为它们可提供相对于小鼠系统更浓且适宜的抗体产生细胞来源。骨髓瘤细胞提供用于融合杂种连续繁殖的基础。骨髓瘤细胞是来源于浆细胞的肿瘤细胞。鼠骨髓瘤细胞系可例如，从AmericanType Culture Collection(ATCC；Manassas，VA)获得。还描述过人骨髓瘤和小鼠-人异杂交瘤细胞系(Kozbor等人，J.Immunol.，1333001-3005，1984；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63，1987)。
所述杂种细胞系可在细胞培养基中体外维持。一旦建立了杂交瘤细胞系，就可在各种营养适宜的培养基，如次黄嘌呤-氨基嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基中维持。此外，杂种细胞系可以许多常规方式贮藏并保存，包括冷冻和在液氮下贮藏。可使冷冻细胞系复苏并用重新开始的单克隆抗体的合成和分泌无限培养。通过常规方法，如沉淀、离子交换色谱、亲和色谱等回收组织培养物上清液中的分泌抗体。
所述抗体可在任何哺乳动物中制备，包括小鼠、大鼠、兔、山羊和人。所述抗体可以是下列其中一个免疫球蛋白种类的成员IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类，优选是IgG抗体。
当用于产生单克隆抗体的优选动物是小鼠时，本发明不限于此；事实上，可使用人类的抗体并可证实是优选的。这类抗体可使用人杂交瘤获得(Cole等人，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy”，Alan R.Liss Inc.，p.77-96，1985)。在本发明中，可使用通过剪接适宜抗原特异性小鼠抗体分子的基因连同人类抗体分子的基因而生产嵌合抗体的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等人，Nature 312，604-608，1984；Takeda等人，Nature 314，452-454，1985)；这类抗体包括在本发明的范围之内并在下面描述。
作为细胞融合技术的另一选择，Epstien-Barr病毒(EBV)无限增殖化B细胞可用于生产本发明的单克隆抗体(Crawford D.等人，J ofGen.Virol.，64697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，41275-1280，1981；Kozbor等人，Methods in Enzymology，121120-140，1986)。通常，该过程包括从适宜来源，通常是感染细胞系分离Epstein-Barr病毒，并使靶抗体分泌细胞与含病毒的上清液接触。洗涤细胞，并在适宜的细胞培养基中培养。随后，存在于细胞培养物中的病毒转化细胞可通过Epstein-Barr病毒核抗原的存在而鉴定，且转化的抗体分泌细胞可使用本领域已知的标准方法鉴定。产生单克隆抗体，如重组DNA的其它方法也包括在本发明的范围内。
sFlt-l免疫原的制备sFlt-1本身可作为免疫原使用，或可与载体蛋白或其它物体，如琼脂糖珠连接使用。sFlt-1可从已知表达内源性蛋白的细胞，如人脐带静脉内皮细胞纯化(HUVEC；Kendall等人，Biochem.Biophys.Res.Coma.，226324-328，1996)。此外，编码sFlt-1的核酸分子或其一部分可使用标准重组DNA技术而被插入到已知载体中用于在宿主细胞中表达。适合sFlt-1表达的宿主细胞包括杆状病毒细胞(例如，Sf9细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌)、和哺乳动物细胞(例如，NIH3T3细胞)。
此外，可合成肽并用作免疫原。制备肽抗体的方法是本领域熟知的且通常需要将肽与适宜的载体分子，如血清白蛋白偶联。肽包括与Genebank登记号U01134相对应的sFlt-1氨基酸序列的任一部分基本相同的任何氨基酸序列。肽可以是任何长度，优选10个氨基酸或更多，更优选25个氨基酸或更多，且最优选40、50、60、70、80或100个氨基酸或更多。优选，所述氨基酸序列与U01134序列至少60％、更优选85％、且最优选95％相同。肽可以是商业获得的或使用本领域熟知的技术制备的，如，例如Merrifield固相方法(Science，232341-347，1985)。所述过程可使用商业得到的合成仪，如Biosearth9500自动化肽机器，阻断氨基酸的裂解是使用氟化氢获得的，且使用Waters Delta Prep 3000仪器，在15-20μm Vydac C4 PrepPAK柱上，通过制备型HPLC纯化肽。
抗体的功能等价物本发明还包括本说明书中描述的抗体的功能等价物。功能等价物包括所具有的氨基酸序列与本发明抗体可变或高变区的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等价物具有可与抗体那些相比较的结合特性，且包括，例如，嵌合的、人源化单链抗体及其片段。生产这种功能等价物的方法在PCT公开号No.WO93/21319；欧洲专利申请号No.239,400；PCT公开号No.WO89/09622；欧洲专利申请号No.338,745；欧洲专利申请号No.332424；以及美国专利号No.4,816,567中公开；每篇均引入此处作为参考。
嵌合抗体优选具有基本上或仅仅来源于人类抗体恒定区的恒定区以及基本上或仅仅来源于除人类以外的哺乳动物可变区序列的可变区。这类人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合子序列)，其包括来源于非-人类免疫球蛋白的最小序列。使非-人类抗体人源化的方法是本领域熟知的(见Vaswani和Hamilton，Ann Allergy AsthmaImmunol.，81105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1118-129，2001)。通常，人源化抗体具有引入其中的一个或多个氨基酸，它的来源是非人类。这些非人类氨基酸残基常常被称作输入残基，它们通常是从输入可变结构域得到的。人源化本来可在本领域已知的方法之后(Jones等人，Nature，321522-525，1986；Riechmann等人，Nature，332323-329，1988；和Verhoeyen等人，Science，2391534-1536，1988)，通过用啮齿动物的CDR或其它CDR序列置换人类抗体的相应序列进行。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体，其中大大小于完整的人可变结构域已经被来源于非-人类的相应序列置换(见，例如，美国专利号No.4,816,567)。实际上，人源化抗体通常是人类的抗体，其中某些CDR残基且很可能某些FR残基被来源于啮齿动物类似位点的残基置换(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992)。
制备人源化抗体的其它方法可在美国专利号Nos.5,821,337和6,054,297以及Carter(supra)中描述，它们全部引入此处作为参考。从任一免疫球蛋白种类中选择人源化抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG、IgG2、IgG3和IgG4。当不需要细胞毒素活性时，如在本发明中，恒定结构域优选IgG2类。人源化抗体可包括来源于不止一个种类或同种型的序列，选择特定的恒定结构域以使所需效应子功能达到最佳也在本领域技术人员范围之内。
人类抗体还可使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示库(Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597，1991和Winter等人，Annu.Rev.Immu7lol.，12433-455，1994)。Cole等人和Boerner等人的技术还可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，supra；Boerner等人，J.Immunol.，14786-95，1991)。
除人类以外适宜的哺乳动物包括可从其制备单克隆抗体的任何哺乳动物。除人以外哺乳动物的例子包括，例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、或灵长类动物；优选小鼠。
抗体的功能等价物还包括单链抗体片段，也称作单链抗体(scFv)。单链抗体片段是重组多肽，其通常结合抗原或受体；这些片段包含与抗体可变轻链序列(VL)结合的抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段，其中具有或没有一个或多个相互连接的连接体。这种连接替可以是短的、可弯曲的肽，它们是为确保VL和VH结构域一旦连接即发生适当的三维折叠而选择的，以便维持衍生单链抗体片段的完全抗体的靶分子结合-特异性。通常，VL或VH序列的羧基末端通过这种肽连接体与互补VL和VH序列的氨基末端共价连接。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或类似技术产生。这些蛋白可在真核生物细胞或原核生物细胞，包括细菌中产生。
单链抗体片段包含的氨基酸序列具有在本说明书中描述的完全抗体的至少一个可变区或CDR，但缺少那些抗体恒定结构域的一部分或全部。这些恒定结构域不是抗原结合所必需的，但构成完全抗体结构的主要部分。单链抗体片段可因此克服与使用含恒定结构域一部分或全部的抗体有关的某些问题。例如，单链抗体片段倾向于缺少生物分子与重链恒定区之间的不需要的相互作用，或其它不需要的生物学活性。此外，单链抗体片段明显小于完全抗体且因此比完全抗体具有更大的毛细管渗透性，使单链抗体片段局部化并更有效结合靶抗原-结合位点。且，抗体片段可在原核生物细胞中相对大规模地产生，由此促进它们的产生。此外，相对较小的单链抗体片段可使得它们与完全抗体相比不太可能诱导受体的免疫反应。
功能等价物还包括与完全抗体那些具有相同或可比较的结合特性的抗体片段。这种抗体可包含一个或两个Fab片段或F(ab′)2片段。优选，抗体片段包括完全抗体的全部6个CDR，虽然含有比这类区全部要少，如3、4或5个CDR的片段也是功能性的。
此外，功能等价物可以是或可结合下列任一免疫球蛋白种类的成员IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亚类。
抗体功能等价物的制备抗体等价物是通过本领域已知方法制备的。例如，抗体片段可从完整抗体酶制备。优选，抗体等价物是从编码这种等价物的DNA制备的。编码抗体片段的DNA可通过几乎使编码全长抗体的DNA所需部分缺失而制备。
编码嵌合抗体的DNA可通过使DNA重组而制备，该DNA基本或仅仅编码人恒定区，且该DNA编码基本或仅仅来源于除人类以外的哺乳动物可变区序列的可变区。编码人源化抗体的DNA可通过使编码除了基本或仅仅来源于相应人类抗体区的CDR之外的恒定区和可变区的DNA重组并使编码基本或仅仅来源于除人类以外的哺乳动物的CDR的DNA重组而制备。
编码抗体片段的DNA分子的适宜来源包括细胞，如杂交瘤，它表达全长抗体。所述片段本身可作为抗体等价物使用，或可如上所述被重组成等价物。
本部分所述的DNA缺失和重组可通过已知方法进行，如在上列公开的专利申请中描述的那些。
抗体的筛选和选择使用标准的本领域已知的方法分离并纯化单克隆抗体。例如，可使用标准的本领域已知的方法，如相对于sFlt-1肽抗原进行ELISA或进行蛋白质印迹筛选抗体。这种技术的实施例在美国专利号No.6,365,157的实施例II和III中描述，其引入此处作为参考。
抗体的治疗用途当体内用于治疗或预防先兆子痫或子痫时，以治疗有效量将本发明抗体给予被试者。优选，肠胃外给予所述抗体或通过连续输注静脉内给予所述抗体。剂量和给药方法取决于疾病的严重程度以及被试者的整体健康状况。所给予抗体的用量通常为约0.01-约10mg/kg被试者体重。
进行肠胃外给药时，将抗体与药学可接受的肠胃外赋形剂配制成单位剂量可注射形式(溶液、混悬液、乳状液)。这种赋形剂本身是无毒且无-治疗性的。这种赋形剂的例子是水、生理盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、以及5％人血清白蛋白。还可使用不含水的赋形剂如不挥发油以及油酸乙酯。可将脂质体用作载体。所述赋形剂可包含微量助剂如提高等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液及防腐剂。通常以约1mg/ml-10mg/ml的浓度在这种赋形剂中配制抗体。
抑制sFlt-1的治疗性化合物已知在患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者中，sFlt-1水平提高，因此可降低sFlt-1多肽或核酸分子表达的任何药剂都可用于本发明的方法中。这种药剂包括可破坏sFlt-1与VEGF或PlGF、反义核酸碱基寡聚物、以及用于介导RNA干扰的dsRNA结合的小分子。
联合疗法任选地，先兆子痫或子痫的治疗可与任何其它标准的先兆子痫或子痫疗法联合进行；这种方法是本领域技术人员已知的且在此处描述。本发明的先兆子痫或子痫治疗可与提高VEGF途径活性的任何化合物联合给予。还可诱导内源性VEGF产生的药剂的非限制性例子包括烟碱、米诺地尔、硝苯地平、腺苷、硫酸镁和茶碱。在其中一个实施方案中，PlGF蛋白可与上列诱导内源性VEGF产生的任何药剂联合使用。
被试者监测患有先兆子痫、子痫或具有发展这类病倾向的被试者的疾病状况或治疗可使用本发明的方法和组合物监测。在其中一个实施方案中，监测sFlt-1、VEGF或PlGF多肽在体液，如尿液、血浆、羊水或CSF中的表达。这种监测可能是有用的，例如，在评价特定药物在被试者中的功效或评价疾病发展时。降低sFlt-1核酸分子或多肽表达或提高VEGF或PlGF核酸分子或多肽表达的治疗在本发明中特别有效。
其它实施方案根据上述描述，很显然可对此处描述的发明进行各种改变和修改，并将它用于各种用途和情况。这种实施方案也在下列权利要求的范围内。
本说明书中提到的所有出版物均以相等程度引入此处作为参考，就好像每个独立的出版物或专利申请特别且单独引入此处作为参考。此外，美国临时申请号60/451796，2003年3月3日提交、60/397,481，2002年7月19日提交、和60/467,390，2003年5月2日提交，均整体引入此处作为参考。
权利要求
1.一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予所述被试者能够结合可溶性Flt-1受体(sFlt-1)的化合物的步骤，其中所述给药时间和用量足以治疗或预防该被试者的先兆子痫或子痫。
2.一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予所述被试者提高能够结合sFlt-1的生长因子水平的化合物的步骤，其中所述给药时间和用量足以治疗或预防该被试者的先兆子痫或子痫。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物是烟碱。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物是茶碱。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物选自腺苷、硝苯地平、和米诺地尔。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是纯化的sFlt-1抗体或sFlt-1抗原结合片段。
7.一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予所述被试者与至少一部分sFlt-1核酸序列互补的反义核酸碱基寡聚物的步骤，其中所述给药足以治疗或预防该被试者的先兆子痫或子痫。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反义核酸碱基寡聚物的长度为8-30个核苷酸。
9.一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予所述被试者含有至少一部分sFlt-1核酸序列的双链RNA的步骤，其中所述给药足以治疗或预防该被试者的先兆子痫或子痫。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述双链RNA被加工成19-25个核苷酸长的小分子干扰RNA(siRNA)。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述化合物是生长因子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述生长因子是VEGF121。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述生长因子是VEGF165。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述生长因子是胎盘生长因子(P1GF)。
16.根据权利要求1、2、7或9所述的方法，还包括给予被试者抗-高血压化合物的步骤。
17.根据权利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被试者是怀孕的人。
18.根据权利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被试者是产后的人。
19.根据权利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被试者是非-人类。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述被试者选自牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫。
21.一种治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予需要这种治疗的被试者有效量的含有VEGF或PlGF多肽的药物组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物含有VEGF多肽。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物含有PlGF多肽。
24.一种治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予需要这种治疗的被试者有效量的含有编码VEGF或PlGF的核酸分子的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述组合物含有VEGF核酸分子。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述组合物含有PlGF核酸分子。
27.一种治疗或预防被试者先兆子痫或子痫的方法，该方法包括给予所述被试者抑制sFlt-1多肽结合生长因子的化合物的步骤，其中所述给药足以治疗或预防被试者的先兆子痫或子痫。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述化合物结合sFlt-1并阻断生长因子的结合。
29.根据权利要求21、24或27所述的方法，还包括给予被试者抗-高血压化合物的步骤。
30.根据权利要求21、24或27所述的方法，其中所述被试者是怀孕的人。
31.根据权利要求21、24或27所述的方法，其中所述被试者是产后的人。
32.根据权利要求21、24或27所述的方法，其中所述被试者是非-人类。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述被试者选自牛、马、绵羊、猪、山羊、狗、或猫。
34.一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫、或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法包括测量所述被试者样品中的sFlt-1、VEGF、和PlGF多肽水平。
35.一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫、或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法是通过测量所述被试者样品中sFlt-1、VEGF、和PlGF多肽中至少两个的水平并利用度量计算所述sFlt-1、VEGF、或PlGF水平之间的关系，其中被试者样品中所述水平之间的关系相对于参照样品的改变可诊断该被试者的先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述度量是先兆子痫抗-血管生成指数(PAAI)[sFlt-l/VEGF+P1GF]。
37.根据权利要求36所述的方法，其中大于20的PAAI值是先兆子痫或子痫的诊断指标。
38.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述测量是用免疫学测定法进行的。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述免疫学测定法是ELISA。
40.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述样品是血清。
41.根据权利要求34或35所述的方法，其中sFlt-1水平大于2ng/ml是先兆子痫或子痫的诊断指标。
42.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述sFlt-1水平是游离的、结合的或总的sFlt-1水平。
43.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述VEGF或PlGF的水平是游离的VEGF或PlGF的水平。
44.一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫、或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法包括测量所述被试者样品中的sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的水平并把它与参照样品进行比较，其中所述水平的改变可诊断该被试者的先兆子痫或子痫，或诊断发展先兆子痫或子痫的倾向。
45.一种诊断被试者患有先兆子痫或子痫、或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法包括测定被试者样品中sFlt-1、VEGF、或PlGF基因的核酸序列，并把它与参照序列进行比较，其中被试者核酸序列的改变是指基因产物在所述被试者中的表达水平的改变，可诊断患有先兆子痫或子痫的被试者，或发展先兆子痫或子痫的倾向。
46.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述样品是该被试者的体液，其中所述sFlt-1、VEGR或P1GF可正常检测。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述体液选自尿液、羊水、血清、血浆或脑脊液。
48.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述样品是细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是内皮细胞。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是白细胞。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是单核细胞。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是来源于胎盘的细胞。
53.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述样品是组织。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述组织是胎盘组织。
55.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被试者是未怀孕的人且该方法可诊断发展先兆子痫或子痫的倾向。
56.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被试者是怀孕的人。
57.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被试者是产后的人。
58.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被试者是非-人类。
59.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被试者是选自牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫的非-人类。
60.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中测量的至少一种所述水平是sFlt-1的水平。
61.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中测量VEGF水平时，也测量sFlt-1或PlGF水平。
62.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中sFlt-1核酸或多肽水平相对于对照的提高是先兆子痫或子痫的诊断指标。
63.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中游离VEGF核酸或多肽水平相对于对照的降低是先兆子痫或子痫的诊断指标。
64.根据权利要求34、35、44或45所述的方法，其中游离PlGF核酸或多肽水平相对于对照的降低是先兆子痫或子痫的诊断指标。
65.根据权利要求34、35或44所述的方法，其中所述水平的测量在两种或多种场合下进行且测量之间所述水平的改变是先兆子痫或子痫的诊断指标。
66.一种用于诊断被试者先兆子痫或子痫的试剂盒，它包括选自sFlt-1、VEGF和P1GF核酸分子或与其互补的序列、或其任意组合的核酸序列。
67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述核酸序列包括用于检测所述核酸分子的至少两个核酸探针。
68.一种用于诊断被试者先兆子痫或子痫的试剂盒，它包括检测sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽、或其任意组合的工具。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述检测工具选自免疫学测定、酶测定、和比色测定。
70.根据权利要求66或68所述的试剂盒，其中所述试剂盒可诊断怀孕或未怀孕的被试者发展先兆子痫或子痫的倾向。
71.根据权利要求66或68所述的试剂盒，其中所述试剂盒可检测sFlt-1。
72.根据权利要求66或68所述的试剂盒，其中所述试剂盒可检测PlGF。
73.根据权利要求66或68所述的试剂盒，其中所述试剂盒检测VEGF时，还可检测sFlt-1或PlGF。
74.一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，该方法包括使表达sF1t-1、VEGF、或PlGF核酸分子的细胞与候选化合物接触，并将该核酸分子在与所述候选化合物接触过的细胞中的表达水平和在没有与所述候选化合物接触过的对照细胞中的表达水平进行比较，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子表达的改变可鉴定所述候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述改变是sFlt-1水平的降低。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述改变是VEGF或PlGF水平的提高。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述表达的改变是转录的改变。
78.根据权利要求74所述的方法，其中所述表达的改变是翻译的改变。
79.一种在药学可接受的载体中配制的、包括VEGF或PlGF多肽或其一部分、以及降低高血压的化合物的药物组合物。
80.一种适于给予怀孕哺乳动物的、在药学可接受的载体中配制的、包括PlGF核酸分子或其一部分的药物组合物。
81.根据权利要求79所述的组合物，它还包含VEGF核酸分子或其一部分。
82.一种包含可特异性结合sFlt-1的纯化抗体或其抗原结合片段的组合物。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段可阻止生长因子与sFlt-1结合。
84.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
85.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人类的抗体或人源化抗体。
86.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体缺少Fc部分。
87.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体是F(ab′)2、Fab、或Fv结构。
88.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段存在于药学可接受的载体中。
89.一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，该方法包括使表达sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的细胞与候选化合物接触，并将所述多肽在与所述候选化合物接触过的细胞中的表达水平和多肽在没有与所述候选化合物接触过的对照细胞中的表达水平进行比较，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽表达的改变可鉴定所述候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述表达的改变是用免疫学测定法、酶测定法、或免疫测定法测定的。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述表达的改变是sFlt-1水平的降低。
92.根据权利要求89所述的方法，其中所述表达的改变是VEGF或PlGF水平的提高。
93.一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，该方法包括使表达sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的细胞与候选化合物接触，并将所述多肽在与该候选化合物接触过的细胞中的生物学活性和在没有与该候选化合物接触过的对照细胞中的生物学活性进行比较，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽生物学活性的改变可鉴定所述候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述生物学活性的改变是sFlt-1活性降低。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述生物学活性的改变是VEGF或PlGF活性提高。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述生物学活性的改变是用免疫学测定法、酶测定法或免疫测定法测定的。
97.一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，该方法包括在有候选化合物存在的条件下检测sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，其中相对于在没有所述候选化合物存在的条件下sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，所述结合的降低可鉴定所述候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
98.一种鉴定阻止sFlt-1多肽与生长因子之间结合的多肽或其片段的方法，该方法包括在有所述候选多肽存在的条件下检测sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，其中相对于在没有候选多肽存在的条件下sFlt-1多肽与生长因子之间的结合，所述结合的降低可鉴定该候选多肽为可阻止sFlt-1多肽与生长因子之间结合的多肽。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述生长因子是VEGF。
100.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述生长因子是PlGF。
101.一种鉴定可改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，包括检测sFlt-1多肽与候选化合物之间的结合，其中结合该sFlt-1多肽的化合物可改善先兆子痫或子痫。
102.根据权利要求101所述方法鉴定的化合物，其中所述化合物包含特异性结合sFlt-1多肽且阻止所述sFlt-1多肽与VEGF或PlGF结合的多肽。
103.根据权利要求102所述的化合物，其中所述多肽是抗体。
104.根据权利要求102所述的化合物，其中所述多肽是sFlt-1、VEGF或PlGF的片段。
全文摘要
此处公开了用于诊断先兆子痫和子痫的方法。此处还公开了使用提高VEGF或PlGF水平的化合物或降低sFlt－1水平的化合物治疗先兆子痫和子痫的方法。此处还公开了用于治疗先兆子痫或子痫的、抑制VEGF或PlGF与sFlt1结合的化合物。
文档编号G01N33/74GK1777443SQ03822180
公开日2006年5月24日 申请日期2003年7月21日 优先权日2002年7月19日
发明者S·A·卡鲁曼基, S·梅纳德, V·P·苏克哈特姆 申请人:貝丝以色列女执事医疗中心