专利名称：甲胎蛋白受体、其多克隆抗体及其试剂盒和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说，是甲胎蛋白受体多克隆抗体，及其试剂盒和用途。
背景技术：
甲胎蛋白，简称AFP，是由胎儿肝细胞合成，在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白，一般在妊娠后开始上升，至胎龄16-20周时达到最高峰，然后逐渐下降，至胎儿娩出后1-5周完全消失。而在原发性肝癌患者中，血清中AFP阳性率常常明显升高，超过400微克/升，甚至达到1000微克/升以上或呈进行性升高。AFP的检测不仅有助于原发性肝癌的诊断，而且可以作为原发性肝癌的疗效考核标准，并可判断预后。此外，还可以作为原发性肝癌的普查方法，通过普查，早期治疗，可以改善预后，甚至获得治愈。在其它癌症患者中也出现了异常的AFP阳性。
某些肿瘤细胞表面存在有甲胎蛋白的受体，因此，用针对该受体的检测手段可以确定肿瘤或肿瘤细胞的存在，对于诊断有重要意义。CN1169778描述了通过检测样品中与AFP受体的标记抗体反应来确定癌的存在。但并没有详细描述该受体的性状、结合特性等。因此，本领域仍然存在对于利用甲胎蛋白受体的抗体诊断盒进行诊断的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备甲胎蛋白受体的方法。
本发明的另一个目的是提供一种甲胎蛋白受体。
本发明的还有一个目的是提供一种甲胎蛋白受体的多克隆抗体的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供一种甲胎蛋白受体的多克隆抗体。
本发明的还有一个目的是提供甲胎蛋白受体的多克隆抗体的试剂盒。
本发明的还有一个目的是提供该试剂盒在诊断癌症中的用途。
在本发明的一个方面，提供了一种产生甲胎蛋白受体的方法，该方法包括步骤(a)将纯化的甲胎蛋白与凝胶偶联，制备甲胎蛋白凝胶柱；(b)从乳腺癌细胞制备总蛋白；(c)将步骤(b)中得到的总蛋白加到(a)制得的凝胶柱上；(d)洗涤柱，去除杂质；(e)用0.1-1.0M的钾盐溶液洗脱，收集蛋白峰组分，得到甲胎蛋白受体。
在该方面的一个优选例中，钾盐溶液是氯化钾溶液，优选浓度为0.4M。
在本发明的另一个方面，提供了一种用上述方法制备的甲胎蛋白受体，其特征在于，该蛋白大小为45kD，含有YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE的序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种多克隆抗体，它特异性地抗上述甲胎蛋白受体。
在一个优选例中，该多克隆抗体与标记偶联，所述标记选自HRP，碱性磷酸酶，生物素。
在本发明的还有一个方面提供了一种诊断试剂盒，该试剂盒含有上述多克隆抗体和显色剂，显色剂优选为二氨基联苯胺。
在本发明的还有一个方面，提供了上述多克隆抗体的用途，其特征在于，该抗体用于检测体外标本中甲胎蛋白受体的存在。
图1显示了280nm下的蛋白洗脱峰。
图2是用考马斯亮蓝染色的SDS凝胶电泳照片。
图3a显示了受体与过氧化物酶标记的甲胎蛋白结合的竞争性抑制实验结果。
图3b显示了与受体无特异性结合的卵蛋白竞争性实验结果。
图4a显示了多克隆抗体的Western Blot(蛋白印迹实验)结果。
图4b显示了多克隆抗体的组织切片染色结果。
具体实施例方式
甲胎蛋白受体的纯化甲胎蛋白可从脐带血中通过亲和层析(抗甲胎蛋白单克隆抗体的亲和层析)获得。凝胶柱可采用(Sigma公司提供的溴化氰活化的琼脂糖凝胶)，根据厂商说明书或本领域常规使用的方法偶联。
癌细胞株可选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌的细胞株。例如本领域已知的，且公众可得的乳腺癌MCF-7，肺癌A549等。这些细胞都具有甲胎蛋白受体。
细胞的培养可用常规方法，根据不同种类的细胞选择其生长条件。可使用常规的培养液，例如DMEM、RPMI、等。细胞长至密集后可以使用常规方法从培养基上分离，然后进行离心，裂解并超声振碎，离心取得上清液。由于甲胎蛋白受体位于细胞表面，因此不需要进一步的酶消化等步骤。
上清液上柱后，洗涤至OD280稳定。此时甲胎蛋白受体完全和偶联的甲胎蛋白结合，而其余蛋白质或其它杂质被洗去。
改变盐浓度，可改变蛋白质之间的离子相互作用，从而能洗脱蛋白质，优选是0.4M KCL。然后收集OD280nm的洗脱峰。
获得的AFP受体溶液可进一步浓缩，也可直接使用。
甲胎蛋白受体的定性分析可用常规的10％SDS PAGE，蛋白质印迹等方法对甲胎蛋白受体进行检测。同时，通过竞争性抑制法等可验证其与甲胎蛋白的结合性质。
甲胎蛋白受体多克隆抗体的获得用常规方法，将甲胎蛋白受体免疫入动物。免疫方法可使用家兔皮下注射，用常规的弗氏佐剂。本领域技术人员可参考文献获得免疫方法，例如Ed Harlow，David LaneUsing AntibodiesA Laboratory Manual等。免疫3-4个月后，可从家兔静脉血中收获抗血清并纯化。
甲胎蛋白受体抗体的鉴定和分析可使用甲胎蛋白受体进行免疫实验，并用蛋白质印迹分析和组织切片染色分析。
甲胎蛋白受体检测试剂盒的制备1.甲胎蛋白受体多克隆抗体的标记使用过氧化物酶标记抗体。该标记方法是本领域技术人员在ELISA技术中已知的。过氧化物酶可采用辣根过氧化物酶等。
2.质控切片为了对照起见，在试剂盒中加入了用本发明的多克隆抗体标记的肿瘤细胞切片。肿瘤细胞的培养和制片可使用常规技术。这些肿瘤细胞可视要检测的肿瘤类型而定，可采用乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌以及前列腺癌等的细胞或组织切片作为质控切片。
3.甲胎蛋白受体检测试剂盒的组成包括甲胎蛋白受体的过氧化物酶标记的多克隆抗体、过氧化氢溶液和酶底物二氨基联苯胺(DAB)。
4.效果本发明的试剂盒重复性好，敏感性高，与常规的伊红染色相比，在所有的肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌以及前列腺癌的病例中，甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒都能够及其明显的区分出恶性肿瘤区域，而伊红染色需要经过细心的形态学分析才能予以判别。
本发明的试剂盒在非极端条件下，不受时间、温度和试剂浓度变化的影响。
本发明的试剂盒稳定性好，至少能够在4℃下保存6个月，室温下至少两个月，37℃至少两周。
以下实施例是对本发明优选例的详述，不是为了限制本发明。
实施例1甲胎蛋白受体的纯化1.用亲和层析法从脐带血中纯化甲胎蛋白，经浓缩透析后再定量。
2.取20毫克纯化的甲胎蛋白，耦联于4克溴化氢活化的琼脂糖凝胶(SIGMA C-9210)，制成10毫升甲胎蛋白凝胶柱。耦联步骤完全根据Sigma公司提供的产品使用方法。
3.乳腺癌细胞株MCF-7培养于DMEM+10％胎牛血清，37℃，5％CO2。待细胞长至丰满后收获。3000转/分离心沉淀细胞，用PBS清洗3次，加0.1％SDS/PBS裂解细胞30分钟(1×100,000细胞/毫升裂解液)，经超声振碎。离心10000转/分30分钟后，取上清蛋白定量。
4.取1毫升细胞裂解液与10毫升甲胎蛋白凝胶混合2小时后，装柱，用PBS清洗至OD280值稳定。
5.加0.4M氯化钾洗脱，收集洗脱峰。再浓缩，透析。蛋白定量，经SDS凝胶电泳后，考马斯蓝染色。
图1显示了OD280nm下的蛋白洗脱峰。
图2是用考马斯亮蓝染色的SDS凝胶电泳照片。左侧为纯化的AFP，右侧是分子量标记。可见在45kD处有一清晰条带。
实施例2甲胎蛋白受体的定性分析用常规ELISA方法证实此蛋白与过氧化物酶标记甲胎球蛋白相结合，并且可以被未经标记的甲胎蛋白竞争性抑制。图3a显示了受体与过氧化物酶标记的甲胎蛋白结合的竞争性抑制实验结果。用未标记的甲胎蛋白与标记的甲胎蛋白竞争与受体的结合。可见在受体完全结合后，随着未标记甲胎蛋白的加入，标记量下降。用与受体无特异性结合的卵蛋白做竞争性实验，对其无抑制(见图3b)。
高碘酸钠(反应条件包被的甲胎蛋白受体于酶标板1微克/孔，加100微升0.1mol高碘酸钠，4℃孵育2小时)处理45KD的甲胎蛋白受体以破坏糖基，会明显的削弱它与甲胎蛋白的结合能力，但是如果以胃蛋白酶破坏其蛋白结构，它与甲胎蛋白的结合不受影响。可见，甲胎蛋白受体与甲胎蛋白的结合是通过糖基而结合的(数据未显示)。
用Western Blot和ELISA检测显示45KD的甲胎蛋白受体高表达于某些恶性肿瘤细胞，如人乳腺癌细胞，肺癌细胞，前列腺癌细胞，宫颈癌细胞，白血病细胞。(数据未显示)。
对该分离蛋白进行了蛋白质测序，得到N端和C端的部分氨基酸序列(YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE)。其中YGATDSIELATVIAA不和已知的任何序列具有相关性。EVDPNIQAVRTQE与细胞角蛋白8相似。
实施例3酶标记的甲胎蛋白受体多克隆抗体的制备，生产和鉴定1.甲胎蛋白受体多克隆抗体的制备用实施例2所纯化的甲胎蛋白受体按照本领域常规的方法(见Ed Harlow，David LaneUsing AntibodiesA Laboratory Manual参考文献)免疫家兔，收集抗血清，利用蛋白A亲和层析纯化抗体。
2.甲胎蛋白受体多克隆抗体的酶标将5毫克过氧化物酶(HRP)溶于1.2ml去离子水中。加0.3ml新鲜配制的0.1M高碘酸钠(10mM磷酸钠pH7.0).
室温下孵育20分钟。
对1mM醋酸钠pH4.0透析，4℃下过夜。
抗体10毫克/毫升溶于20mM碳酸钠缓冲液pH9.5中.
加0.5ml抗体于HRP中。
室温下孵育2小时。
加入100微升4mg/ml的硼氢化钠，4℃下2小时。
透析于PBS，4℃过夜。
3.乳腺癌MCF-7细胞制备质控切片将乳腺癌MCF-7细胞培养于8孔方形细胞培养板上(Falcon#354108)，培养液为DMEM+10％胎牛血清，培养12-24小时。
换培养液为无血清DMEM，继续培养1小时。
用95％酒精在室温下固定细胞5分钟。
PBS清洗细胞1次。
再用20％甘油/PBS清洗1次。
弃去甘油，勿使细胞干燥，立即将制成的玻片置于-20℃。
制成的细胞玻片编号。需要时取出染色。
注MCF-7细胞是人的乳腺腺癌细胞株，ATCC#HTB-22。
4.酶标甲胎蛋白受体多抗活性检测用MCF7细胞，K562细胞的SDS裂解液和纯化的甲胎蛋白受体包被酶标板，来对酶标的甲胎蛋白受体多抗进行滴度测定。在同一酶标板上，以一质控酶标作比较。
以乳腺癌组织切片和固定于玻片上的MCF-7细胞为对象，稀释酶标多抗1/400，1/200，1/100，1/50进行染色以确定最佳的工作浓度。
经检测，原始纯化的多克隆抗体浓度约为200微克/毫升，1/200为最佳工作浓度。
经45Kd蛋白免疫动物制备的多克隆抗体在组织切片染色中，此抗体特异性地和乳腺癌细胞相结合。(见图4a)。在Western Blot中，与乳腺癌细胞MCF7及淋巴瘤细胞K562中45KD蛋白特异性结合。(图4b)。
5.乳腺癌MCF-7细胞制备质控切片染色实验用新培养的MCF-7细胞制作玻片，和质控玻片一起，用质控酶标多抗染色后比较结果。染色步骤与产品说明书中一致，所用溶液取自于试剂盒。
记录实验结果。可见所得的染色结果和质控玻片的染色结果相同。
6.酶标甲胎蛋白受体多抗的稳定性酶标甲胎蛋白受体多抗溶液为PBS缓冲液pH 7.4，含2％BSA和0.02％硫柳汞，在45℃，37℃，室温和4℃下分别包存4天和45天，检测其活性。
结果如果酶标抗体仅仅储存于PBS中，在45℃，37℃下4天后，大部分酶活性都丧失。在室温下35天，大部分酶活性也都丧失。4℃下45天，酶的活性显著降低。
如果酶标抗体仅仅储存于PBS+2％BSA中，45℃下45天，大部分酶活性都丧失，但是，如在PBS、BSA和0.02％硫柳汞中保存37℃，室温和4℃下45天，酶的活性保持不变。
实施例4甲胎蛋白受体多克隆抗体试剂盒的实验1.试剂盒的组成甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒60人份包括以下部份试剂A，10X浓度的过氧化物酶标记甲胎蛋白受体多抗(基础浓度为200微克/毫升) 1.5ml酶标稀释液(PBS+1％明胶)30ml10倍的洗液(PBS+0.05％吐温-20) 100ml
底物DAB(0.05％w/v) 0.6ml过氧化氢溶液(0.66％v/v) 15ml阳性对照切片说明书2.试剂盒的确认实验用试剂盒内的2张已染色的乳腺癌切片作为阳性对照。
操作步骤根据标准方法制备病人需检测的组织的切片。
根据标准方法，将组织切片浸入二甲苯，用酒精和水处理来再水化病理组织。在每一步骤中，避免组织干燥。
为了减少内源性过氧化物酶的活性，用3％的过氧化氢/甲醇(24毫升30％过氧化氢溶于200毫升甲醇中)孵育切片15分钟。
加0.5毫升洗液清洗切片2分钟，重复洗片2次，拭去过剩液体。
加0.2毫升稀释液，放置20分钟。
加甲胎蛋白受体多抗酶标0.2毫升，孵育45分钟。
加0.5毫升洗液清洗切片5分钟，重复清洗2次。拭去切片过剩液体。
加0.2毫升DAB和过氧化氢混合物(1体积的DAB试剂加49体积的过氧化氢)。当染色切片的背景在镜下可见时，用去离子水清洗切片，通常情况下，显色过程为3-5分钟，不超过10分钟。当细胞的染色度与邻近的正常腺体和导管相当或更弱时，那么其结果即为阴性。建议用苏木精复染后再加盖玻片。
可接受指标所检测的试剂盒染色的肿瘤组织必须达到与阳性对照相同深度的染色。正常细胞染色不可以超过1个+。
3.非临床实验室检测的结果和讨论(1)敏感性和特异性在20例乳腺癌病理切片检测中，敏感性和特异性均达到100％，在20例良性病例和20例正常切片中，没有发现假阳性。本公司的检测中，18/18乳腺癌，6/6例胃癌，4/4例前列腺癌，5/5例肺癌和1/1例结肠癌为阳性。综合第三方结果总共38/38乳腺癌阳性。表明本试剂盒具有高度敏感性和特异性。
表1显示了切片检测的结果。
表1石蜡包埋切片检测结果
+轻微染色。
++一般染色。
+++深棕色染色。
该标准可以由病理科经验医师根据实践经验轻易判定。
结论结果显示甲胎蛋白肿瘤诊断试剂盒批号#001检测出18/18乳腺癌，6/6胃癌，4/4前列腺癌，5/5肺癌和1/1结肠癌。大部分正常组织被轻度染色为(+)，可是，痰中的巨噬细胞呈(+++)，肾小管呈(++)，也就是说巨噬细胞和肾小管在甲胎蛋白肿瘤诊断试剂盒检测中呈假阳性结果。但是，由于本试剂盒检测的是组织切片，因此不存在被痰液或肾小管的假阳性结果混淆的可能性。
(2)可重复性和耐受性由于甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒的可重复性较好。当试剂盒内的酶标试剂在2倍(体积浓度)范围内变化，37℃孵育5-15分钟，或室温下45-60分钟，结果显示仅仅在染色强度上有少许不同。37℃孵育比室温下的染色强度要略强。
(3)稳定性含有上述成分的甲胎蛋白肿瘤诊断试剂盒，储存于4℃、室温和37℃，在2周到8个月中，根据试剂盒内的说明书的步骤对乳腺癌石蜡切片进行染色。其结果总结如下表2保存的温度对试剂盒染色乳腺癌组织的影响 结论结果显示甲胎蛋白受体肿瘤诊断肿瘤诊断试剂盒批号在37℃下2周保持稳定，室温下2个月稳定，4℃下6个月稳定。
实施例5试剂盒临床实验的结果
1.甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒染色乳腺组织的评估将乳腺组织样本分为三组(1)侵润性和原位癌20例，(2)良性纤维腺瘤20例，(3)乳腺增生20例。所有样本均经苏木精和伊红染色而确诊。每一样本均从(安徽医科附属大学医院)保存的病理石蜡块中随机抽取。石蜡块的时间为2个月至年不等。
所有组织样本均按标准方法经10％的福尔马林固定和石蜡包埋。用切片机切成3毫米的切片。经实施例4制备的甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒染色，同时以Mayer苏木精染色以显示细胞核。对照组的切片经苏木精和伊红染色。切片在常规脱蜡后用水清洗，加30倍体积的过氧化氢孵育45分钟以抑制内源性的过氧化物酶活性，根据试剂盒说明书中的步骤进行染色。
结果用实施例4制备的甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒染色，在侵润性癌和原位癌切片中，癌细胞膜和胞浆均被染色呈棕色颗粒状。用阴性对照试剂染色细胞，细胞不被染色。管状细胞癌的染色要比小叶癌深，所有癌症病例中的癌细胞大部分染色呈阳性。很重要的是，在这些肿瘤病例中，从肿瘤细胞群到非增生性的组织结构，存在着由强到弱的染色，组织结构呈阴性。这表面了甲胎蛋白受体的表达与细胞分化之间的关系。未分化程度越高，甲胎蛋白受体染色就越深。良性和正常的肌上皮细胞膜显示微弱的染色。在纤维瘤中，某些腺管的局部细胞也有弱染色，而周围的大面积上皮细胞完全呈阴性。以上的弱阳性结果不会对最终鉴别癌细胞和良性细胞产生任何影响。
标本中的基质胶原呈均一分布的浅棕色背景，若用对照染液代替试剂A，这种背景就消失了。有趣的是，在纤维腺瘤和非增生性病例中，胶原产生的背景显得较强。这种背景最终不会影响对鉴别癌细胞和良性细胞。
任何良性病例(增生和纤维腺瘤)的染色都不会与恶性肿瘤相混淆。
结论经测试使用甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒，所有的癌症病例均显示阳性染色。没有任何良性病例显示出与恶性肿瘤相同的染色。我们认为，用本试剂盒染色甲胎蛋白受体可以区别癌性病灶，非癌性病灶和正常组织。因此，我们认为甲胎蛋白受体肿瘤诊断试剂盒在临床病理诊断上具有价值。
如上描述了本发明所公开的甲胎蛋白受体、其多克隆抗体、试剂盒的制备方法和制得的产品及其用途。但需理解其中包含了本领域技术人员所理解的变化和改变。这些变化和改变也包含在权利要求所限定的本发明的范围内。
权利要求
1.一种产生甲胎蛋白受体的方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)将甲胎蛋白与凝胶偶联，制备甲胎蛋白凝胶柱；(b)从乳腺癌细胞制备总蛋白；(c)将步骤(b)中得到的总蛋白加到(a)制得的凝胶柱上；(d)洗涤柱，去除杂质；(e)用0.1-1.0M的钾盐溶液洗脱，收集蛋白峰组分，得到甲胎蛋白受体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该钾盐溶液是氯化钾溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氯化钾溶液为0.4M。
4.一种甲胎蛋白受体，其特征在于，所述的甲胎蛋白受体是用权利要求1所述的方法制备的，大小为45kD，含有YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE的序列。
5.一种多克隆抗体，其特征在于，它特异性地抗权利要求4所述的甲胎蛋白受体。
6.如权利要求5所述的多克隆抗体，其特征在于，该多克隆抗体与标记偶联，所述标记选自辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，或生物素。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求5所述的多克隆抗体。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，还含有显色剂，所述所述显色剂是二氨基联苯胺。
9.如权利要求5所述的多克隆抗体的用途，其特征在于，该抗体用于制备检测体外标本中甲胎蛋白受体的存在的诊断试剂盒。
10.如权利要求7所述的诊断试剂盒的用途，其特征在于，该试剂盒用于检测体外标本中甲胎蛋白受体的存在。
全文摘要
公开了一种产生甲胎蛋白受体的方法，该方法包括步骤(a)将纯化的甲胎蛋白与凝胶偶联，制备甲胎蛋白凝胶柱；(b)从乳腺癌细胞制备总蛋白；(c)将步骤(b)中得到的总蛋白加到(a)制得的凝胶柱上；(d)洗涤柱，去除杂质；(e)用0.1－1.0M的钾盐溶液洗脱，收集蛋白峰组分，得到甲胎蛋白受体。还公开了用该方法获得的甲胎蛋白受体，针对该受体的多克隆抗体和用其制备的诊断试剂盒及其用途。
文档编号G01N33/68GK1624000SQ20031010902
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者胡小龙 申请人:上海泽桂生物科技有限公司