专利名称：光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物传感器，尤其是一种可用于生化需氧量(BOD)测定的微生物传感器中的光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器。
背景技术：
生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)是水质评价过程中最常用、最重要的指标之一。目前广为采用的5d生化需氧量标准稀释测定法是由美国公共卫生协会于1936年制定的标准方法。但是，传统的测量方法不仅需要5天培养等许多复杂的程序，而且测定的准确度与操作者的熟练程度及操作技巧有很大关系，因此无法实现对环境的实时和在线监测。在环境分析高度发展的今天，一种被称之为BOD微生物传感器的仪器逐渐发展起来。其原理基于微生物对有机物的耗氧代谢，测定BOD只涉及到初始氧化速率，因而可在10～15min内完成一个样品的测定，大大缩短了测定所需的时间。
BOD微生物传感器涉及敏感菌种的选择、菌的固定、二次传感、测定方式的选择等核心技术。现对国内已有的相关技术及其不足做简单介绍菌种的选择目前，国内BOD微生物传感器主要选用以下菌种制作传感膜复旦大学的邓家祺等选用异常汉逊氏酵母菌、地衣芽孢杆菌作为接种菌(邓家祺，等，分析化学，1994，7647～651)，哈尔滨医科大学的杜晓燕等选用皮状丝孢酵母菌和从活性污泥中分离筛选出的假单孢菌制作不同生物膜(杜晓燕，等，中华预防医学杂志，2003，37125～127)。由于都选用单一菌种，因此难以代谢待测水样中各种性质各异的有机物质。
菌的固定目前，国内报道过的菌的固定方法主要有以下几种醋酸纤维素薄膜夹层法、海藻酸钠包埋法、交联法等(邓家祺，等，环境科学，1994，158～11；王秀通，等，青岛建筑工程学院学报，2003，2496～98)。由于醋酸纤维素夹层法固定的膜稳定性较差，极易流失，在一个星期内活性较高，以后活性迅速衰减；此外，由于海藻酸钠易溶于磷酸盐溶液，因此也不适于长期使用。海藻酸钠包埋法固定的微生物膜必须浸于甘油中，保存比较因难，且测定时容易发生溶胀和流失现象，不适于实际应用。只有交联法固定的膜稳定性较好，寿命可达40d，此时其相对活性仍保持90％。
二次传感和测定方法BOD微生物传感器的菌膜在水样中响应后的信号要经过二次传感转化为可识别的信号。已有的BOD微生物传感器由于二次传感的不同可以分为两种微生物膜氧电极法和光纤光化学BOD微生物传感法。依据测定方式的不同，光纤光化学BOD微生物传感器法可以分为荧光强度稳态差值测量法(又称曝气法)和荧光强度变化速率测量法(又称膜动力学响应传感法)。目前国内外报道的最常见的二次传感装置是微生物膜氧电极法(Jing Liu et al.Biosensors&Bioelectronic 2000，14883～893；Gal-Joo Chee et al.AnalyticaChimica Acta 1999，379185～191；杜晓燕，等，传感器技术，1998，1727～32；安立超，等，环境污染与防治，1832～46；陈宁，等，中国环境监测，2002，1848～50；张悦，等，高技术通信，2001，837～39。)等。
已有的一些有关BOD生物传感器的专利不论是基于三电极系统的微生物膜电极法还是光纤光化学微生物传感器法，测定方法使用的大都是传统的曝气法。测定要在恒速搅拌、恒量曝气条件下进行，主要用于废水和生活污水BOD值的检测，未能最大限度地体现微生物传感器实时、在线监测的特点。
微生物氧电极法(测定方法为曝气法)的原理是仪器的传感器是一个微生物电极，将驯化好的微生物固定在用高分子材料制作的膜中，构成微生物膜，将微生物膜覆盖在溶解氧电极的透气膜上，组成微生物膜电极。测量时，先以标准缓冲液校准，使氧电极输出一基础电流；然后注入待测水样，水样流经微生物膜后，由于微生物的降解作用，消耗水样中的溶解氧，因而扩散到氧电极表面的氧的量相应地减少，导致氧电极输出电流减小。经过一定时间后氧电极输出电流达到平衡，这时氧电极输出电流值与水样中有机物浓度值存在定量关系。测量电流值即可计算出BOD值。与传统的BOD5相比有周期短、重现性好和精度高的特点。微生物膜电极法的检测限可达5mg/L，响应时间2～10min，测量周期30min。其不足是(1)为了便于控制通常使用单一菌种，单一菌种对不同的有机物降解能力不同，因而生物传感器的响应和重现性不同。因此适用于固定水系的定点测量。(2)微生物膜电极的响应时间较长，为了缩短响应时间，需要选用新的菌种和固定材料。(3)固定在微生物膜中的菌的活性逐步降低，每次测量后需要“活化”处理。且微生物膜的一致性、互换性差，因而仪器的自动化程度不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器敏感膜及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器及其测定方法，以代替常规的微生物膜氧电极曝气法等，提高BOD微生物传感器实时、在线监测的特性，并用于海水BOD值的测定。
本发明所说的光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器敏感膜由透明片、氧传感膜和菌膜组成，氧传感膜设于透明片上，菌膜固定在氧传感膜上。所说的菌膜最好为混菌膜。透明片选用透明玻璃片。
本发明所说的光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器敏感膜的制备方法为1)在透明片上采用溶胶-凝胶包埋法制备氧传感膜；2)采用有机改性溶胶凝胶-PVA(聚乙烯醇)包埋法在氧传感膜表面上固定混合菌。
在制备氧传感膜时可将TMOS(四甲氧基硅烷)和DiMe-DMOS(二甲基二甲氧基硅烷)按体积比1∶(1.5～2.0)的比例量取于开口瓶中，加入0.8～1.2ml0.001g/L溶有[Ru(dpp)3]2+(4，7-二苯基-1，10邻菲咯啉钌)的THF(四氢呋喃)溶液，旋涡振荡0.8～1.5min后，再逐滴振荡加入0.01mol/L HCl调节体系的pH值为3～4，将瓶子60～80℃下敞口磁搅拌水浴加热2～3h。取以上所制得的凝胶液50～100μL，均匀涂布于事先经乙醇和硝酸处理的玻璃片上成膜，于烘箱中干燥12～24h后备用。
氧传感膜的制备可将TMOS(四甲氧基硅烷)和DiMe-DMOS(二甲基二甲氧基硅烷)按体积比1∶1.8的比例量取于开口瓶中，加入适量浓度的[Ru(dpp)3]2+的THF溶液，旋涡振荡1min后，再逐滴振荡加入0.01mol/L HCl调节体系的pH，将瓶子60℃下敞口磁搅拌水浴加热3h。取以上所制得的凝胶液60μL，均匀涂布于事先经乙醇和硝酸处理的玻璃片上成膜，于烘箱中干燥12h后备用。
菌的固定可采用有机改性溶胶凝胶-PVA包埋法在氧膜的表面铺制混合菌，具体方法为按体积比1∶(1～1.5)量取TMOS和DiMe-DMOS于开口瓶中，超声振荡均匀时逐滴加入0.01mol/L HCl作为催化剂，将瓶子在50～70℃下敞口磁搅拌水浴加热0.5～1.5h，将所得到的凝胶液冷却至室温后，与4％～6％PVA水溶液按体积比1∶1混合，再加入150～250μL的菌悬液，充分振荡均匀，在氧传感膜表面涂成均匀薄层，室温通风处干燥成膜。此微生物膜厚度为0.60～0.65mm。其优点采用有机改性溶胶凝胶-PVA包埋法铺制的菌膜机械性能好，干燥后易成形，菌体活性保持良好，响应时间短，使用寿命长达1年。
本发明所说的光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器设有样品池、敏感膜、发光二极管和光纤，敏感膜和发光二极管置于样品池内，发光二极管的激发光直接照射在敏感膜的菌膜上，样品池上设有光窗，光纤的一端接光窗，光纤的另一端外接测量装置。所说的敏感膜的菌膜以混菌膜为宜。
本发明所说的光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器用于海水BOD值的测定方法为
1)在光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器的样品法为池中加入GGA溶液；2)发光二极管的光束直接照射在样品池中的菌膜上，响应后产生的荧光信号通过光纤传导进入光电倍增管；3)由光电倍增管输出的电流信号经微光测量仪转化为电压信号，再由色谱工作站转换为数字信号，由计算机记录、分析和处理。
所说的GGA溶液为准确称取分析纯的葡萄糖和谷氨酸各0.0750g，用以上磷酸缓冲溶液定容至100mL，配得的溶液称为BOD值为1000mg/L的GGA溶液。
图1为本发明的敏感膜正面图。
图2为本发明的敏感膜侧面图。
图3为本发明的测定装置示意图。
图4为本发明的传感膜BOD响应曲线。在图4中，横坐标为时间/min(t/min)，纵坐标为电流/毫伏(I/mv)。
图5为本发明的BOD敏感膜在空气中的恢复曲线。在图5中，横坐标为时间/min(t/min)，纵坐标为荧光强度(IF)。
图6为本发明BOD响应曲线的一阶求导曲线。在图6中，横坐标为时间/min(t/min)，纵坐标为荧光强度变化速率(dI/dt)。
图7为本发明的菌膜在0～30mg/L内的线性响应情况。在图7中，横坐标为(CGGA/mg·L-1)，纵坐标为荧光强度变化速率(dI/dt)。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
如图1，2所示，光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器敏感膜由透明玻璃片1、氧传感膜2和混菌膜3组成，氧传感膜2设于透明玻璃片1上，混菌膜3固定在氧传感膜2上。
菌种的选择已有方法均使用单一菌种铺制菌膜，本发明使用海水中分离出来的海水筛选菌种、在海水中反复驯化的淡水驯化芽孢杆菌等经培养后按1∶1混合铺制混菌膜。其优点由于菌膜中含有多种菌，代谢待测水样中各种有机物的能力得到互补，能够更彻底、更快速的待测代谢水样中的有机物。
氧传感膜的制备可将TMOS(四甲氧基硅烷)和DiMe-DMOS(二甲基二甲氧基硅烷)按体积比1∶(1.5～2.0)的比例量取于开口瓶中，加入[Ru(dpp)3]2+的THF溶液，旋涡振荡1min后，再逐滴振荡加入0.01mol/L HCl调节体系的pH，将瓶子60℃下敞口磁搅拌水浴加热3h。取以上所制得的凝胶液60μL，均匀涂布于事先经乙醇和硝酸处理的玻璃片上成膜，于烘箱中干燥12h后备用。
菌的固定采用有机改性溶胶凝胶-PVA包埋法在氧膜的表面铺制混合菌，具体方法为按体积比1∶(1～1.5)量取TMOS和DiMe-DMOS于开口瓶中，超声振荡均匀时逐滴加入0.01mol/L HCl作为催化剂，将瓶子在50～70℃下敞口磁搅拌水浴加热0.5～1.5h，将所得到的凝胶液冷却至室温后，与4％～6％PVA水溶液按体积比1∶(0.8～1.2)混合，再加入150～250μL的菌悬液，充分振荡均匀，在氧传感膜表面涂成均匀薄层，室温通风处干燥成膜。此微生物膜厚度为0.60～0.65mm。其优点采用有机改性溶胶凝胶-PVA包埋法铺制的菌膜机械性能好，干燥后易成形，菌体活性保持良好，响应时间短，使用寿命长达1年。
测定原理光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感器装置采用单支光纤传导荧光信号和稳压电源12。选用蓝色发光二极管4作为激发光(波长λmax＝460nm)直接照射在样品池5中的菌膜6上，响应后产生的荧光信号通过光纤7传导进入光电倍增管8。由光电倍增管8输出的电流信号经微光测量仪9转化为电压信号，再由色谱工作站10转换为数字信号，由计算机11记录，分析和处理(参见图3)。为了获得更好的分辨率，实验利用数据处理工作站的一阶导数功能，对记录的信号进行处理，获得一阶导数响应图谱。系统中发光二极管4与光纤7呈90°放置，这样可以有效消除激发光的干扰，以实现高的测量精度和准确性。测量时，取实验菌膜于样品池中，空气中静置至输出一恒定数字信号。此时，向样品池中加入20mL的GGA标准溶液，在不搅拌、不通空气和测量槽密封的条件下，测定液中菌膜周围的溶解氧将被迅速地消耗，而溶液中溶解氧来不及扩散补充，导致菌膜周围呈现一种局部缺氧的状态，经氧敏感膜二次传感表现为氧膜的荧光强度值逐渐升高。这种荧光强度变化速率的大小，随测量池中有机物浓度的不同而变化，在一定BOD浓度范围内，两者之间存在着一定的线性关系。
在不含有机物的条件下，菌膜中细菌内源呼吸达消极稳定状态，即呼吸迟缓状态，将制备好的敏感膜放于检测池，倒入20mL的GGA标准溶液后，在不搅拌、不通空气和检测池密封的条件下进行检测。此时测定液中传感膜周围的溶解氧将迅速被消耗，而溶液中溶解氧来不及扩散补充，导致菌膜周围呈现局部缺氧状态，将氧敏感膜二次传感表现为氧膜的荧光强度值逐渐升高。其过程主要分为三个阶段(参见图4)初期(a)细菌处于诱导期(惰性期)，荧光强度信号变化较小，中期(b)细菌进入积极呼吸状态，大量营养物质被吸收分解，O2含量随之迅速下降，荧光强度信号迅速增加。后期(c)菌膜周围呈现局部缺氧状态，膜内细菌再次进入抑制呼吸的内源稳定期，此时荧光信号增加缓慢，曲线渐渐进入转平点。BOD响应曲线如图4所示，实验条件T25℃；pH7.0；NaCl％3.5％；GGA浓度10mg/L。
传感膜响应恢复方式的选择当敏感膜的荧光强度值上升至最大值完成一个BOD值的测定后，必需将敏感膜恢复到测定前的最初状态，再进行另一个BOD值的测定。空气恢复法就是在测试完毕后将测量池中的水样排除，使敏感膜曝露在空气中一段时间，以空气中的氧使敏感膜恢复到初始状态的一种方法(参见图5)，整个过程分为三个阶段，a阶段是敏感对测定液的响应曲线，其响应速度由慢到快再到保持平衡；b阶段表示敏感在排除测定液、打开池盖后在空气中的恢复曲线，敏感膜的荧光信号迅速下降直至一个稳定值，a阶段与b阶段之间的信号突然增高为打开池盖外界光强所造成的；c阶段为再往测量槽中加入空白溶液并盖上池盖后敏感膜荧光强度变化曲线，外界的光影响消失后，敏感膜的荧光信号强度恢复到测定前的初始状态。实验证明空气恢复法可用于敏感膜的状态恢复。在通常测定中，当一个BOD值测定完毕后，只需倒出测定液，将敏感膜暴露于空气中待荧光强度值恢复至稳定后，即可加入测定液进行另一个BOD值的测定。实验条件T，30℃；pH，7.2；NaCl％，3.2％；GGA浓度，10mg/L。
BOD响应曲线经一阶求导后，荧光强度变化速率(dIF/dt)出现一最大值(参见图6)，这种荧光强度变化速率的大小，随测量池中有机物浓度的不同而变化，在一定BOD浓度范围内，两者之间存在着一定的线性关系(参见图7)。实验条件T，35℃；pH，7.2；NaCl％，3.2％；GGA浓度，0～30mg/L。
由此可见，本发明的优点是(1)光纤光化学BOD微生物膜动力学响应传感法比微生物膜电极法更适合于实时、快速、在线监测；(2)由于检测过程中无需搅拌，更适应于在线监测；(3)重现性好，稳定性佳，周期短，从一次进样到下次进样的时间小于30min；(4)可根据水质的不同选择单一菌种或混菌，可以对海水进行快速BOD分析。
权利要求
1.光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜，其特征在于由透明片、氧传感膜和菌膜组成，氧传感膜设于透明片上，菌膜固定在氧传感膜上。
2.如权利要求1所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜，其特征在于所说的菌膜为混菌膜。
3.如权利要求1所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜，其特征在于透明片选用透明玻璃片。
4.光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜的制备方法，其特征在于其步骤为1)在透明片上采用溶胶—凝胶包埋法制备氧传感膜；2)采用有机改性溶胶凝胶-PVA包埋法在氧传感膜表面上固定混合菌。
5.如权利要求4所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜的制备方法，其特征在于在制备氧传感膜时可将四甲氧基硅烷和二甲基二甲氧基硅烷按体积比1∶1.5～2.0的比例量取于开口瓶中，加入0.8～1.2ml0.001g/L溶有[Ru(dpp)3]2+的四氢呋喃溶液，旋涡振荡0.8～1.5min后，再逐滴振荡加入0.01mol/L HCl调节体系的pH值为3～4，将瓶子60～80℃下敞口磁搅拌水浴加热2～3h；取以上所制得的凝胶液50～100μL，均匀涂布于事先经乙醇和硝酸处理的玻璃片上成膜，于烘箱中干燥12～24h后备用。
6.如权利要求5所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜的制备方法，其特征在于氧传感膜的制备可将四甲氧基硅烷和二甲基二甲氧基硅烷按体积比1∶1.8的比例量取于开口瓶中，加入适量浓度的[Ru(dpp)3]2+的四氢呋喃溶液，旋涡振荡1min后，再逐滴振荡加入0.01mol/L HCl调节体系的pH，将瓶子60℃下敞口磁搅拌水浴加热3h。取以上所制得的凝胶液60μL，均匀涂布于事先经乙醇和硝酸处理的玻璃片上成膜，于烘箱中干燥12h后备用。
7.如权利要求4所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器敏感膜的制备方法，其特征在于菌的固定按体积比1∶1～1.5量取四甲氧基硅烷和二甲基二甲氧基硅烷于开口瓶中，超声振荡均匀时逐滴加入0.01mol/L HCl作为催化剂，将瓶子在50～70℃下敞口磁搅拌水浴加热0.5～1.5h，将所得到的凝胶液冷却至室温后，与4％～6％PVA水溶液按体积比1∶1混合，再加入150～250μL的菌悬液，充分振荡均匀，在氧传感膜表面涂成均匀薄层，室温通风处干燥成膜。
8.光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器，其特征在于设有样品池、敏感膜、发光二极管和光纤，敏感膜和发光二极管置于样品池内，发光二极管的激发光直接照射在敏感膜的菌膜上，样品池上设有光窗，光纤的一端接光窗，光纤的另一端外接测量装置。
9.如权利要求8所述的光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器，其特征在于所说的敏感膜的菌膜为混菌膜。
10.光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器用于海水BOD值的测定方法，其特征在于其步骤为1)在光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器的样品池中加入GGA标准溶液；2)发光二极管的光束直接照射在样品池中的菌膜上，响应后产生的荧光信号通过光纤传导进入光电倍增管；3)由光电倍增管输出的电流信号经微光测量仪转化为电压信号，再由色谱工作站转换为数字信号，再记录、分析和处理。
全文摘要
光纤光化学生化需氧量微生物膜动力学响应传感器，涉及一种微生物传感器。传感器敏感膜设由透明片、氧传感膜和菌膜，氧传感膜设于透明片上，菌膜固定在氧传感膜上。制备时在透明片上制备氧传感膜；氧传感膜表面固定混合菌。传感器设样品池、敏感膜、发光二极管和光纤，二极管照在菌膜上，样品池设光窗，光纤一端接光窗。测海水BOD值时，加GGA标准溶液；二极管照在菌膜上，响应后信号由光纤进入光电倍增管，再经微光测量仪转为电压信号。比微生物膜电极法更适合于实时、快速、在线监测；无需搅拌，更适应在线监测；重现性好，稳定性佳，周期短，从一次进样到下次进样的时间小于30min；可根据水质的不同选择单一菌种或混菌，可对海水进行快速BOD分析。
文档编号G01N21/64GK1584554SQ200410045500
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月24日 优先权日2004年5月24日
发明者陈曦, 林玲, 肖来龙 申请人:厦门大学