专利名称：检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的改进技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器构建的改进技 术。细菌为大肠杆菌。该技术用于改进生物传感器信号强度不足及提高传感器的灵敏度。
背景技术：
近年来，随着工业化和农业现代化进程的加快，大量使用合成物质和化学农药 等产品，人类不断向环境中排放大量污染物物质，这些都使人类的健康乃至生命受到威 胁。甲苯类有机物的广泛使用，已经严重污染环境。甲苯类的有机物已经被列为污染水 体，土壤的黑名单，必须进行检测控制。
监测和检测污染物主要有两种方法一是物理化学分析法。其准确度和灵敏度 都很高，但需要成套昂贵的精密分析仪器和专业化实验室，并且这种方法在一些污染物 检测中无法实现on-site检测。另一种方法是直接利用生物体对特定污染物的响应进行检 测，也就是近几年内引起关注的全细胞生物监测。但是目前构建生物传感器存在信号强 度表较差，灵敏度不够严重制约了微生物传感器的应用。本发的细胞传感器构建的改进 技术明显提高了发明内容
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的改进技术提出了一种可以 效改进微生物细胞传感器的信号强度以及灵敏度的方法。
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的改进技术是在利用恶臭假 单胞菌中的能够特异的降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因与商业化质 粒中信号强度高的Luc报告基因一起构建出的一种有效检测甲苯类有机污染物的微生物 细胞传感器的基础上利用T7噬菌体GlO蛋白的前导序列，包括SD序列以及增强子序列 来改进细胞传感器信号强度弱，灵敏度低等问题。
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的具体操作步骤为
1、扩增载体片断
首先利用DELNot-Spe I引物以商业化质粒pEGMluc为模板扩增得到线性 化片断，DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATG CACTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下游GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分别用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
2、扩增终止子片断；
禾Ij用 下 列 弓 I 物 R R N B Spe 1:5 ‘ ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3 ‘ RRNB NOT 1:5' ATTAGCGGCCGC GAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3 ‘以大肠杆菌基因组为模版进行扩增得到RRNB终止子序列片断，利用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
3、终止子载体重组质粒构建
将上述两步构建好的片断按照摩尔比为一比三的比例混合后利用T4连接酶在 16°C下进行连接；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重组质粒一；
4、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调 控蛋白基因将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为ATCC 33015) 接种于#1271Broth 苯甲酸钠培养基25mL中，30°C振荡培养M至48小时。当细菌 生长达到对数生长期中期时，分别利用引物Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAA AGCGCGATGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT XylR-Luc Sac I GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基 因的调控序列以及调控蛋白基因；
5、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构 建；利用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化；利用相应的酶酶切重 组质粒一中；连入启动子Pu的质粒命名为质粒二；在质粒二的基础上连入调控蛋白基因 XylR命名为质粒三；
6、得到检测甲苯类有机污染物的基本型微生物细胞传感器
利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污 染物的微生物细胞传感器；
7、检测甲苯类有机污染物的基本型微生物细胞传感器的改进技术
提取上述质粒三，利用BamH I与Xho I酶切上述质粒，舍弃Luc片段回收剩余 的大片断作为载体片段；
8、含有T7噬菌体SD序列以及增强子的Luc基因片段获得
利用引物 EHSDIUC ACTGGGATCCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG GAAGACGCCAAAAACATAAAG 以及引物 Lucthreeterminator CGATCTCGAGCTATCA TTACAATTTGGACTTTCCGCCC以商业化质粒pEGMluc为模版进行PCR扩增获得含有T7噬菌体SD序列以及增强子的Luc基因片段。利用BamH I与Xho I酶切上述片段，并 回收纯化；
9、增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器重组质粒的构建
将第七步与第八步获得的片段按照摩尔比为一比三的比例混合，用W连接酶16 度连接；
10、获得增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
将上述连接液转化至商业化宿主大肠杆菌DH5 α中，利用氨苄青霉素进行筛 选；经过验证程序，获得增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器。
以下通过具体实事例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发 明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1 :第一步接种单菌落(载体细胞空白同时接种)于50ml三角瓶中； 氨苄青霉素终浓度为ΙΟΟμ g/ml ； 37°C过夜培养
第二步5ml的LB培养基加入设定浓度的诱导物(如二甲苯浓度500 μ m)；
第三步菌体培养至OD6OO = 1.2 ；
第四步稀释到OD600 = 0.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培 养液中；M度诱导；
第五步对于细菌，将40 μ 1未转化细胞(载体细胞)与50 μ 1转化的培养物混 合。(细胞浓度相同)加入10 μ 1 IM IC2HPO4 (ρΗ 7.8)，20mM EDTA (—个溶液)。用-70 度冰箱快速冷冻混合物(冻融)(IOmin)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23°C 或置于室温下平衡30分钟)。加入300 μ 1新鲜配制的裂解混合物(见附录)。混合并于 室温孵育10分钟；
第五步检测；每个九十六空板中加入20 μ 1的裂解液后，加入100 μ 1荧光素 酶检测液，立刻检测；
第六步数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即 为每毫升菌液对应的数值了；对甲苯的最低检测浓度为20微摩尔/升，最高浓度为1000微摩尔/升。
10毫升裂解混合物配方
5.5ml 水
2ml 5 X CCLR
加入25mg BSA
2.5ml 溶菌酶混合液(配 5ml 配方0.5ml IM K2HPO4 (PH 7.8)，20mM EDTA+4.5ml无菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均勻。
权利要求
1.一种微生物传感器改进技术，由大肠杆菌作基本材料，通过基因工程手段构建用 来改进检测甲苯类有机污染物的细胞传感器。
2.根据权利要求1所述的微生生物传感器改进技术，其特征在于材料为商业化质 粒 pEGMluc ；
3.根据权利要求1所述的微生生物传感器改进技术，其特征在于基因来源为商业 化菌株恶臭假单胞菌；
4.根据权利要求1所述的微生生物传感器改进技术，其特征在于增强子以及SD序 列来源为T7噬菌体基因组；
5.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器改进技术，其制备方法a、扩增载体片断首先利用DELNot-Spe I引物以商业化质粒pEGMluc为模板扩增得到线性化片 断，DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCA CTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下游GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分别用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；b、扩增终止子片断；利用下列引物 RRNB Spe I 5 ‘ ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3' RRNB NOT 1:5' ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3‘以大肠杆菌基因组为模版进行扩增得到RRNB终止子序列片断，利用Not I与Spe I进行酶切处 理，并进行纯化处理；C、终止子载体重组质粒构建将上述两步构建好的片断按照摩尔比为一比三的比例混合后利用T4连接酶在16°C下 进行连接；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重组质粒一；d、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋 白基因将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为ATCC 33015)接种 于#1271Broth:苯甲酸钠培养基25mL中，30°C振荡培养24至48小时。当细菌生长达到 对数生长期中期时，分别利用引物Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGA TGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ； XylR-Luc Sac I GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以 及调控蛋白基因；e、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构建；利 用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化；利用相应的酶酶切重组质粒 一中；连入启动子Pu的质粒命名为质粒二；在质粒二的基础上连入调控蛋白基因XylR 命名为质粒三；f、得到检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污染物 的微生物细胞传感器g、检测甲苯类有机污染物的基本型微生物细胞传感器的改进技术提取上述质粒三，利用BamH I与Xho I酶切上述质粒，舍弃Luc片段回收剩余的大片断作为载体片段；h、含有T7噬菌体SD序列以及增强子的Luc基因片段获得利 用引物 EHSDIuc ACTGGGATCCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGAA GACGCCAAAAACATAAAG 以及引物 Lucthreeterminator CGATCTCGAGCTATCATTAC AATTTGGACTTTCCGCCC以商业化质粒pEGMluc为模版进行PCR扩增获得含有T7噬菌体SD序列以及增强子的Luc基因片段。利用BamH I与Xho I酶切上述片段，并回收 纯化；i、增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器重组质粒的构建将第七步与第八步获得的片段按照摩尔比为一比三的比例混合，用T4连接酶16°C连接；j、获得增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 将上述连接液转化至商业化宿主大肠杆菌DH5 α中，利用氨苄青霉素进行筛选；经 过验证程序，获得增强型的检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器。k接种单菌落(载体细胞空白同时接种)于50ml三角瓶中；氨苄青霉素终浓度为 100ug/ml ； 37 °C 过夜培养.1 5ml的LB培养基加入设定浓度的诱导物(如二甲苯浓度500 μ Μ)； m 菌体培养至OD600 = 1.2 ；η稀释到OD600 = 0.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培养液中； 23°C诱导；O 对于细菌，将40 μ 1未转化细胞(载体细胞)与50 μ 1转化的培养物混合。(细 胞浓度相同)加入10 μ 1 IM K2HPO4 (ρΗ 7.8)，20mM EDTA ( 一个溶液)。用_70°C冰箱 快速冷冻混合物(冻融)(IOmin)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23°C或置于 室温下平衡30分钟)。加入300 μ 1新鲜配制的裂解混合物(见附录)。混合并于室温孵 育10分钟；P 检测；每个九十六空板中加入20 μ 1的裂解液后，加入100 μ 1荧光素酶检测液， 立刻检测；q数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即为每毫升菌 液对应的数值了；
6.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器改进技术的制备方法，其特征在于所 述LB养基为25mL，振荡培养的温度为37°C，酶切在37°C条件下进行；
7.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器改进技术的制备方法，其特征在于从 美国普通微生物菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为ATCC33015)在含有苯 甲酸钠的培养基中经诱导，促进其甲苯类有机物降解基因表达。
8.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器改进技术的制备方法，其特征在于微 生物传感器培养温度为37°C，微生物传感器诱导温度为23°C，检测数据采集利用发光检 测仪检测。
全文摘要
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器改进技术及其检测方法涉及一种基于利用恶臭假单胞菌降解基因的调控序列及调控蛋白基因跟商业化报告基因质粒序列而构建检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器进行改进创新的技术。细菌宿主为大肠杆菌，使用于甲苯类有机物的检测。对甲苯的最低检测浓度为20微摩尔/升，最高浓度为1000微摩尔/升。信号强度相对于基本型号提高60倍。
文档编号C12Q1/02GK102021220SQ20091009324
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者于清, 呼庆, 庄国强 申请人:中国科学院生态环境研究中心