专利名称：伤寒Vi－rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法。
背景技术：
伤寒是发展中国家共同关注的一个重要公共卫生课题，特别在学龄儿童中发病比较集中，更引起人们的重视。据估计全球每年的发病数为33,000,000，死亡数为500,000[1]。在大多数发展中国家，生活条件和习惯的提高和改变是一比较缓慢的过程，疫苗无疑是控制伤寒传染的最有效手段。已有多种疫苗由于预防该疾病的发生，其中全菌体疫苗的效果已得到肯定，但存在如局部红肿，疼痛、发烧等问题；口服伤寒活疫苗的效果有待进一步评价。
1934年Felix和Pitt发现了伤寒菌的毒力抗原(Virulence antigen，简称Vi抗原)，现在已知Vi抗原是一种存在于细菌细胞壁外的荚膜多糖抗原，由O-乙酰-氨己糖醛酸高度聚合而成。Robbins[2]等认为Vi抗原是一种保护性抗原，用0.5-1.0μg纯化的Vi抗原免疫小鼠，对Vi+菌株攻击，可提供高度保护作用。冷酚法提取细菌荚膜多糖制造的伤寒Vi多糖疫苗为预防伤寒提供了一个简单、安全的手段[3，4]，该疫苗在5岁以上人群中可提供＞70％的保护。但Vi多糖是一种非胸腺依赖型抗原(TI)，其免疫原性与年龄有关，且重复接种后无加强免疫性，所以单纯Vi多糖疫苗在5岁以下儿童中使用效果并不理想，从而部分限制了该疫苗的使用。以化学方法将蛋白载体结合到多糖上后可使之成为胸腺依赖型抗原(TD)，从而具有加强免疫应答和在低年龄儿童中提供保护的性质。
美国NIH的Szu[6]等先后开展了Vi-蛋白结合疫苗研究，证明结合疫苗免疫小鼠后产生的抗体都比单独使用Vi抗原免疫效价高。他们研制的Vi-rEPA(重组绿脓杆菌毒素)结合疫苗在越南现场2～5岁儿童中的保护率达91.4％。
但目前尚无人研究出伤寒Vi结合疫苗中的高分子结合物含量的测定方法，而判断结合疫苗中的高分子结合物的含量却对该疫苗的效价的评估有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法。该方法可简单、准确、快速测定疫苗中高分子结合物的含量。
本发明的目的可通过如下措施来实现一种伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法，包括下述步骤a、取待测伤寒Vi-rEPA结合疫苗作为样1，然后按体积比(2-3)∶1加入无水乙醇；混匀后再按与伤寒Vi-rEPA结合疫苗的体积比的(9-11)∶1加入氯化钙溶液，混匀后于室温放置50-80分钟；再在6500rpm下离心20-40分钟；将上清弃去；b、在上述步骤a中离心后的沉淀管中加入40-60μl的盐酸溶解沉淀物，并放置20-30分钟；然后再在沉淀管中加入与样1体积相同的水，混匀后以作沉淀物的高分子结合物的测定样2；c、用O-乙酰基法分别测定样1、样2的吸光值A1、A2；d、根据公式(A2×2.05)/A1×100％计算出伤寒Vi-rEPA结合疫苗中所含的高分子结合物的含量。
所述的伤寒Vi-rEPA结合疫苗是由纯化的伤寒沙门氏菌Vi多糖与基因脱毒的绿脓杆菌外毒素A共价结合而成。
具体实施例方式
本发明利用结合疫苗的特性在乙醇存在下，结合状态的Vi多糖变性沉降，而游离态的Vi多糖不变性，离心后在上清中。测定沉淀中的多糖含量，计算沉淀中的多糖比例。具体的实施方式如下伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法，包括下述步骤a、取待测伤寒Vi-rEPA结合疫苗作为样1，然后按体积比2.5∶1加入无水乙醇；混匀后再按与伤寒Vi-rEPA结合疫苗的体积比的10∶1加入氯化钙溶液，混匀后于室温放置60分钟；再在6500rpm下离心30分钟；将上清弃去；b、在上述步骤a中离心后的沉淀管中加入50μl的1.0mol/L盐酸溶解沉淀物，并放置25分钟；然后再在沉淀管中加入与样1体积相同的水，混匀后以作沉淀物的高分子结合物的测定样2；c、用O-乙酰基法分别测定样1、样2的吸光值A1、A2；d、根据公式(A2×2.05)/A1×100％计算出伤寒Vi-rEPA结合疫苗中所含的高分子结合物的含量。
其中伤寒Vi-rEPA结合疫苗是由纯化的伤寒沙门氏菌Vi多糖与基因脱毒的绿脓杆菌外毒素A共价结合而成。为无色透明或微带乳光的液体，含防腐剂，不含异物或凝块。
权利要求
1.一种伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法，包括下述步骤a、取待测伤寒Vi-rEPA结合疫苗作为样1，然后按体积比(2-3)∶1加入无水乙醇；混匀后再按与伤寒Vi-rEPA结合疫苗的体积比的(9-11)∶1加入氯化钙溶液，混匀后于室温放置50-80分钟；再在6500rpm下离心20-40分钟；将上清弃去；b、在上述步骤a中离心后的沉淀管中加入40-60μl的盐酸溶解沉淀物，并放置20-30分钟；然后再在沉淀管中加入与样1体积相同的水，混匀后以作沉淀物的高分子结合物的测定样2；c、用O-乙酰基法分别测定样1、样2的吸光值A1、A2；d、根据公式(A2×2.05)/A1×100％计算出伤寒Vi-rEPA结合疫苗中所含的高分子结合物的含量。
2.如权利要求1所述的伤寒Vi-rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法，其特征在于所述的伤寒Vi-rEPA结合疫苗是由纯化的伤寒沙门氏菌Vi多糖与基因脱毒的绿脓杆菌外毒素A共价结合而成。
全文摘要
本发明涉及一种伤寒Vi－rEPA结合疫苗中高分子结合物含量的测定方法，该方法是将待测伤寒Vi－rEPA结合疫苗作为样1，然后再在样1中加入无水乙醇和氯化钙，然后离心去上清液而取沉淀；用盐酸溶解沉淀物并加水得到沉淀物的高分子结合物的测定样2；然后分别测定样1、样2的吸光值并利用公式计算出伤寒Vi－rEPA结合疫苗中所含的高分子结合物的含量；本发明的方法可简单、准确、快速地计算出结合疫苗中所含的高分子结合物的含量，利用该方法可评估结合疫苗的效价。
文档编号G01N21/31GK1645104SQ20041007353
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月21日 优先权日2004年12月21日
发明者谭小梅, 杜琳 申请人:兰州生物制品研究所