专利名称：免疫层析测试条及其制造方法
技术领域：
本发明涉及了一种免疫层析测试条及其制造方法，特别是涉及了能够快速检测孕激素、雌激素及小分子激素的测试条及其制造方法。
背景技术：
目前，人们的生活水平逐渐提高，保健意识逐渐加强，很多营养品和补品蕴育而生，使人们的健康日益加强寿命普遍提高，但是同时也带来不少的负作用，例如更年期妇女所服用的雌激素，如果服用量小起不到作用，如果服用量大会引起妇科系统的癌变，而现在检测雌性激素或小分子激素需要通过很复杂的医学检测过程，并且不可能进行随时检测，广大的妇女在不考虑后果的情况下，盲目补充雌性激素，会使身体受到了更大的伤害。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种可以方便、随时检测出小分子激素的免疫层析测试条及其制造方法。
为了实现这一发明目的，本发明提供了一种免疫层析测试条，它包括支撑物、吸水纤维膜、硝酸纤维膜、样品膜、防水膜和胶体金标记膜，其中硝酸纤维膜粘附在条形支撑物的中段，吸水纤维膜粘附在支撑物的顶端，吸水纤维膜的下端与硝酸纤维膜的上端搭接，胶体金标记膜、防水膜和样品膜依次粘附在从支撑物的末端到硝酸纤维膜之间支撑物上，并且胶体金标记膜的一端与防水膜搭接，防水膜的一端与样品膜搭接，样品膜的一端与硝酸纤维膜搭接，其中胶体金标记膜一端与防水膜的搭接长度大于防水膜粘附在支撑物上的长度，所述的硝酸纤维膜上至少包含一种浓度的与所检测的抗原所对应的抗体和一种抗免疫蛋白IgG的抗体，胶体金标记膜上包含用胶体金标记的、所检测的抗原和用胶体金标记的免疫蛋白IgG。
本发明提供了一种免疫层析测试条，其中所述的硝酸纤维膜上包括三种不同浓度的与所检测的抗原所对应的抗体。
本发明提供了一种免疫层析测试条，其中所述的三种浓度的与所检测的抗原所对应的抗体和一种抗免疫蛋白IgG的抗体从位于样品膜端向吸水膜端沿纵向均匀分布，每种抗体的喷涂高度为1-3毫米，四种抗体之间的间隔为2-3毫米。
本发明提供了一种免疫层析测试条，其中所述的样品膜和胶体金标记膜为玻璃纤维膜。
本发明提供了一种免疫层析测试条，其中所述的检测抗原是小分子抗原。
本发明提供了一种免疫层析测试条，其中所述的小抗原分子抗原为孕激素抗原或雌激素抗原。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中它包括将硝酸纤维膜粘附在条形支撑物的中段上，将吸水纤维膜粘附在支撑物的顶端，吸水纤维膜的下端与硝酸纤维膜的上端搭接，将胶体金标记膜、防水膜和样品膜依次粘附在从支撑物的末端到硝酸纤维膜之间的支撑物上，并且胶体金标记膜的一端与防水膜搭接，防水膜的一端与样品膜搭接，样品膜的一端与硝酸纤维膜搭接，其中胶体金标记膜一端与防水膜的搭接长度大于防水膜粘附在支撑物上的长度，所述的硝酸纤维膜上至少涂覆一种浓度的与所检测的抗原所对应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，胶体金标记膜是在玻璃纤维膜上涂覆用胶体金标记的所检测的抗原溶液和用胶体金标记的免疫蛋白溶液。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中在所述的硝酸纤维膜不同部位上分别喷涂三种不同剂量的与胶体金标记抗原反应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，所述的不同部位是每种抗体从靠近样品膜端到靠近吸水纤维膜端依次喷涂成呈线状，三种不同剂量的与胶体金标记抗原反应的抗体依次为检测线1、2、3，一种抗免疫蛋白抗体为对照线，抗体的四种剂量分别为0.3-0.6微克，1.0-1.7微克，2.6-3.9微克和4.4-5.6微克，每条线的喷涂高度约1毫米宽3毫米长，对照线位于距硝酸纤维素膜和吸水纤维膜连接处3-6毫米，各线间隔2～3毫米的距离，喷涂过后的硝酸纤维素膜经晾干后，用40克/升-60克/升的白蛋白溶液浸泡封闭1-3小时，再用0.008-0.013摩尔的生理溶液洗涤2-4次，干燥后密封保存。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中将20-60微升的用胶体金标记的抗原溶液和20-60微升的用胶体金标记的免疫蛋白溶液混合后加在玻璃纤维膜上，在室温或温度为3-6℃下干燥，制成胶体金标记膜。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中所述的用胶体金标记的抗原溶液的制造步骤如下1.先用微量的0.08-012mol/L醋酸盐溶液将胶体金溶液调节至酸碱度为8.2-8.6；2.然后在80-120毫升胶体金溶液中加入300-500ug的所要检测抗原的蛋白质溶液中，在室温下搅拌10-15分钟；3.再加入4-10毫升的0.8-1.3％聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合；
6.重复用10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合后，加入30-70毫克的叠氮钠，混合后已达防腐目的，置温度为3-6℃保存。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中所述的用胶体金标记的免疫蛋白溶液的制造步骤如下1.先用微量的0.08-012mol/L醋酸盐溶液将胶体金溶液调节至酸碱度7.8-8.2；2.然后在80-120毫升胶体金溶液中加入300-500ug免疫蛋白IgG溶液中，在室温下搅拌10-15分钟；3.再加入4-10毫升的0.8-1.2％聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合；6.重复用10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合后，加入30-70毫克的叠氮钠，混合后已达防腐目的，置温度为3-6℃保存。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中所述的聚乙二醇的分子量为20000；所述的醋酸盐为醋酸钾或醋酸钠；蛋白溶液为白蛋白溶液或者鲎血清蛋白。
本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中所述胶体金溶液的制备采用还原法；其步骤如下(a).首先将玻璃容器浸泡于3％-10％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中30秒至1分钟，室温干燥后用蒸馏水冲洗，再干燥备用；(b).取80-120毫升的0.08％-0.12％氯金酸水溶液加入事先干燥处理过的玻璃容器内加热至沸，然后边搅动边加入0.5-0.9毫升的0.8％-1.2％还原剂水溶液，此混合液金在2分钟内便由黄色溶液变为紫红色溶液，继续煮沸10-20分钟，冷却后加入蒸馏水使溶液的体积恢复到80-120毫升，完成胶体金的制备；本发明提供了一种制造免疫层析测试条的方法，其中所述的还原剂为柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷或硼氢化钠。
本发明与现有技术相比，本发明由于利用胶体金标记技术和定量免疫竞争法制造出快速检测的测试条，能够快速准确检测出人体内的微量激素，用本发明的测试条进行检测的快速检测法具有高度的特异性和灵敏度，还具有稳定性好、重复性强，不使用特殊仪器，费用低廉，操作简便易学，短时间就能判读出结果，以利于人们随时检测自身的激素水平。
图1为本发明的免疫层析测试条的侧向示意图。
具体实施例方式
参见图1，本发明的免疫层析测试条包括支撑物1、吸水纤维膜2、硝酸纤维膜3、样品膜4、防水膜5和胶体金标记膜6，硝酸纤维膜3粘附在条形支撑物1的中段，吸水纤维膜粘附在支撑物1的顶端，吸水纤维膜2的下端与硝酸纤维膜3的上端搭接，胶体金标记膜6、防水膜5和样品膜4依次粘附在从支撑物1的末端到硝酸纤维膜3之间支撑物1上，并且胶体金标记膜6的一端与防水膜5搭接，防水膜5的一端与样品膜4搭接，样品膜4的一端与硝酸纤维膜3搭接，其中胶体金标记膜6一端与防水膜5的搭接长度大于防水膜5粘附在支撑物1上的长度，所述的硝酸纤维膜2上包括三种不同浓度的与检测抗原(如孕激素抗原或雌激素抗原)对应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，所述的四种的抗体从位于样品膜4端向吸水膜2端沿纵向均匀分布，每种抗体的喷涂高度为1-3毫米，四种抗体之间的间隔为2-3毫米，胶体金标记膜6上包含用胶体金标记的、所检测的抗原和用胶体金标记的免疫蛋白IgG，所述的样品膜4和胶体金标记膜6为玻璃纤维膜，所述的检测抗原是小分子抗原，如孕激素抗原或雌激素抗原。
免疫层析测试条的制备方法包括硝酸纤维膜2的制备方法和胶体金标记膜6的制备方法，其中胶体金膜6的制备方法是将用胶体金标记的抗原溶液和用胶体金标记的免疫蛋白溶液混合后加在玻璃纤维膜上，干燥后制成胶体金标记膜。
胶体金标记膜6的制备(一)胶体金溶液的制备其具体步骤如下(a).首先将玻璃容器浸泡于6％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟，室温干燥后用蒸馏水冲洗，再干燥备用；(b).取90毫升的0.09％氯金酸水溶液加入事先干燥处理过的玻璃容器内加热至沸，然后边搅动边加入0.6毫升的0.9％柠檬酸钠水溶液，此混合液金在2分钟内便由黄色溶液变为紫红色溶液，继续煮沸15分钟，冷却后加入蒸馏水使溶液的体积恢复到90毫升，完成胶体金的制备。
(二)胶体金标记的抗原溶液的制备1.先用微量的0.09mol/L醋酸钾溶液将上述胶体金溶液调节至酸碱度8.3；2.然后在100毫升胶体金溶液中加入350ug的所要检测抗原的白蛋白质溶液中，在室温下搅拌12分钟；3.再加入7毫升的1％分子量为20000聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用25分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和90毫升的0.4mg/ml分子量为20000聚乙二醇的缓冲液混合；6.重复用10000～100000克离心力作用25分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和90毫升的0.4mg/ml分子量为20000聚乙二醇的缓冲液混合后，加入45毫克的叠氮钠，混合后已达防腐目的，置温度为5℃保存。
(三)胶体金标记的免疫蛋白溶液的制备1.先用微量的0.11mol/L醋酸盐溶液将上述胶体金溶液调节至酸碱度7.9；2.然后在100毫升胶体金溶液中加入350ug免疫蛋白IgG溶液，在室温下搅拌14分钟；3.再加入5毫升的1％分子量为20000聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用25分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和100毫升的0.4mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合；6.重复用10000～100000克离心力作用25分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和100毫升的0.4mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合后，加入50毫克的叠氮钠，混合后已达防腐目的，置温度为4℃保存。
(四)胶体金标记膜的制备将50微升的上述胶体金标记的抗原溶液和50微升的上述胶体金标记的免疫蛋白溶液混合后加在玻璃纤维膜上，在室温或温度为4-5℃下干燥，制成胶体金标记膜。
硝酸纤维膜的制备在所述的硝酸纤维膜2不同部位上分别喷涂三种不同剂量的与胶体金标记抗原反应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，它们依次为喷涂三种与胶体金标记抗原反应的抗体即检测线1、2、3和一种抗免疫蛋白抗体即对照线，所述的不同部位是每种抗体从靠近样品膜4端到靠近吸水纤维膜2端依次喷涂的呈线状，抗体的四种剂量分别为0.4微克，1.2微克，3.0微克和4.8微克，每条线的喷涂高度约1毫米宽3毫米长，对照线位于距硝酸纤维素膜和吸水纤维膜连接处5毫米，各线间隔2～3毫米的距离，喷涂过后的硝酸纤维素膜3经晾干后，用50克/升的白蛋白溶液浸泡封闭2小时，再用0.01摩尔的生理溶液洗涤3次，干燥后密封保存。
免疫层析测试条的制备方法免疫层析测试条是将硝酸纤维膜3粘附在条形支撑物1的中段上，将吸水纤维膜粘附在支撑物1的顶端，吸水纤维膜2的下端与上述硝酸纤维膜3的上端搭接，将上述胶体金标记膜6、防水膜5和样品膜4依次粘附在从支撑物1的末端到硝酸纤维膜3之间支撑物1上，并且胶体金标记膜6的一端与防水膜5搭接，防水膜5的一端与样品膜4搭接，样品膜4的一端与硝酸纤维膜3搭接，其中胶体金标记膜6一端与防水膜5的搭接长度大于防水膜5粘附在支撑物1上的长度，制成免疫层析测试条。
免疫层析测试条的使用方法下面以检测雌激素进行说明1. 0.1-0.5毫升唾液或尿液加于样品膜4上，等1分钟；2.将位于样品膜和胶体金标记膜之间的防水膜5去除；3.将0.1毫升水加于含有胶体金标记膜6上，等2分钟；4.观察测试条硝酸纤维素膜3上的变化，检测线出现一条红色条带表示雌激素为400pg.两条红色条带为200pg，三条红色条带为50pg/ml.四条红色条带为雌激素水平低于50pg/ml.没有红色条带出现则视为雌激素水平高于400pg/ml.在测试条正常情况下，对照线应该显示红色条带。
免疫层析测试条的工作原理将含有雌激素的唾液或尿液加入样品膜上，唾液或尿液在吸水膜2的作用下，吸入到硝酸纤维膜3上，与硝酸纤维膜3上的1、2或3检测线上的抗原结合，1分钟后，使用者将防水膜撕掉，将0.1毫升水加于含有胶体金标记膜上，水使得胶体金标记膜6与样品膜4紧紧地贴在一起，使得胶体金标记膜6上的用胶体金标记的雌激素抗原和用胶体金标记的免疫蛋白在在吸水膜2的作用下，吸入到硝酸纤维膜3上，用胶体金标记的雌激素抗原与硝酸纤维膜上的未完全被唾液或尿液中的雌激素中和的抗体反应显色，用胶体金标记的免疫蛋白与硝酸纤维膜上的抗免蛋白抗体(即对照线)结合后显色，使用胶体金标记免疫蛋白的目的是为了提示使用者可以通过硝酸纤维膜3上的对照线显色与否来判定，测试条是否失效，从观察硝酸纤维膜3的显色情况可以看出唾液或尿液中含有的雌激素越多，检测线显色的条数越少，所以可以对唾液或尿液中的雌激素进行半定量的检测。
上述实施例只是为了使公众进一步理解本发明，而作的描述，不是对本发明的限定。
权利要求
1.一种免疫层析测试条，它包括支撑物(1)、吸水纤维膜(2)、硝酸纤维膜(3)、样品膜(4)、防水膜(5)和胶体金标记膜(6)，其特征在于硝酸纤维膜(3)粘附在条形支撑物(1)的中段，吸水纤维膜粘附在支撑物(1)的顶端，吸水纤维膜(2)的下端与硝酸纤维膜(3)的上端搭接，胶体金标记膜(6)、防水膜(5)和样品膜(4)依次粘附在从支撑物(1)的末端到硝酸纤维膜(3)之间支撑物(1)上，并且胶体金标记膜(6)的一端与防水膜(5)搭接，防水膜(5)的一端与样品膜(4)搭接，样品膜(4)的一端与硝酸纤维膜(3)搭接，其中胶体金标记膜(6)一端与防水膜(5)的搭接长度大于防水膜(5)粘附在支撑物(1)上的长度，所述的硝酸纤维膜(2)上至少包含一种浓度的与所检测的抗原所对应的抗体和一种抗免疫蛋白IgG的抗体，胶体金标记膜(6)上包含用胶体金标记的、所检测的抗原和用胶体金标记的免疫蛋白IgG。
2.如权利要求1所述免疫层析测试条，其特征在于所述的硝酸纤维膜(2)上包括三种不同浓度的与所检测的抗原所对应的抗体。
3.如权利要求2所述的免疫层析测试条，其特征在于所述的三种浓度的与所检测抗原对应的抗体和一种抗免疫蛋白IgG的抗体从位于样品膜(4)端向吸水膜(2)端沿纵向均匀分布，每种抗体的喷涂高度为1-3毫米，四种抗体之间的间隔为2-3毫米。
4.如权利要求3所述免疫层析测试条，其特征在于所述的样品膜(4)和胶体金标记膜(6)为玻璃纤维膜。
5.如权利要求1至4之一所述的免疫层析测试条，其特征在于所述的检测抗原是小分子抗原。
6.如权利要求5所述的免疫层析测试条，其特征在于所述的小抗原分子抗原为孕激素抗原或雌激素抗原。
7.一种制造免疫层析测试条的方法，其特征在于它包括将硝酸纤维膜(3)粘附在条形支撑物(1)的中段上，将吸水纤维膜粘附在支撑物(1)的顶端，吸水纤维膜(2)的下端与硝酸纤维膜(3)的上端搭接，将胶体金标记膜(6)、防水膜(5)和样品膜(4)依次粘附在从支撑物(1)的末端到硝酸纤维膜(3)之间支撑物(1)上，并且胶体金标记膜(6)的一端与防水膜(5)搭接，防水膜(5)的一端与样品膜(4)搭接，样品膜(4)的一端与硝酸纤维膜(3)搭接，其中胶体金标记膜(6)一端与防水膜(5)的搭接长度大于防水膜(5)粘附在支撑物(1)上的长度，所述的硝酸纤维膜(2)上至少涂覆一种浓度的与所检测的抗原所对应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，胶体金标记膜(6)是在玻璃纤维膜上涂覆标有胶体金标记的所检测的抗原溶液和用胶体金标记的免疫蛋白溶液。
8.如权利要求7所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于在所述的硝酸纤维膜(2)不同部位上分别喷涂三种不同剂量的与胶体金标记抗原反应的抗体和一种抗免疫蛋白抗体，所述的不同部位是每种抗体从靠近样品膜(4)端到靠近吸水纤维膜(2)端依次喷涂成呈线状，三种不同剂量的与胶体金标记抗原反应的抗体依次为检测线1、2、3，一种抗免疫蛋白抗体为对照线，抗体的四种剂量分别为0.3-0.6微克，1.0-1.7微克，2.6-3.9微克和4.4-5.6微克，每条线的喷涂高度约1毫米宽3毫米长，对照线位于距硝酸纤维素膜和吸水纤维膜连接处3-6毫米，各线间隔2～3毫米的距离，喷涂过后的硝酸纤维素膜(3)经晾干后，用40克/升-60克/升的白蛋白溶液浸泡封闭1-3小时，再用0.008-0.013摩尔的生理溶液洗涤2-4次，干燥后密封保存。
9.如权利要求7或8所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于将20-60微升的用胶体金标记的抗原溶液和20-60微升的用胶体金标记的免疫蛋白溶液混合后加在玻璃纤维膜上，在室温或温度为3-6℃下干燥制成胶体金标记膜。
10.如权利要求9所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于所述的用胶体金标记的抗原溶液的制造步骤如下1.先用微量的0.08-012mol/L醋酸盐溶液将胶体金溶液调节至酸碱度8.2-8.6；2.然后在100毫升胶体金溶液中加入300-500ug的所要检测抗原的蛋白质溶液中，在室温下搅拌10-15分钟；3.再加入4-10毫升的0.8-1.3％聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合；6.重复用10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合后，加入30-70毫克的叠氮钠， 混合后已达防腐目的，置温度为3-6℃保存。
11.如权利要求9所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于所述的用胶体金标记的免疫蛋白溶液的制造步骤如下1.先用微量的0.08-012mol/L醋酸盐溶液将胶体金溶液调节至酸碱度7.8-8.2；2.然后在100毫升胶体金溶液中加入300-500ug免疫蛋白IgG溶液，在室温下搅拌10～15分钟；3.再加入4-10毫升的0.8-1.2％聚乙二醇溶液；4.经过10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；5.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合；6.重复用10000～100000克离心力作用20-40分钟，小心吸去上清液；7.将沉淀物再和80-120毫升的0.2～0.5mg/ml聚乙二醇的缓冲液混合后，加入30-70毫克的叠氮钠， 混合后已达防腐目的，置温度为3-6℃保存。
12.如权利要求10或11所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于所述的聚乙二醇的分子量为20000；所述的醋酸盐为醋酸钾或醋酸钠；所述的蛋白溶液为白蛋白溶液或者鲎血清蛋白。
13.如权利要求12所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于所述胶体金溶液的制备采用还原法；其步骤如下(a).首先将玻璃容器浸泡于3％-10％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中30秒至1分钟，室温干燥后用蒸馏水冲洗，再干燥备用；(b).取80-120毫升的0.08％-0.12％氯金酸水溶液加入事先干燥处理过的玻璃容器内加热至沸，然后边搅动边加入0.5-0.9毫升的0.8％-1.2％还原剂水溶液，此混合液金在2分钟内便由黄色溶液变为紫红色溶液，继续煮沸10-20分钟，冷却后加入蒸馏水使溶液的体积恢复到80-120毫升，完成胶体金的制备。
14.如权利要求13所述的免疫层析测试条的制造方法，其特征在于所述的还原剂为柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷或硼氢化钠。
全文摘要
本发明涉及了一种免疫层析测试条及其制造方法，免疫层析测试条包括支撑物(1)、吸水纤维膜(2)、硝酸纤维膜(3)、样品膜(4)、防水膜(5)和胶体金标记膜(6)，本发明由于利用胶体金标记技术和定量免疫竞争法制造出快速检测的测试条，能够快速准确检测出人体内的微量激素，用本发明测试条进行的快速检测法具有高度的特异性和灵敏度，还具有稳定性好、重复性强，不使用特殊仪器，费用低廉，操作简便易学，短时间就能判读出结果，以利于人们随时检测自身的激素水平。
文档编号G01N33/558GK1746675SQ20041007452
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月7日 优先权日2004年9月7日
发明者李人, 杨立邦, 申勇 申请人:李人