专利名称：用于检测分析物的光纤装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于监测生理相关化合物浓度的装置。
背景技术：
监测体内生理相关化合物浓度以改进诊断和治疗各种疾病和障碍是理想的目标并能增强许多人员的生命。这个领域的进展说明在促使正确代谢控制糖尿病方面有具体的前景。当前，大多数糖尿病患者利用“扎手指”方法监测血液中的葡萄糖水平，但是病人的顺从是有问题的，因为频繁的扎手指给病人带来痛苦。所以，人们一直试图努力开发非侵入式或最小侵入式和更有效利用体外方法，可以频繁和/或连续监测血液或其他生物液体中的葡萄糖。
频繁和/或连续体内监测的方法可以分成两大类“非侵入式”和“最小侵入式”。通过直接跟踪皮肤和组织中的光谱变化，非侵入式监测方法可以确定分析物水平。红外辐射和无线电波阻抗光谱术是这种技术的例子。由于需要频繁的定标，可重复的样本照射，以及各个个体之间光谱背景的变化，这些方法的进展是缓慢的。“最小侵入式”方法可以避免直接从身体中抽取血液，并利用中间检测元件监测生物液体中的信号变化。利用与变换(检测)元件组合的生物识别元件，这种类型的生物传感器是能够提供定量或半定量分析信息的装置。
用于频繁或连续分析物监测的大多数常规系统涉及电流分析生物传感器，它采用诸如葡萄糖氧化酶(GOx)的酶，可以把酶氧化成葡萄醛酸和过氧化氢，从而产生点化学信号。由于氧的缺乏和氧化副产品的堆积，这种传感器的测量是不精确的。精确测量葡萄糖浓度需要大量的氧，这在人体血液或间隙液体中通常是不存在的。此外，电化学反应本身产生氧化副产品的堆积，这些氧化副产品可以抑制和退化酶及其保护层。
人们还开发了基于光信号而不是电化学信号的生物传感器，它们在稳定性和定标方面有重大的改进。例如，参照分析物有关光信号与另一个分析物独立信号可以校正传感器中的噪声源和不稳定性。然而，我们还没有实现用于体内分析物检测的光检测潜力。其中一个原因是，许多当前的光检测方法依靠酶化学，例如，葡萄糖氧化酶。在一个普通的方法中，氧敏荧光染料用于监测GOx酶反应的氧消耗。虽然这是一种光生物传感器，其荧光信号强度是随变化的氧水平而改变，但是基于相同的化学，这种传感器存在与电流分析装置相同的问题氧的缺乏和酶的退化。
为了克服与酶检测(例如，GOx)相关的挑战，不管是利用电化学或光学的非酶蛋白基光或荧光检测。标记刀豆球蛋白A和葡聚糖一直用于产生竞争的FRET测定；然而，这种系统要求收集两种成分，而测定的动态范围是受限制的。参阅Ballerstadt，R.，Schultz，J.S.；“Competitive-binding assay method based on fluorescencequenching of ligands held in close proximity by a multivalentreceptor”，Anal.Chem.Acta345(1-3)203-312(1997)。还参阅Russell R.J.，Pishko M.V.，Gefrides C.C.，McShane M.J.，Cote G.L.；“A fluorescence-based glucose biosensor using concanavalin A anddextran encapsulated in a poly(ethylene glycol)hydrogel”，Anal.Chem.71(15)3126-3132(1999)。
另一种蛋白基检测化学利用Escherichia Coli(E.coli)周质感受体，葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)产生荧光信号以响应葡萄糖结合，例如，参阅Tolosa L.I.，Gryczynski L.R.，Eichhorn J.D.，Dattelbaum F.N.，Castellano，G.Rao，and J.R.Lakowicz；“Glucosesensor for low-cost lifetime-based sensing using a geneticallyengineered protein”Anal.Biochem.267113-120(1999)；Hellinga H.W.and J.S.Marvin；“Protein engineering and the development ofgeneric biosensors”Trends Biotechnol 16183-189(1998)；Salins L.L.，R.A.Ware，C.M.Ensor and S.Daunert；“A Novel reagentless sensingsystem for measuring glucose based on the galactose/glucose-bindingprotein”Anal.Biochem.29419-26(2001)；和de Lorimier R.M.，J.J.Smith，M.A.Dwyer，L.L.Looger，K.M.Sali，C.D.Paavola，S.S.Rizk，S.Sadigov，D.W.Conrad，L.Loew，and H.W.Hellinga，“Construction of a fluorescent biosensor family”Protein Sci.112655-2675(2002)。在配体结合之后，GGBP经受基本的构型变化，俘获它的两个球形区之间的配体。例如，参阅Shilton B.H.，M.M.Flocco，M.Nilsson and S.L.Mowbray；“conformational changes ofthree periplasmic receptors for bacterial chemotaxis and transportthe maltose-，glucose/galactose-and ribose-binding proteins”J.Mol.Biol.264350-363(1996)。利用环境灵敏荧光基团专用位置标记蛋白，这个属性可用于产生荧光信号。例如，参阅Salins L.L.，R.A.Ware，C.M.Ensor and S.Daunert；“A novel reagentless sensing system formeasuring glucose based on the galactose/glucose-binding protein”，Anal.Biochem.29419-26(2001)。因为GGBP没有消耗葡萄糖，也没有产生反应产品，它可以用作无试剂的传感器。与电流分析生物传感器比较，这种传感器可以有更高的精确度和可靠性。
虽然不同群体已开发能够响应于生理范围内葡萄糖的GGBP突变，但是还没有报告基于结合蛋白技术的功能性生物传感器装置，这种装置适合于体内分析物监测。功能频繁和/或连续的生物传感器必须连接检测元件与光检测元件，与此同时保持传感器的完整性和功能性以及病人的舒服性。例如，最好是，生物识别元件和伴随的变换元件应当包含在生物兼容的材料内，它可以使检测元件与免疫系统隔离，允许分析物扩散进入和排出，并避免检测元件浸入病人的血液或其他的生物液体(例如，间隙液体)。由于结合蛋白要求能够有效使用的定向控制和构象自由度，许多物理吸收和随机或体共价表面粘附或固定策略通常是次最佳或不成功的，如在文献所描述。此外，必须设计可重复和/或可控的方式光询问样本的装置。
一种熟知的方法是连接检测元件到光纤的一端并连接诸如激励源或检测器的光学元件到光纤的另一端。然而，连接结合蛋白到光纤的一端受到以上描述的挑战，它需要保存蛋白的构象和/或定向移动性。此外，从病人使用的观点考虑，光纤光缆往往是不切实际的，因为病人可能需要定期去掉或替换传感器。替换整个光纤是昂贵和不方便的。最后，包括激励源，检测器和其他光学元件的光学系统必须足够地健壮，可以容忍或校正光学对准的变化，例如，由于病人的运动或光阅读器中电子电路的漂移。光学系统还必须足够灵敏以检测来自报道染料的信号，而不需要依靠高功率消耗和/或大尺寸元件，否则它使该系统不是便携式和不耐用的。
所以，我们需要这种一种生物传感器，在它的检测元件中包含有构象和/或定向移动性的结合蛋白，它连接到提供耐用和健壮装置的光检测元件。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测样本中目标分析物浓度的装置。该样本可以是血液，唾液，眼泪，汗水，尿液，脑脊髓液，淋巴液，间隙液体，血浆，血清，动物组织和培养基。该装置包括(i)有近端和远端的光路管道；(ii)在光路管道近端的光学系统，它包含至少一个电磁能发射器和至少一个电磁能检测器；和(iii)与光路管道远端光路相邻的检测元件，包括适合于至少结合一个目标分析物的至少一个结合蛋白；所述检测元件还包括至少一个报道基团，和任选的一个或多个参考基团。
长度可以是约0.1cm至1m的光路管道耦合光进入和射出光学系统以及进入和射出检测元件。例如，光路管道可以是透镜，反射通道，针管，或光纤。光纤可以是单股光纤(单模或多模)或多于一条光纤的一束光纤。在一个实施例中，一束光纤是二分叉光纤束。光纤可以是非锥形或锥形，因此，它可以穿透到病人的皮肤。
光学系统包括一个或多个激励源和一个或多个检测器的组合。它还可以包括滤波器，二向色元件，功率源和用于信号检测和调制的电子元件。光学系统可以任选地包括微处理器。
通过耦合一个或多个询问波长光进入光路管道，光学系统可以连续或间隙地询问样本。然后，该一个或多个询问波长光传输通过光路管道并照射检测元件。分析物浓度的变化导致报道基团发光波长，强度，寿命，能量转换效率，和/或偏振的变化，报道基团是部分的检测元件。形成的变化发光信号传输返回通过光路管道到光学系统，其中信号被检测，解释，和存储和/或显示。在某些实施例中，光学系统包含多个激励源。可以调制这些激励源中的一个或多个激励源以允许被检测信号的动态信号处理，从而提高信噪比和检测灵敏度。调制还可用于减小装置的功率消耗或增加检测元件的寿命，其中通过减小诸如光漂白的多余现象。光学系统还可以包括一个或多个电磁能检测器，用于检测来自报道基团和任选参考基团的发光信号，以及用于内部参照和/或定标。保持光学系统的总体功率消耗很小，从而允许利用电池功率运行该装置。
检测元件包括一个或多个结合蛋白，它适合于结合至少一个目标分析物，和至少一个报道基团。合适的结合蛋白可以是任何适用于生物传感器的结合蛋白。例如，合适的结合蛋白可以是共同申请共同拥有的美国专利中所描述的，例如，US Patent ApplicationSerial No.10/039,833，2002年1月4日申请；US Patent ApplicationSerial No.10/040,077，2002年1月4日申请；US Patent ApplicationSerial No.10/039,799，2002年1月4日申请；和US Patent Application，在相同日期申请的Terry Amiss et al“Compositions and Methods forMeasuring Analyte Concentrations”(attorney docket no.P-6011)，全文合并在此供参考。合适的结合蛋白还可以是US PatentNo.6,277,627，US Patent No.6,197,534，或WO 03/060464 A2中描述的任何一种结合蛋白，全文合并在此供参考。
在结合蛋白与目标分析物结合之后，与结合蛋白相关的报道基团适合于经受发光变化。如此处所描述的，术语“相关”意味着报道基团是与结合蛋白共价或非共价相关，因此，在目标分析物与结合蛋白结合之后，报道基团的发光性质发生变化，例如，波长，强度，寿命，能量转换效率，和/或偏振。报道基团的例子包括，但不限于，有机染料，有机染料对，荧光或生物发光融合蛋白，或以上的任何组合。报道基团可以由经受荧光共振能量转换的供体和受体构成。其他的发光标记部分包括镧系元素，例如，铕(Eu3+)和铽(Tb3+)，以及金属-配体复合物，包括钌[Ru(II)]，铼[Re(I)]，或锇[Os(II)]的复合物，通常是在有二亚胺配体的复合物中，例如，二氮杂菲。
检测元件是与光路管道光路相邻。“光路相邻”的意思是，该装置的各个元件之间互相足够接近，因此，从一个物体可以发射光信号到另一个物体或被接收。检测元件可以按照多种方法放置成与光路管道光路相邻，例如直接粘附到光路管道；粘附到与光路管道粘附的连接器；粘附到与光路管道粘附的高分子链或聚合物基体；或粘附到与连接器粘附的高分子链或聚合物基体，而该连接器粘附到光路管道。检测元件可以永久地或可替换地粘附到光路管道，因此，可以方便和经济地替换检测元件。
在另一个实施例中，检测元件还包括一个或多个参考基团。与报道基团不同，参考基团有发光信号，在目标分析物与结合蛋白结合之后，该发光信号基本上不变化。“基本上不变化”意味着，参考基团的发光变化远远小于报道基团经受的发光变化。参考基团可以由发光染料和/或蛋白质构成，它用于内部的参照或定标。参考基团可以粘附到该装置中任何数目的元件，其中包括检测元件，不含报道基团的结合蛋白，聚合物基体，高分子链，不是结合蛋白的生物分子，光路管道，或触点。
检测元件(通常，这是指有相关报道基团和任选参考基团的结合蛋白)可以直接粘附到光路管道的远端，例如，利用共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，浸渍涂敷，旋转涂敷，血浆涂敷，或真空沉积。检测元件也可以粘附到连接器，连接器可以使检测元件容易地可拆卸，从而使它是可替换的。
在另一个实施例中，检测元件粘附或固定到聚合物基体上。聚合物基体可以是自由扩散有关分析物出入基体的任何基体，而排除干扰的免疫蛋白和蛋白酶，并允许结合蛋白保留一定程度的构象和/或取向活动性。聚合物基体可以包含多层，其中内层的作用是保留结合蛋白，而一个或多个外层用于控制渗透性和/或实现生物兼容性。例如，聚合物基体可以是共同申请共同拥有的US Application Serial No.10/428,295中所描述的任何一种，2003年5月2日申请，全文合并在此供参考。通过共价链接检测元件与聚合物基体，或实际俘获检测元件到聚合物基体内，可以完成这种固定。在聚合物基体实际俘获检测元件的情况下，该基体的孔大小适合于保留检测元件。在检测元件粘附到聚合物基体的实施例中，例如，利用共价或离子链接，使检测元件粘附到聚合物基体。利用粘合剂，浸渍或旋转涂敷，血浆涂敷，共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，机械连接器或它们的组合，聚合物基体可以粘附到光路管道的远端。
在另一个实施例中，检测元件粘附到高分子链。粘附检测元件到高分子链的方法包括，但不限于，共价，离子，和范德瓦耳斯相互作用以及它们的组合。例如，利用浸渍或旋转涂敷，血浆涂敷，真空沉积，共价，离子，和范德瓦耳斯相互作用，或它们的组合，高分子链粘附到光路管道的远端。
在另一个实施例中，该装置还包括触点(锥形或非锥形)，它设计成可以刺穿皮肤，从而允许检测元件接触体液。最好是，触点是可置换的。可以利用塑料，钢，玻璃，聚合物，或这些或类似材料的任何组合制成触点。利用粘合剂或机械式啮合，触点可以直接粘附到光路管道(光纤)。触点还可用于封装含检测元件的光路管道，因此，它可以封装光路管道和检测元件。在一个实施例中，检测元件可以包含在触点内。
该装置还包括连接器，它可以粘附该装置中的各个元件。连接器可以是机械装置，例如，标准光纤连接器，Luer锁，塑料，金属，或玻璃套管，或安装弹簧外壳。例如，连接器可用于粘附检测元件与光路管道，或粘附光路管道与光学系统。连接器的主要用途是提供一种可以使其他元件容易拆卸的元件，因此，该元件是可置换的元件。
在以上的描述中，应当知道，本发明的主要目的是提供一种改进的装置，用于检测目标分析物的浓度，该装置是耐用和容易操作的。最好是，该装置可用于连续监测分析物，但是一些专业人员可以设想，利用该装置可以连续和偶尔监测体内和/或体外样本。
本发明的另一个目的是提供一种设计紧致和便携式的装置。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测目标分析物的健壮装置。
本发明的另一个目的是提供一种容易使用并有高度可靠结果的装置。
本发明的另一个目的是提供一种具有精确和提供短时间内读数的装置。
本发明的另一个目的是提供一种有很小尺寸触点部分的装置，它在插入到病人身体中时不产生痛苦或有很少的痛苦或感觉。
在研究以下结合附图的详细描述之后，本发明的这些和其他目的和优点是显而易见的。
参照附图中描述的实施例，可以更容易地明白本发明，其中 图1是按照本发明实施例的通用生物传感器示意图； 图2是按照本发明实施例传感器的光路部分中两种光学配置； 图3是按照本发明实施例的各种生物传感器触点； 图4表示本发明实施例的耐用体内光生物传感器； 图5是按照本发明实施例的光纤生物传感器性能曲线图，其中跟踪麻醉猪中的变化葡萄糖浓度； 图6是按照本发明实施例的光纤生物传感器性能曲线图，其中利用400微米纤芯光传感器和图2A所示的光学配置； 图7是按照本发明实施例的光纤生物传感器性能曲线图，其中利用400微米纤芯光传感器和图2A所示的光学配置；和 图8表示包含多个电磁能检测器和内部参照的本发明实施例。
在全部的附图中，应当明白，相同的参考数字是指相同的特征和结构。
具体实施例方式现在参照附图描述本发明的优选实施例。以下的本发明详细描述没有试图说明所有的实施例。在描述本发明的优选实施例时，为了清晰起见，我们采用专用的术语。然而，本发明并不试图局限于所选取的专用术语。应当明白，每个特定元件包含在类似方式下完成类似目的所运行的所有技术相当物。
本发明涉及结合蛋白(binding-protein)，它可以在所需临床或分析范围内结合所研究的分析物。此外，一个或多个发光报道基团是与结合蛋白相关。这些发光报道基团(reporter group)包括，但不限于，共价耦合到蛋白中半胱氨酸残渣的有机芳香族染料分子，例如，发光生物分子，诸如融合到工作结合蛋白中的蛋白。半胱氨酸或其他氨基酸族可以组合到结合蛋白中，用于提供发光报道分子的粘附位置。分析物与结合蛋白的结合导致一个或多个报道基团的发光性质变化。受影响的发光性质可以是吸收波长或发射波长，吸收强度或发射强度，发射寿命，发射偏振，和/或能量转换效率。分析物的结合也是可逆的，其中分解也可以导致报道分子发光性质的变化。
一个或多个结合蛋白以及它们相关的报道基团包含检测元件。任选地，检测元件还可以包含一个多个参考基团。与报道基团不同，参考基团有这样的发光信号，它在目标分析物与结合蛋白结合之后基本上不变化。来自参考基团的发光信号提供内部光学标准，它可用于校正光学缺陷，这是由于光学系统中的电子漂移或由于样本或光路管道运动造成的。参考基团还可用于定标。参考基团可以粘附到该装置中的任何数目元件，包括检测元件，不含报道基团的结合蛋白，聚合物基体，高分子链，不是结合蛋白的生物分子，光路管道，或触点。在一个实施例中，参考基团粘附到结合蛋白，它对于生理相关浓度下的分析物没有展示很大的响应。
检测元件包括一个或多个结合蛋白，一个或多个报道基团，和任选的参考基团，检测元件可以固定在光路管道的一端，或固定在与光路管道连接的可置换触点内。可以完成检测元件固定在光路管道上或可置换触点内，其中通过沉积薄层检测元件直接到光路管道或触点上，例如，浸渍或旋转涂敷，共价粘附，血浆处理等。交替地，检测元件可以首先固定到聚合物基体，该基体然后粘附到光路管道或触点上，其中利用粘合剂，注模，浸渍或旋转涂敷，血浆涂敷，真空沉积，喷墨技术，共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，机械式粘附或它们的组合。
通过传输来自电磁激励源的光经光路管道到含检测元件的光路管道远端，光学系统能够询问报道基团和参考基团的发光响应。该光学系统还监测和解释报道基团和参考基团发光响应产生的返回信号。报道基团的发光性质，例如，波长，强度，寿命，能量转换效率或偏振，响应于分析物结合或与结合蛋白的非结合而发生变化。
现在参照图1，我们描述本发明的具体典型实施例。光学系统2包括各种元件的组合，这些元件包括，但不限于，电磁能发射器，电磁能检测器，各种反射镜，滤波器，电子电路，全息光学元件，二向色元件，和光学标准，它是从电磁能发射器发送询问辐射经光路管道到检测元件以及随后分析和解释返回发光信号所需要的。响应于变化的被检测分析物浓度，来自报道基团的返回发光信号发生变化。光学系统2还可以包括计算机或微处理器3，用于信号处理，数学运算一个或多个信号，和数据存储和处理。计算机或微处理器3可以与光学系统的其他元件实际接触，或在一个优选实施例中，它可以与光学系统的其他元件实际分开到高达几米的距离。在这个实施例中，来自光学系统中电磁能检测器和电子处理元件的信息与计算机或微处理器3进行无线通信。计算机或微处理器3还可以存储检测元件专用的定标信息。光学系统2中产生的一个或多个波长的光经光路管道4传输到检测元件6。光路管道4可以是光纤或短的光波导，它以最小的损耗传输光。检测元件6包含有一个或多个相关发光报道基团的一个或多个结合蛋白，或报道基团固定在聚合物基体中，粘附到高分子链，合并在可置换触点中，直接粘附到光路管道的远端，或粘附到连接器。检测元件6还可以包含附加的发光参考基团，这些参考基团可以任选地粘附到生物分子，聚合物，或有机分子，其目的是提供参考信号或定标信号。检测元件6可以直接地或经聚合物基体粘附到光路管道4的远端，而在一个优选实施例中，它可以粘附到可置换触点5，触点5粘附到光路管道4的远端。在这种情况下，可置换触点5放置成紧靠光路管道4，利用机械方式，借助于粘合剂，或利用专业人员熟知的任何其他合适装置。
图2是在两个典型实施例中的光学系统2放大图。在图2a中，二向色反射镜或分束器11用于引导来自电磁能源7的光到光路管道4。激励源可以包括，但不限于，弧光灯，激光二极管，或LED。在这个实施例中，光路管道4是光纤光缆，相同的光纤可用于传输来自电磁能源7的激发光到检测元件6，而且还可以传输来自报道或参考基团的发光信号返回到光学系统2。最好是，二向色元件11分出来自激发光的返回信号，并引导该信号到电磁能检测器8。检测器可以包括，但不限于，光电二极管，CCD芯片，或光电倍增管。在多个发光信号是从检测元件返回的情况下，附加的二向色元件可用于引导部分的返回信号到多个检测器。最好是，对分析物不灵敏的发光参考基团与分析物有关的报道基团一起提供参考信号。例如，这个参考信号可用于校正光路或电子漂移。
图2B表示第二个实施例，其中二分叉光纤束或熔融光纤装置用于传输光来往于检测元件。此处，来自激励源7的光传输到二分叉光纤束的一条支路。利用二分叉光纤束的另一条支路检测来自检测元件的返回发光信号，因此，在这种情况下，光纤束的作用是分开激发光和返回光。例如，基于波长或偏振，二向色光学元件，分束器，或偏振器还可用于进一步分割返回光。任选地，带通滤波器12可用于选取被检测的发光波长。功率源9给光学系统2提供功率。
图3表示粘附检测元件到光路管道一端的典型方法，其中光路管道是光纤。在图3A中，检测元件直接粘附到光纤的远端，例如，利用共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，浸渍涂敷，旋转涂敷，血浆涂敷，真空沉积，喷墨技术，或它们的组合。交替地，包含与报道基团和任选参考基团相关结合蛋白的检测元件可以粘附到长链聚合物，而长链聚合物直接粘附到光纤的远端，例如，利用浸渍涂敷或旋转涂敷，血浆涂敷，真空沉积，共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，喷墨技术，或它们的组合。
在图3B中，检测元件固定在聚合物基体中，而聚合物基体粘附到光纤的远端，例如，利用粘合剂，浸渍涂敷或旋转涂敷，血浆涂敷，注模，喷墨技术，或共价，离子，或范德瓦耳斯相互作用，机械式连接器，或它们的组合。在一个优选实施例中，聚合物基体和/或蛋白的活性基用于直接地共价粘接检测元件到光纤，例如，在玻璃或石英光纤的表面上引入氨基。在图3C中，塑料或聚合物套管装配到光纤的远端，并利用它封装和保护检测元件。检测元件被俘获或粘附到聚合物基体。包含检测元件的聚合物基体可以通过喷注，浇灌或浸渍引入到套管中，并可以在套管内交叉链接或聚合。或者，在插入到光纤之前，检测元件可以聚合在套管内。图3D表示被夹持在针管内的光纤。针管可以有变化的斜面以控制刺穿深度和/或侧面端口，从而允许分析物接触针管内包含的检测元件。利用图3A，3B或3C讨论中描述的方法，针管内的检测元件可以直接粘贴到光纤，或者可以与光纤仅仅有机械式接触。图3所示的粘附方案是优选的实施例，并可以单独地使用或组合地使用。
图4表示优选实施例的耐用光生物传感器。触点21是长度约为1-10mm的钢针，在钢针内包含检测元件6，它固定到光纤22上。光纤，触点和钢针的组件是在塑料底座24的中心。包含光纤和检测元件的触点垂直插入到病人的皮肤中，因此，在光纤末端的化学品驻留在皮内或皮下空间。于是，粘合环25可以保持塑料底座和钢针组件在合适位置。光学系统2夹持塑料底座，其中连接器26与光学系统的光纤22连接。例如，可以按照光学实施例2a或2b设计光学系统。激励源可以包括，但不限于，弧光灯，激光二极管，LED。检测器可以包括，但不限于，光电二极管，CCD芯片，或光电倍增管。
以下的例子说明本发明的某些优选实施例，这些例子仅仅用于说明典型的实施例。此处利用有荧光基团报道探针的标记突变结合蛋白是按照Cass et al提出的操作步骤，Anal.Chem.1994，66，3840-3847，或其他方法描述的操作步骤。
例1 按照本发明的一个实施例，我们利用有三重突变的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)，其中包括半胱氨酸替代位置149的谷氨酸，精氨酸替代位置213的丙氨酸，和丝氨酸替代位置238的亮氨酸(E149C/A213R/L238S)。该蛋白标记在有N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)乙二胺(IANBD酰胺)oxy的位置149。这个突变的GGBP(E149C/A213R/L238S)是葡萄糖专用的，而报道基团经受荧光强度变化以响应葡萄糖结合。
按照以下方法制备多层涂膜或多层基体。通过混合1份染料标记结合蛋白(在PBS缓冲液中15μM，pH 7.4，按照PCT/US03/00203中所描述的方法制备)和在闪烁管中2至4份3wt％藻酸盐(v/v)在低速下涡流，可以制成芯基体，制成的3mL蛋白-藻酸盐混合物放置在注射器中，并以10mLl/hr的速率注入到混合器中200ml的1M CaCl2，从而制成直径约为0.4至1.5mm圆珠。该圆珠与混合器中的CaCl2溶液混合15-60分钟。然后，可以制成抑制层，其中从上放入该圆珠到水中约10mL聚-L-赖氨酸0.01w/v溶液1小时，然后在吸湿毛巾上干燥聚赖氨酸涂敷的圆珠15至30分钟。此时可以准备使用该传感器。
在这个实施例中使用的光纤是二分叉光纤。它包含围绕中心400μm光纤的6条400μm光纤。这6条光纤用作激励管道，而中心光纤用作检测管道。光纤的总直径为1.4mm。一旦光纤被抛光，Loctite 4011医疗级胶用于粘附检测元件到光纤的远端。光纤的近端是二分叉的，一条分支进入激励源，而另一条分支进入检测器。470nmLED用作激励源，而商品化荧光光谱仪用作电磁能检测器。然后，测量540nm下的发射强度。
在试验中，按照这种方式制成的生物传感器远端和检测元件通过13量规针管插入到麻醉猪体内，在皮肤下约1-2mm深处。有和没有10％右旋糖的乳酸ringer′s交替溶液注入通过猪的耳静脉，以可控的方式增加和减少猪的葡萄糖浓度。每隔一段时间，通过咽喉导管从猪的腔静脉抽出血液样本，并在手持血糖计上测试血糖读数。观察生物传感器的荧光强度，用于跟踪麻醉猪的变化葡萄糖浓度，如图5所示。
例2 在另一个实施例中，结合蛋白是葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)，其中半胱氨酸替代位置149的谷氨酸，精氨酸替代位置213的丙氨酸，和丝氨酸替代位置238的亮氨酸(E149C/A213R/L238S)。该蛋白标记在有N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)乙二胺(IANBD酰胺)的位置149。生物传感器的制备是通过插入400微米芯直径光纤触点到一段短导管，并允许该导管悬挂在光纤触点之上0.1-1mm。该光纤是由石英纤芯，石英包层和聚酰亚胺缓冲层构成。石英直径是400/440/470微米，其中斜道表示从纤芯/包层/缓冲层外部测量的直径。
固定基体是制备的交链藻酸盐基水凝胶，利用共价交链PronovaTMUP LVG藻酸盐通过有脂肪酸二酰肼(AAD)的羧基，借助于碳化二亚胺化学。在这个实施例中选取的PronovaTMUP LVG有低的粘度和高的guluronic/mannurouic比。制备2％藻酸盐溶液，其中在50mL 0.1M MES缓冲液中溶解1克藻酸盐，然后，添加110mgAAD和79mg hydroxybenzotriazole(HOBt)。该溶液在使用之前贮存在温度4℃。对于藻酸盐溶液，利用双注射器混合技术，在每10mL溶液中添加145mg的1-乙基-3-(3-二甲胺-丙基)碳化二亚胺(EDC)。藻酸盐，AAD，HOBt，EDC混合物被抽取到1mL的注射器中，而钝圆30量规针管粘附到注射器。针管被灌注，而触点插入到光纤上的导管模具。填充光纤上的导管，确保光纤触点与藻酸盐基体之间的良好接触。允许该基体交链15分钟，然后，光纤触点和基体组合被转移0.1M，6.5pH MES溶液中，把它们贮存2小时。在2小时之后，检测触点放入到过磷酸缓冲溶液(PBS，0.0027M氯化钾，0.137氯化钠，pH 7.4)其中它们最少贮存30分钟以抑制反应。
为了粘附结合蛋白，触点在PBS缓冲液[NBD-E149C/A213R/L238SGGBP](53μM，50μL)的标记GGBP溶液中培养8小时。在培养期间，保护传感器免受环境光的影响。在8-24小时培养之后，50μL的EDC/NHS(200mM/50mM)添加到培养管中。在40分钟之后，取出传感器触点，并放置在50μL的1M，pH 8.5乙醇酰胺溶液中以抑制反应。在乙醇酰胺溶液中20分钟之后，传感器触点转移到PBS溶液，在其中允许它们至少停留24小时，在此期间扩散出未反应的蛋白。然后，把传感器转移到新鲜的PBS并在准备使用之前贮存在暗室中。
在这个例子中，光纤是单根400μm纤芯的多模光纤(石英纤芯，石英包层，聚酰亚胺缓冲层)。由于在这个实施例中相同的光纤传输激励信号和发光信号，二向色光学元件用于分开激励信号和发光信号，如图2A所示。激励源是470nm的LED。商品化二向色滤波器用于反射470nm激励信号到光纤的输入端，并传输中心波长为550nm的荧光到检测器。玻璃非球面透镜用于光束准直和聚焦光进入光纤到达检测器。利用550nm的带通滤波器，还从检测器中去除散射激励。SMA连接器允许快速连接和断开光纤传感器。这个实施例中的电磁能检测器是单光子计数光电倍增管。数据采集是在膝上型计算机中完成，该计算机通过RS-232接口与检测器通信。
图6，在试验中，按照这种方式制成生物传感器的远端和检测元件插入到含不同葡萄糖浓度的猪血清溶液中。通过200微米过滤器过滤所有的猪血清溶液，并利用临床分析仪测量该溶液中的葡萄糖浓度。图6表示该传感器的体外性能。测得的初始葡萄糖浓度为56mg/dL。把PBS中浓缩的1M葡萄糖注入到血清标本中，制备150mg/dL和300mg/dL的血清样本。
例3 在本发明的另一个实施例中，生物传感器是通过薄膜共价粘附到光纤表面上制成。结合蛋白是是葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)，其中半胱氨酸替代位置149的谷氨酸，精氨酸替代位置213的丙氨酸，和丝氨酸替代位置238的亮氨酸(E149C/A213R/L238S)。该蛋白标记在有N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)乙二胺(IANBD酰胺)的位置149。
生物传感器的制备是通过共价粘附藻酸盐基体到石英光纤的胺功能化表面上。该光纤是由石英纤芯，石英包层，和聚酰亚胺构成。光纤直径是400/440/470微米，其中斜道表示从纤芯/包层/缓冲层外部测量的直径。
在喷灯下暴露最后几毫米光纤1-2秒钟，从光纤的触点去除聚酰亚胺缓冲层。然后清除剩余的聚酰亚胺。去除缓冲层的触点放置在1M硫酸中1小时。然后，利用蒸馏水冲洗触点，放置在乙醇中15分钟，再浸没在无水甲苯中15分钟。然后，清洁的触点放置在含1％3-氨丙三乙氧苯基硅烷(APTES)的加温(60℃)无水甲苯中并允许发生反应5分钟。然后，从APTES溶液中取出触点并用乙醇清洗15分钟。在这个过程结束之后，利用光电子光谱仪验证光纤表面上存在胺基团。
按照以下方法把藻酸盐基体加到胺功能化光纤表面上。固定基体是交链藻酸盐基水凝胶，它是通过共价交链PronovaTMUPLVG藻酸盐制备的，选取它有低的粘度和高的guluronic/mannurouic比，通过有脂肪酸dihydrazide(AAD)经碳化二亚胺化学品的羧基。制备2％藻酸盐溶液，其中通过溶解1克藻酸盐在50mL 0.1M MES缓冲液(pH 6.5)中，然后添加110mg的AAD和79mg的hydroxybenzotriazole(HOBt)。利用双注射器混合技术，0.5mL部分的这个溶液与50μL的MES缓冲液中10mg的EDC进行混合。该溶液的总体积约为0.55mL。把藻酸盐，AAD，HOBt，EDC混合物转移到微离心管形瓶，而APTES功能化光纤触点浸没在藻酸盐溶液中3-4分钟，或直至该基体开始固化。然后，从藻酸盐溶液中取出触点，允许在空气中继续反应约1-10分钟，再转移到0.1M，pH 6.5的MES缓冲液中。允许触点在MES缓冲液中停留2小时，然后该触点在过磷酸盐缓冲液(PBS，0.0027M氯化钾，0.137氯化钠，pH 7.4)中至少抑制30分钟。
为了粘附结合蛋白，触点在PBS缓冲液[NBD-E149C/A213R/L238SGGBP](20-60μM，50μL)的标记GGBP溶液中培养几个小时。在培养期间，保护传感器免受环境光的影响。在约2-8小时培养之后，50μL的EDC/NHS(200mM/50mM)添加到培养管中。在5-40分钟之后，取出传感器触点，并放置在50μL的1M，pH 8.5乙醇酰胺溶液中以抑制反应。在乙醇酰胺溶液中20分钟之后，传感器触点转移到PBS溶液，在其中允许它们至少停留8小时，在此期间扩散出未反应的蛋白。然后，把传感器转移到新鲜的PBS并在准备使用之前贮存在暗室中。
在上述实施例的试验中，光阅读器是与以上例子中描述的相同，不同的是，利用螺线管驱动的光闸调制470nm激励源。除了连接和控制光闸和检测器以外，允许软件定时采集荧光读数，图形显示结果，以及数据分析和定标算法。
然后，按照这种方式制成的生物传感器远端和检测元件插入到麻醉猪体内。完成这种插入是借助于皮内或皮下插入光纤通过18-24量规针管形成皮肤中的孔。有和没有10％右旋糖的乳酸ringer′s交替溶液注入通过猪的耳静脉，以可控的方式增加和减少猪的葡萄糖浓度。每隔一段时间，通过咽喉导管从猪的腔静脉抽出血液样本，并在手持血糖计上测试血糖读数。观察生物传感器的荧光强度，用于跟踪麻醉猪的变化葡萄糖浓度，如图7所示。
例4 在本发明的另一个实施例中，利用内部光参考基团完成双波长检测。结合蛋白是是葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)，其中半胱氨酸替代位置149的谷氨酸，精氨酸替代位置213的丙氨酸，和丝氨酸替代位置238的亮氨酸(E149C/A213R/L238S)。该蛋白标记在有报道基团N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)乙二胺(IANBD酰胺)的位置149。参考基团是粘附到GGBP的Texas RedC2马来酰亚胺，其中半胱氨酸替代位置149的谷氨酸(TR-E149C GGBP)。在葡萄糖浓度的生理范围内，来自TR-E149C GGBP的发光是基本不变化的，因此，TR-E149C GGBP可以作为信号的内部参考，该信号来自分析物有关结合蛋白和报道基团(NBD-E149C/A213R/L238S GGBP)。
生物传感器的制备是通过插入400微米芯直径光纤触点到一段短导管，并允许该导管悬挂在光纤触点之上0.1-0.5mm。该光纤是由石英纤芯，石英包层和聚酰亚胺缓冲层构成。石英直径是400/440/470微米，其中斜道表示从纤芯/包层/缓冲层外部测量的直径。
固定基体是制备的交链藻酸盐基水凝胶，利用共价交链PronovaTMUP LVG藻酸盐通过有脂肪酸二酰肼(AAD)的羧基，借助于碳化二亚胺化学，选取的PronovaTMUP LVG有低的粘度和高的guluronic/mannurouic比。制备2％藻酸盐溶液，其中在50mL 0.1MMES缓冲液中溶解1克藻酸盐，然后，添加110mg AAD和79mghydroxybenzotriazole(HOBt)。该溶液在使用之前贮存在温度4℃。利用双注射器混合技术，0.5mL部分的藻酸盐溶液与含10mg的1-乙基-3-(3-二甲胺-丙基)碳化二亚胺(EDC)和90μL的μM TR-E149CGGBP的50μL MES溶液混合。藻酸盐，AAD，HOBt，EDC，TR-E149C混合物被抽取到1mL的注射器中，而钝圆30量规针管粘附到注射器。针管被灌注，而触点插入到光纤上的导管模具。填充光纤上的导管，确保光纤触点与藻酸盐基体之间的良好接触。允许该基体交链15分钟，然后，光纤触点和基体组合被转移0.1M，6.5pH MES溶液中，把它们贮存2小时。在2小时之后，检测触点放入到过磷酸缓冲溶液(PBS，0.0027M氯化钾，0.137氯化钠，pH＝7.4)，其中它们最少贮存30分钟以抑制反应。
为了粘附结合蛋白，触点在PBS缓冲液[NBD-E149C/A213R/L238SGGBP]的标记GGBP溶液中培养。在培养期间，保护传感器免受环境光的影响。在8-24小时培养之后，50μL的EDC/NHS(200mM/50mM)添加到培养管中。在5-40分钟之后，取出传感器触点，并放置在50μL的1M，pH 8.5乙醇酰胺溶液中以抑制反应。在乙醇酰胺溶液中20分钟之后，传感器触点转移到PBS溶液，在其中允许它们至少停留8小时，在此期间扩散出未反应的蛋白。然后，把传感器转移到新鲜的PBS并在准备使用之前贮存在暗室中。
在上述实施例的试验中，利用按照图2A所示配置的光学系统读出荧光信号。470nm的LED(LS-450)用于激励，和两个单光子计数倍增管用作电磁能检测器。商品化二向色分束器用于反射来自电磁能发射器的470nm光到光纤中，并传输来自报道基团和参考基团的发光信号到检测器。第二个二向色分束器用于分开来自报道基团和参考基团的发光信号，并引导来自NBD-E149C/A213R/L238R的发射到一个检测器和引导来自TR-E149C GGBP的发射到另一个检测器。该一个检测器之前的550nm带通滤波器和另一个检测器之前的610nm带通滤波器分别用于提高NBD-E149C/A213R/L238R和TR-E149C GGBP的光谱分辨率。
在试验中，按照这种方式制成生物传感器的远端和检测元件插入到含不同葡萄糖浓度PBS缓冲液的溶液中。利用临床分析仪测量该溶液的葡萄糖浓度。图8表示该传感器响应于变化的葡萄糖浓度。来自IANBD报道基团的550nm信号跟踪变化的葡萄糖浓度。从TexasRed报道基团发射的610nm信号基本上不随葡萄糖浓度变化而变化。然而，在这个实施例中，部分的报道基团发射也发生在610nm。跟踪610nm发光信号的光学系统中检测器可以检测参考基团的发射和部分的报道基团(IANBD)发射，该发射发生在这个波长区。由于对报道基团610nm信号的贡献是550nm信号的恒定比例，可以利用数学方法从610nm信号中减去这个贡献，用于产生仅来自参考基团的信号。在完成这个数学运算之后，610nm信号基本上不随葡萄糖浓度而变化，如图8所示。
虽然此处公开的本发明是借助于具体实施例及其申请所描述的，但是在不偏离权利要求书限定的本发明范围内，专业人员可以对公开的内容作各种改动和变化。
权利要求
1.一种用于检测样本中目标分析物的装置，包括有近端和远端的光路管道；在光路管道近端的光学系统，包括至少一个电磁能发射器和至少一个电磁能检测器；和与光路管道远端光路相邻的检测元件，包括适合与至少与一个目标分析物结合的至少一个结合蛋白，和与结合蛋白相关的至少一个报道基团，其中报道基团在结合蛋白与目标分析物结合之后适合于经受发光变化，和可选地，至少一个参考基团。
2.按照权利要求1的装置，还包括触点。
3.按照权利要求2的装置，其中检测元件包含在触点内。
4.按照权利要求3的装置，其中检测元件粘附到触点的内表面，而触点直接粘附到光路管道的远端。
5.按照权利要求1的装置，其中检测元件直接粘附到光路管道的远端。
6.按照权利要求1的装置，还包括一个或多个连接器。
7.按照权利要求6的装置，其中检测元件通过连接器粘附到光路管道的远端。
8.按照权利要求1的装置，其中检测元件被俘获或粘附到聚合物基体。
9.按照权利要求8的装置，其中聚合物基体直接粘附到光路管道的远端。
10.按照权利要求8的装置，其中聚合物基体粘附到触点的内表面，且其中触点直接粘附到光路管道的远端。
11.按照权利要求8的装置，其中聚合物基体粘附到触点的内表面，且其中触点直接粘附到连接器，该连接器直接粘附到光路管道的远端。
12.按照权利要求1的装置，其中检测元件粘附到高分子链。
13.按照权利要求12的装置，其中所述高分子链粘附到光路管道的远端。
14.按照权利要求12的装置，其中高分子链粘附到触点的内表面，且其中触点直接粘附到光路管道的远端。
15.按照权利要求12的装置，其中高分子链粘附到触点的内表面，且其中触点直接粘附到连接器，该连接器直接粘附到光路管道的远端。
16.按照权利要求6的装置，其中光学系统通过连接器粘附到光路管道的远端。
17.按照权利要求6的装置，其中检测元件通过连接器粘附到光路管道的远端，而光学系统通过连接器粘附到光路管道的近端。
18.按照权利要求16和17的装置，还包括触点，其中触点通过连接器粘附到光路管道的远端。
19.按照权利要求1的装置，其中光路管道包括至少一条光纤。
20.按照权利要求1的装置，其中电磁能发射器选自弧光灯，发光二极管，和激光二极管。
21.按照权利要求1的装置，其中电磁能检测器是光电二极管，光电倍增管，或电荷耦合器件。
22.按照权利要求1的装置，其中所述光学系统还包括适合于区分多个波长的光学元件。
23.按照权利要求22的装置，其中所述光学系统还包括光滤波器，二向色元件，全息元件，或它们组合。
24.按照权利要求21的装置，其中所述电磁能检测器适合于检测所述报道基团基本连续发射的能量。
25.按照权利要求21的装置，其中所述电磁能检测器适合于检测所述报道基团周期性发射的能量。
26.按照权利要求1的装置，其中所述光学系统还包括电子元件或光电元件，用于调制来自电磁能发射器的信号。
27.按照权利要求1的装置，其中所述光学系统还包括电子元件或光电元件，用于调制电磁能检测器接收的发光信号。
28.按照权利要求1的装置，其中光学系统适合于测量发光信号的强度。
29.按照权利要求1的装置，其中光学系统适合于测量发光信号的波长。
30.按照权利要求1的装置，其中光学系统适合于测量发光信号的寿命。
31.按照权利要求1的装置，其中光学系统适合于测量发光信号的偏振。
32.按照权利要求1的装置，其中光学系统适合于测量报道基团的能量转换效率。
33.按照权利要求2的装置，其中所述触点还包括金属架。
34.按照权利要求1的装置，其中至少一个参考基团是与蛋白相关。
35.按照权利要求1的装置，其中所述检测元件还适合于插入或通过病人的皮肤。
36.按照权利要求1的装置，其中至少一个报道基团和至少一个参考基团是在相同的波长下被激发。
37.按照权利要求1的装置，其中至少一个报道基团和至少一个参考基团是在不同的波长下被激发。
38.按照权利要求1的装置，其中至少一个报道基团和至少一个参考基团的发光是在不同的波长下被检测。
39.按照权利要求1的装置，其中至少一个报道基团和至少一个参考基团的发光是在相同的波长下被检测。
40.按照权利要求1的装置，其中报道基团包括一对选取的有机染料，因此，该对有机染料之间的能量转换效率在分析物结合之后发生变化。
41.按照权利要求1的装置，其中报道基团包括一对选取的融合蛋白，因此，该对融合蛋白之间的能量转换效率在分析物结合之后发生变化。
42.按照权利要求1的装置，其中报道基团包括选取的有机染料和融合蛋白，因此，有机染料与融合蛋白之间的能量转换效率在分析物结合之后发生变化。
全文摘要
公开一种用于检测体内或体外分析物浓度的装置，具体是葡萄糖浓度。光路管道，最好是光纤，在光路管道的远端有光学系统。检测元件粘附到光路管道的远端，并包括适合与至少一个目标分析物结合的至少一个结合蛋白。检测元件还包括至少一个报道基团，该报道基团经受随分析物浓度变化的发光变化。任选地，检测元件包括有发光性质的参考基团，该发光性质在分析物浓度发生变化时基本保持不变。
文档编号G01N21/77GK1902476SQ200480040265
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月26日
发明者加维尔·艾拉康, 克里斯丁·韦德梅尔, 特里·J.·埃米斯, 约翰·D.·丹纽兹奥, 克里斯托夫·C·赫德曼, 罗斯·W.·雅克布森, J·B.·皮特纳, 道格拉斯·B.·舍曼 申请人:贝克顿·迪金森公司