血细胞比容和分析物浓度测定的制作方法

专利名称：血细胞比容和分析物浓度测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及血细胞比容和分析物浓度测定领域。更确切地说，本发明涉及通过对相应于所述抗凝血浆的血样和液体试剂混合物进行至少两次不同的测量以测定抗凝血浆分析物浓度的方法。本发明也包括用于进行血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品测量的测量和测定装置，和设备试剂盒。
背景技术：
如已提及的，本发明涉及通过测量血液和液体试剂混合物测定抗凝血浆中分析物浓度。上述测定结果是进行医学诊断和监测医学治疗效果所必需的。
医学目的的分析物浓度测定传统上是在远离患者的实验室中进行。而在靠近患者的护理场所处常常需要该测定的结果。此与空间位置相关的情形推动了进行接近患者的分析物浓度测定。只有抗凝血可以从护理场所运输到实验室。在实验室，对抗凝血或制备自该抗凝血的抗凝血浆进行分析物测定。因为抗凝血浆易于操作及贮藏，因此尽可能地对抗凝血浆进行分析物浓度的实验室测定。在接近患者(near-patient)场所处，情况则不同。血液易于获得，但抗凝血浆不便或无法制备。就产生了这样的情况，即对抗凝血浆进行分析物浓度的实验室测定和对血液进行接近患者的测定。这样的情况并不令人满意，因为合理的医学实践需要在一给定时间处一分析物浓度值和一给定患者之间的关系。假定进行选择，临床医生更喜欢抗凝血浆中的分析物浓度值，因为这些值与更多的临床参考数据相关。除样品特性之外，本发明还涉及分析物浓度测定的准确性和可靠性。公认准确性和可靠性是分析物浓度测定医学有效性的基础。
根据规定，如果产生的结果与对照法的结果一致，则分析法是准确的。这也适用于测定分析物浓度的接近患者法。为获得准确的接近患者法，合理的设计策略是采用对照法或上述被证实是准确的方法的化学和测定条件。但此直截了当的策略却难以进行。对照法是代表了在实验室环境中长期合作的研究人员努力顶点的实验室法。这些环境和临床实验室环境比较相似。可以在这些环境之一中实现的测定条件也可以在其它环境中实现。进行接近患者浓度测定的环境却与之截然不同。但是通常的实验室法第一步，混合精确体积的抗凝血浆和精确体积的试剂，却是在接近患者测定场所处所几乎无法克服的障碍。在外科手术室、初级护理中心、医生办公室和患者家，抗凝血浆不便于制备，也难以实现精确的体积。因此，接近患者法的第一步通常是；混合无法精确确定体积的血液和干试剂。接近患者测定法的设计者不知不觉地偏离了准确的实验室法的测定条件；是其本身所固有的。而且，偏离了实验室测定条件还造成了接近患者测定法的准确性缺陷。引起了关注和不安，并危害医学诊断和治疗的安全与有效。因此，改善接近患者分析物浓度测定准确性的谨慎策略是，1)鉴定提升了准确性的实验室法测定条件的内容，和2)在接近患者法设计中坚持所鉴定的内容。
如上所述，对照法和准确的实验室法通常是湿化学法。湿化学法成功的主要原因在于其抗基体效应的普遍能力。混合小体积的样品和大体积的试剂稀释了样品。减少了样品整体效应并为选择偏爱的分析物效应的测定条件作好准备。样品的非分析物效应、基体效应，因此不受偏爱，提高了测定的准确性。
通过湿化学法定量测定分析物浓度需要精确分配预期的体积，但在接近患者测定的场所处却很难实现精确的分配。分配应当是足够精确的，但在缺乏用于校验测定体积设备的系统、严格训练的实验室人员和良好管理的实验室的其它方面下，在接近患者场所处体积分配必然是不准确的，如与预期结果无法接受的差异。现有技术解决该问题的手段是发明接近患者法可以使用的‘用户友好的’、便宜的、精确的和准确的测定体积装置。这样的手段所经历的成功是有限的。
除上述提及的传统的接近患者测定场所之外，接近患者测定也在小实验室和大实验室的部门中进行。所有接近患者测定的场所都不喜欢制备抗凝血浆，但其在实现精确确定体积的能力上却有着差别。在下文中，在接近患者测定场所和小实验室之间存在着差别。它们都偏爱血液，但在精确分配血液和试剂预期的体积的能力上有着差别。
小实验室和接近患者测定场所关注的是分析物浓度测定的可靠性。大实验室设定了可靠性标准。在大实验室中，每年进行数千个已知类型的分析物浓度测定。昼夜不停的、固定的、自动化的、可靠的测量和测定装置分配着期望体积的抗凝血浆和试剂，进行着测量和分析物浓度测定。定期分析具有指定分析物浓度值的对照样品，并由专业的、受过良好训练的技术人员指导操作。测量和测定装置进行定期维护。包括在全程序上建立的校准，根据需要进行，尤其是只要程序改变就得进行，例如当引入大批新试剂时，因为以上原因，因此高水平的测定可靠性在大实验室中才能达到。在小实验室和接近患者测定场所处获得可比较的测定可靠性并不是容易的任务。用于可靠性改善的策略包括确定在大实验室中实行的可靠性-增强规程，但不是在小实验室和接近患者测定场所处，并寻找能使这些规程或等价物也可在后一场所处实施的方法。测量和测定装置的定期维护是上述方法之一。在引入程序改变的基础上，在全程序上建立的校准，是第二种方法。对照样品的定期分析是第三种方法。
鉴于惯例，并为了加速反应，实验室法通常在37℃下进行。就准确性而言，温度本身通常并不重要。如果在设计接近患者测定法中可通过在标准的环境室温下进行测定并使测量值适用于该测定以获得有利条件，那么应当要考虑温度。原因在于测量温度在很大程度上并不苛求其保持在规定水平上。在接近患者法中对于37℃的要求很可能是不精确和不准确的来源。在小实验室和接近患者场所处，已知类型分析物浓度的测定仅是零星地进行。因此，测量装置无法稳定运转。对37℃的要求需要测量装置及与该测量直接相关的试剂温度平衡。除了消耗宝贵的时间外，还成为误差的来源。因为时间是宝贵的，所以到达平衡时间总是要最少的，但总稍显不够。该稍显不够的温度到达平衡时间将导致不精确的温度范围，带来了测定的不精确性。该稍显不够的温度平衡也将会倾向于产生较预期温度更低的温度并带来测定的不准确性。如果避免进行温度平衡的话，可以减少测定时间、不精确性和不准确性。此外，无需分配恒温-加热单元，显而易见，减少了测量装置的复杂性和成本，还能明显减少其电力消耗。就其本身而言，能给一次性的、半一次性的、轻量化的、便携的、厂商校准并维护的测定设备提供了方便，可增加接近患者分析物浓度测定的准确性和可靠性并降低成本。
通过凝血酶原时间(PT)测定的例子对本发明背景技术作进一步描述。
根据现有技术，存在两种PT测定方法。一种描述于Quick A.Theprothrombin time in hemophilia and obstructive jaundice.Journal ofBiological Chemistry 1935；10973-74中。另一种描述于Owren P.Thrombotest.A new method for controlling anticoagulant therapy.Lancet 1959；ii754-758中。两种方法都是基于细胞膜结合的组织因子所诱导的凝血。因此，两种方法的试剂都含有促凝血酶原激酶。但是，存在重要差别。除各种盐和赋形剂之外，Quick PT试剂仅含有促凝血酶原激酶，而Owren PT试剂还含有耗尽与BaSO4结合的蛋白的血浆。特别是，该耗尽的血浆耗尽了凝血因子II、VII和X，但并不耗尽其它两种凝血必需的蛋白组分，凝血因子V和血纤蛋白原。QuickPT法依赖于样品，作为血纤蛋白原和凝血因子V的来源，因此深受这些物质不足及异常的影响。因此，对于感兴趣的因子，Owren PT法更特异。因为凝血因子II、VII和X，而非凝血因子V和血纤蛋白原，受使用维生素K拮抗剂医学治疗的影响，所以对于上述治疗的结果，Owren PT法更加特异。在预防血栓形成和其它凝血紊乱及严格建立在监测这些治疗基础上以保证它们安全与有效的PT测定中，上述治疗非常有效。
在PT测定中血纤蛋白原至关重要。其是形成凝血块的物质。没有血纤蛋白原就意味着没有血凝块，也就没有凝血时间和PT测定。如果样品和试剂混合物中血纤蛋白原水平低于约0.1g/L，则凝血块形成受到严重阻碍且凝血终点变得无法确定。因为血纤蛋白原的血浆水平范围低于1g/L，因此在Quick PT法中禁止血浆与试剂比低于1∶10。而在Owren PT法中则没有这样的限制，因为试剂含有血纤蛋白原，并且血浆与试剂比可较1∶10减少得更多。
Quick PT法规定反应混合物由一体积抗凝血浆和两体积试剂组成。Owren PT法规定由一体积抗凝血浆和20体积试剂组成。Owren法更大的样品稀释度减少了基体效应。使得Owren法较Quick法更为准确。
实验室PT法要适用于小实验室和接近患者测定场所需要利用血液来代替抗凝血浆。根据现有技术，PT分析物仅存在于抗凝血的血浆部分，而非细胞部分。据此，取决于抗凝处理和血细胞比容，一体积假定的抗凝血浆中的PT与1.5体积血液中的PT大致一样。因此，根据现有技术，维持Quick PT法或Owren PT法的测定条件分别需要混合有2体积或20体积试剂的1.5体积血液。
与Quick法相比，对于维生素k依赖型凝血因子更好的特异性和准确性是Owren PT法优势所在。虽然如此，与Owren法比较，Quick法的教导更能影响接近患者PT法的现有技术设计人员。此外，由于将血液和干PT试剂混合，大多数接近患者Quick PT法设计明显地违反了Quick PT测定条件。这能明显降低技术困难，但要冒准确性进一步减少的风险。接近患者Quick PT法的现有技术和发明状况描述于McMorrow的US 6,402,704 B1、Yassinzadeh等的US 6,103,196、Cusack等的US 5,302,348和Oberhardt的US 4,849,340中。
就接近患者PT法的总体设计趋势，例外的是November AG，Erlangen，Germany的novi quickPT法。尽管有其自己的名称，该novi quickPT法代表的是坚持Owren PT法测定条件的一种尝试。为解决接近患者法精确体积的困难，novi quick法包括了披露于Bertling等的PCT/DE99/00351和PCT/DE99/01052中的两种新型液体控制装置。其中一种是玻璃毛细管和牵引钩(hook)的组合，能将精确体积的血液添加到试剂中。该毛细管牵引钩也用于混合血液和试剂，通过牵引钩的操作来测定凝血时间。novi quickPT的设计遵循了紧密坚持准确实验室法的基本原理。但是，尽管具有独创性效果，但是精确体积的必需条件却无法广泛应用。
根据Quick和Owren法PT测定的结果通常用国际标准化比率(INR)表示。血浆INR是来自于凝血时间除以标准凝血时间的比值，NCT。为获得INR，将该比值自乘以该测定法所特有的指数。通过校准测定指数和NCT。该指数称为国际敏感指数(ISI)。或者，相对于正常血浆的PT表示的PT，在此称为PT％。Lindahl等给出了用于PT％和INR互相换算的方程式PT％＝1/(0.028×INR-0.018)和INR＝[(1/PT％)+0.018]/0.028。基于PT％和INR之间关系式的Owren型凝血酶原时间INR校准利用了标准血浆样品。服从于血栓形成和止血。类似信息见于Gogstad G.The reporting of thrombotest ininternational normalized ratio(INR).Farmakoterapi 1984；4088-92中。
在让血液PT测定和抗凝血浆PT测定结果一致的尝试中遇到的一些困难是由于血细胞比容改变所致。根据现有技术，通过利用一个或多个换算系数能让该结果一致。当血细胞比容处于正常范围时，就给出了合理结果，但当血细胞比容处于极值时，则无法给出合理结果。
血细胞比容是由血细胞组成的血容量的一部分。血细胞比容可通过使装有血液的容器受离心力作用而得到测定。之后，血细胞在容器底部形成压紧的块状物，测量其体积以测定血细胞比容。对每一个体血细胞体积测量和求和是另一种测定血细胞比容的方法。此外还有光学法。—血红蛋白的红细胞的事实，可通过光学法进行测量其光吸收以测定血细胞比容。测定血细胞比容的光学法是常规方法并值得特别注意。血细胞比容光学测定的背景和发明内容由下列出版物给出Lee等的US 6,064,474和Mendelson等的US 5,277,181。第一篇文献披露了一种用于血液血细胞比容和血红蛋白含量非侵入性测量的方法，其使用了一个或多个波长，如815nm和915nm。对波长进行选择以给出血红蛋白浓度和血浆光散射信息。第二篇文献也披露了使用双波长的方法，一个波长在约500nm处，另一个波长在约800nm处。选择这样的波长是因为，在此血红蛋白两种主要形式，氧耗尽和氧饱和的，显示出几乎相同的光吸收。
在小实验室和接近患者测定场所处，需要准确的湿化学法通过对相应血液分析以测定抗凝血浆中分析物浓度，即需要测定抗凝血浆分析物浓度而无须制备唯一的抗凝血浆，去设想或假定其存在及其相关特性。在接近患者测定场所处，需要实施的方法在某种程度上回绕着精确确定血液和试剂体积的要求。对于良好的测定可靠性而言，该方法应当使合格的对照材料，通常为具有已知或已测定分析物浓度的对照血浆和对照血清，可被测试。此外，该方法应当在校准的分析装置上进行，该装置通过分析对照样品进行定期检验，并且所使用的测量和测定装置应当进行定期维护，即保养和检验。也需要上述可行的方法。需要上述方法可以可靠进行的测量和测定装置，还需要用于该测量和测定装置的设备试剂盒。具体地说，上述的在用于监测使用维生素K拮抗剂抗凝结治疗的PT测定中都是需要的。
发明概述提供了一种通过对相应于抗凝血浆的血液和液体试剂混合物进行至少两次测量以测定抗凝血浆分析物浓度的方法。如果所述血液和所述试剂以精确确定的体积混合，所述方法也用于所述血液血细胞比容的测定。所述进行精确确定体积的方法可用于对照血浆和/或对照血清的测试。当不精确确定的所述体积混合时，所述发明也可用于所述分析物浓度的测定，如果血液的血细胞比容已知的话。
提供了对血液和试剂混合物进行两次或更多次测量的测量和测定装置。该装置包括用于执行两次或更多次测量的装置、数据处理器和用于存储计算所需数据的只读存储器。
提供了设备试剂盒。该设备试剂盒包括试剂和用于实施本发明方法的装置。每个本发明设备试剂盒都具有识别标志并优选标记失效期。包括在设备试剂盒中的试剂和装置具有与本发明设备试剂盒识别标志相关的识别标志。包括在本发明设备试剂盒中的试剂和装置具有和本发明设备试剂盒失效期相同的失效期。
发明详述本发明涉及通过对相应于抗凝血浆的血样和液体试剂混合物进行至少两次不同测量以测定所述抗凝血浆的分析物浓度的方法。该方法包括步骤a)将一体积所述血样与五倍或更多体积的所述液体试剂混合，b)对所述混合物进行所述至少两次测量，其中至少一次与所述血样的血细胞比容相关，以及其中至少一次与所述分析物浓度相关，和c)当a)中体积是精确且准确或b)中所述血样的血细胞比容是已知时，计算测量结果以测定所述抗凝血浆的所述分析物浓度。
在本发明该方面一个实施方案中，所述混合物中血液体积为血液预期体积的50％-150％，b)所述混合物中试剂体积为试剂预期体积的70％-120％，和c)当血样的血细胞比容已知时，计算结果以确定分析物浓度。
在本发明该方面另一个实施方案中，a)中所述血液预期体积为5-40μL，且所述试剂预期体积为100-1000μL，即测量不能精确地和准确地进行，则优选a)中所述血液体积为5-20μL，且所述试剂体积为150-600μL。
在本发明该方面又一个实施方案中，b)中所述的测量在具有至少4mm的最小横截面尺寸的管状容器中进行，优选最小横截面尺寸为5mm-15mm。
在本发明该方面再一个实施方案中，所述方法是用抗凝血浆校准或保证质量的，该抗凝血浆可以是已通过添加选自柠檬酸、异柠檬酸、EDTA、草酸、肝素和水蛭素的钠、钾和锂盐的抗凝剂进行抗凝处理的对照血浆。
在本发明该方面又一个实施方案中，所述抗凝血浆，其可以是对照血浆、对照血清或来自血液、或细胞、酵母或细菌培养物液体的其它对照物，选自由血清、肝素化的血浆、水蛭素抗凝的血浆、草酸盐抗凝的血浆、柠檬酸盐抗凝的血浆、异柠檬酸盐抗凝的血浆、EDTA-血浆、热处理的血浆组成的血液来源的液体以及细胞、酵母或细菌的培养液。
在本发明该方面还一个实施方案中，所述分析物浓度的测定用抗凝血校准，用抗凝血浆中已知的分析物浓度校准，该抗凝血已通过添加选自柠檬酸、异柠檬酸、EDTA、草酸、肝素和水蛭素的钠、钾和锂盐的抗凝剂进行了抗凝处理。
在本发明该方面再一个实施方案中，所述分析物选自凝血酶原时间(PT)、血纤蛋白原、血纤蛋白原降解产物、血纤蛋白降解产物(D-二聚体)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、活化凝血时间(ACT)、C-反应蛋白(CRP)、胆固醇和葡萄糖。
在本发明该方面又一个实施方案中，所述与b)中所述血细胞比容相关的测量是基于具有800nm-1100nm波长的光的一次或多次测量。
在本发明该方面另一个实施方案中，b)中所述两次或多次测量是在18℃-40℃的室温下进行。
在本发明该方面还一个实施方案中，a)中所述的试剂含有0.1g/L或更多的血纤蛋白原。
在本发明该方面还一个实施方案中，所述分析物浓度为用INR表示的PT，其中，在所述抗凝血浆分析物浓度测定之前，分析物浓度用PT％再表示。
在本发明该方面再一个实施方案中，a)中所述混合物的凝血时间是与b)中所述分析物浓度相关的至少一次测量的之一。
除天然血液之外，很清楚本发明方法中使用的血样可以是对天然血液进行操作使之含有添加物，例如抗凝剂、杀菌剂和药物，或已除去除红细胞的血红蛋白外的血液成分。
本发明的另一方面涉及用于对血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品进行测量的测量和测定装置，包括，优选在家中的，a)用于容纳含有具体批次液体试剂容器的座，该容器容有在装置运转中用于与所述液体试剂混合的所述样品之一，b)能量来源，c)数据处理器，d)包含有用于一种或多种所述血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品混合物的计算数据集的只读存储器，每一计算数据集适用于所述的具体批次，e)用于对每一混合物进行两次或多次测量的测量装置，f)显示用户指令和基于来自d)和e)数据计算结果的显示器，和g)用于用户控制装置的控制装置，优选按钮。
本发明的又一方面是涉及标有识别标志的设备试剂盒，包括用于对血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品进行测量的测量和测定装置，以及在每个都标有与所述设备试剂盒的所述识别标志相关的识别标志的容器中一种或几种液体试剂。
附图简述

图1是显示血细胞比容测定的图，其中血液血细胞比容(HCT)对光吸收作图。实心方块是来自将10μL具有已知HCT的不同血液添加到3501μL的PT试剂中。实心三角形是来自将不同体积的具有44.0％的已知HCT的血液添加到上述PT试剂中。
图2是显示假定的PT分析物容量的细胞容积级分的图，其中细胞容积级分对两组抗凝血样，低HCT组(实心三角形)和高HCT组(空心方块)，假定的抗凝血浆INR(％)作图。
图3a是显示根据现有技术的PT的图，在此所测定的血INR对已知血浆INR作图并进行线性回归分析。分为三组低HCT组、高HCT组和中HCT组。中HCT组用作校准物。
图3b是显示根据本发明的PT的图，在此利用假定的抗凝血浆INR测定的PT得到测定并对利用抗凝血浆的INR测定的已知PT作图。凝血时间值和分组与图3a中一样。
图4是根据本发明的测量和测定装置实施方案的示意图。1A是以一个角度插入到装置容器座的容器的侧视图，1B是该容器的顶视图，带有用于添加血液、混合血液和试剂以及钩住检测血凝块的开口。2是来自940nm LED光束的横截面，3是容器座中的空腔，所述空腔容纳有热敏电阻用于测量室温，4是一块木头，带有用于形成容器座和光路的钻孔，5是电开关的按钮。在仪器内部是9V电池、电子电路和可编程集成计算机，PIC。
图5a和5b显示的是根据本发明的测量和测定装置实施方案的照片。
附图详述图1.血细胞比容的测定。血液血细胞比容(HCT)对光吸收作图，即仅穿过试剂透射的光(lo)与穿过血液和试剂混合物透射的光(l)的比值。数据来自表1。实心方块是来自将10μL具有已知HCT的不同血样添加到350μL的PT试剂中。实心三角形是来自将不同体积的具有44.0％的已知HCT的血液添加到上述PT试剂中。
图2.为确定含有与血液细胞容量级分相同PT活性的血浆容量，方程式9中的b，用于测定PT假定的分析物容量，根据本发明方法通过利用不同的b值测定的抗凝血浆INR间的差异，以及通过准确的实验室法测定的抗凝血浆的已知INR，对b作图。显示的是两组抗凝血样的结果，低HCT组(实心三角形)和高HCT组(空心方块)。由于计算中的缺陷，根据本发明方法测定中的差异表现为误差。在约0.29的b值处，两组的误差处于最小值。在血浆容量和29％的细胞容积之和上确定抗凝血中假定的分析物容量。
图3a.根据现有技术，利用抗凝血和PT试剂混合物的凝血时间测定了用IRN表示的抗凝血浆的PT。一组40个样品的抗凝血，所有具有已知INR的其抗凝血浆都考虑到了。样品的HCT也是已知的，使该组样品被分为三组低HCT组、高HCT组和中HCT组。中HCT组的样品用于校准。测定的INR对已知的INR作图并进行线性回归分析。低HCT组显示了低的血液INR(实心方块)，高HCT组显示了高的血液INR(实心三角形)，以及中INR组显示了居中的血液INR(空心圆圈)。
图3b.也根据本发明方法，即根据本发明测定的抗凝血浆的PT。分析了相同的具有已知抗凝血浆INR的40个抗凝血样样品组。对于每个血液和PT试剂的混合物进行了两次测量，凝血时间和吸光度。凝血时间值和分组与图3a中的一样。根据本发明方法，将INR值对抗凝血浆已知的INR值作图。对于所有的三个组，目前所测定的INR值与已知的INR值大致一样，这表明本发明方法是有用的。
图4.显示了根据本发明的测量和测定装置当前优选的实施方案的示意图。该图特征在于1A)容器侧视图，10mm直径的聚苯乙烯管以一个角度插入到该装置的容器座中，1B)容器顶视图，带有用于添加血液、混合血液和试剂以及钩住检测血凝块的开口。2)来自940nmLED光束的横截面，所述光束穿过容器壁到达光电二极管，3)容器座中的空腔，四周用成型的油灰(dough)填实，所述空腔容纳有热敏电阻用于测量室温，4)一块木头，带有用于形成容器座和光路的钻孔，5)用于操作者与装置互动的电开关按钮，即启动光测量，开始和停止计时以及启动计算和访问测定值。在仪器内部是9V电池、电子电路和可编程集成计算机，PIC。该PIC通过液晶显示器(LCD)界面与操作者互动。PIC测量时间，将测量的光强度和温度进行模拟-数字转换。该PIC也进行所有必需的计算以测定根据本发明假定的抗凝血中血液的PT。
图5a和5b显示了根据本发明的测量和测定装置实施方案的照片。图5a显示了添加样品到容器座上容器中的试剂中。图5b显示了在样品是抗凝血浆的情况下，显示器上的测定结果。该装置能自动发现样品应该是血液这一情况，这将事先得到显示。样品差异是基于对与血细胞比容相关的混合物测量的结果。
当提供数值范围时，很清楚每一居中值，除非上下文另有明确规定，精确到下限整数值的十分之一，在该上下限范围之间，并且任何其它规定的范围或在规定范围内的居中值都在本发明范围内。
必须指出在此使用的和在附加的权利要求中，除非上下文另有明确规定，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象。因此，例如，涉及的“一种试剂”包括上述试剂的复数，以及涉及的“该装置”包括所涉及的一种或多种装置及本领域技术人员公知的其等价物等等。
除非另有规定，所有在此使用的技术和科学名词具有相同的含意，如同本发明所属领域普通技术人员所通常理解的。尽管类似或等效于在此描述的任何方法或材料也可以用于实施或测试本发明，但现在描述了优选的方法和材料。所有在此提及的出版物此处引入作为参考以公开并描述与所引证的出版物相关的方法和/或材料。
在此讨论的出版物只提供其在本申请申请日之前的公开内容。在此并不被认为是一种许可，由于在先发明，本发明并不被授权先于上述出版物。此外，所提供的公布日可能不同于实际的出版日期，可能需要单独进行核实。
在本发明的进一步描述中，首先描述了本发明方法。其次，提供了本发明装置的描述，后面是本发明试剂盒的描述，其包括在本发明装置中。
方法一种剖视本发明方法的方式如下。通过对相应的血液和液体试剂混合物进行两次或更多次不同的测量测定血浆中分析物浓度。至少一次测量应当与血液的血细胞比容相关，以及至少一次测量应当与血液的分析物浓度相关。通过计算测定的抗凝血浆的分析物浓度，即如果抗凝血浆已制备自血液并且这些抗凝血浆已通过对照法或准确的实验室法进行了分析物浓度测定，通过它们给出的事先应获得的结果，在数学上对测定值加和。以下具体披露了如何进行测量，测定值被加和以给出期望的结果—抗凝血浆的分析物浓度。
如果测量值随血细胞比容改变而变，该测量与血液的血细胞比容相关。具有不同血细胞比容的两个血样有助于给出至少一次不同的测量的测量值中的差异，并且对于具有不同分析物浓度的两个血样也是一样的。所需要的相关性不必是线性的，也不必是理想的。强线性相关将便于发现测定值的数学组合，以给出良好的抗凝血分析物浓度的测定或评估，但非线性和较不强的相关也可能提供给本发明一种有用的作法，当然是要在本发明的范围内。上述推论的结果是任何与血细胞比容相关的血液分析物浓度或水平，如血红蛋白浓度或细胞膜浓度在实施本发明方法中可以互换用于血细胞比容而不背离本发明的精神。
本发明方法可在小实验室或接近患者场所处实施。取决于本发明方法的实施，用于帮助本发明实施的程序将有所变化，作为实施不同的本发明方法的先决条件。因此，在本发明方法的描述中，如果在小实验室或接近患者场所处实施，只要相应的也是如此就要指出。以下，相应地用于本发明方法实施与分析物浓度测定与血液有关的抗凝处理信息首次描述了。其次是抗凝血中分析物性质的相关信息。继之以在小实验室和接近患者场所处实施本发明方法的概述，以及本发明方法的进一步详述。通过对相应的血液混合物进行测量以测定抗凝血浆中分析物浓度，对血液进行抗凝处理效果的相关信息是有用的，与抗凝血中分析物性质相关的信息同样有用。
在血液和试剂混合物测量中适量抗凝剂对该测量的影响应该是可忽略的。对血液和试剂混合物的测量应产生与对血液和已添加适量抗凝剂的试剂但其他一切是相同的混合物测量的相同结果。这并不是实施本发明绝对的必要条件，但其提供了本发明优选的实施方法，其中该方法是用抗凝血样、抗凝血浆样品等进行校准并确保精度的，通过对照法或准确的实验室法已获知这些生物流体的分析物浓度。对适量抗凝剂的不敏感性也使得抗凝血浆样品能用作为对照，对其定期分析对于确定本发明方法实施的可靠性是重要的。
在本发明方法实施中，分析物可视为在细胞容量和抗凝血血浆容量之间分布的。假定的抗凝血分析物容量的概念描述了该分布。该假定的分析物容量Vh是一种设想或假定的包含所有分析物并且具有与抗凝血浆相同的分析物浓度的血液或抗凝血的容量。该Vh一般较血液或抗凝血的血浆容量大，这是因为具有分析物浓度的抗凝血的细胞溶来容量大于零。在本发明方法实施中，Vh根据血液的特性来确定，简而言之或者是事先已知的或者是通过实施本发明方法测定的。血液的这些特性是容量和血细胞比容，以及可能的分析物浓度。Vh和血液已知或测定的特性之间的关系是独立测定的且在本发明实施之前就已知了。对于分析物浓度PT，用作实施例描述了本发明，Vh通过血浆容量和29％的抗凝血细胞容量之和确定，见实施例2。在实施本发明方法中，抗凝的血浆容量和细胞容量利用血容量和血液血细胞比容得到测定。
在本发明方法的小实验室实施中，血液预期体积和试剂预期体积的分配具有良好精确度。血容量是预期的血容量，试剂体积是预期的试剂体积。因此，所测定的血液血细胞比容值和血液分析物浓度值是真实值。抗凝血浆中分析物浓度可以根据血液中分析物浓度和抗凝血的Vh来确定，如下详述。
在本发明方法的接近患者实施中，血液预期体积和试剂预期体积并没有很好地得到精确分配。血容量亦非所预期的血容量，而试剂体积也不是所预期的实际体积。因此，所测定的血细胞比容值和分析物浓度值并不是真实值；因此它们被称为表观值。为将未知的血容量和表观的分析物浓度转换为真实的对应值，血液的血细胞比容应当是已知的。知道血液真实血细胞比容是本发明方法接近患者实际操作的先决条件。已知和表观的血细胞比容值用于测定真实的血容量。真实的血容量和真实的血细胞比容则用于测定Vh。通过利用Vh和所测定的(表观的)分析物浓度测定假定的抗凝血浆的分析物浓度。或者，测定真实的分析物浓度，并通过利用该值、真实的(已知的)血细胞比容和预期的血容量测定假定的抗凝血浆中分析物浓度。
对于措词‘预期的’，在上下文中预期的血容量和预期的试剂体积指血液的理想体积以及试剂的理想体积，根据试验方案，它们互相混合。在小实验室环境中，获得的该预期的体积具有足够的精确度。在接近患者环境中，血液体积和试剂体积大概在该预期值得50％-150％。对于这两个体积，该范围并不是必然一样的，且该范围也不是必然对称分布在该预期值周围。因为混合物的组合总是或多或少地不定，所以通过分析混合物分别测定的血细胞比容和分析物浓度可能总被认为是血液的表观血细胞比容和血液的表观分析物浓度。本发明方法的实施者应当回答的问题是达到的血液和试剂的预期体积是否具有足够的精确度。如果该回答是没有，那么对于根据本发明方法分析物浓度的测定需要血液的血细胞比容值。在本说明书中，本发明方法的小实验室实施假定达到预期的体积而接近患者实施假定没有达到预期的体积。
在本发明方法实施中，血液和试剂混合物组合的改变被视为由于血容量改变而带来的改变。试剂体积被假定为预期的。在本发明方法的接近患者实施的真实血容量测定中该假设是关键的。该假设的基础是在血液和试剂混合物中仅有血液浓度对分析物浓度测定产生影响。通过两个推理过程证明这是正确的。一个是在所使用的测定条件下试剂浓度是相对固定的。另一个是试剂被设计为以便其在反应混合物中的浓度几乎不影响测定反应，并因此几乎不影响测定的分析物浓度。根据本发明，试剂体积较血容量大五倍或更多。在极值处，反应混合物中的试剂浓度是5/(5+1)或0.83(83％)。如果试剂体积减少到预期体积的50％，试剂浓度变为2.5/(2.5+1)或0.71(71％)。因此，在五倍极限处，试剂体积减少50％仅导致试剂浓度减少14％。试剂预期体积对预期血容量的比值越高，效果则越小。此外，带有过量活性物质的试剂以及在反应混合物中的反应几乎不受试剂浓度的影响。试剂体积与预期体积的偏差可能会以三种方式影响反应混合物。其可能改变混合物的试剂浓度，改变混合物总体积以及改变混合物的血液浓度。这些改变中的两种并不重要试剂浓度改变和总体积改变。仅有的改变，也就是说重要的改变是血液浓度的改变。血液和试剂混合物的总体积改变值得更加注意。理论上，总体积并不影响分析物浓度测定。只要组合是相同的，小体积和大体积就具有相同的分析物浓度。但是实际上存在着限制。在很大体积下，容器可能溢出。而在很小体积下，测量无法进行。不超过总体积可以改变的极限，就不影响测定，应当对本发明方法的每种方法都确定该极限。
对血液和液体试剂混合物进行的两次或更多次测量可以是现有技术所包含的任何类型的测量。该测量可以是电磁的、电的、磁的、流变学的、测热学的、化学计量的或时间的。电磁测量包括各种各样的电磁辐射测量可见的紫外线的、红外光、微波、无线电波等等。电测量包括各种各样的电学现象测量例如电阻、阻抗、电压、电流和电容。热测量包括温度和相关分析物。化学计量测量包括各种各样的计数细胞计数和放射性核素裂变计数等等。在优选的实施中，对每种分析物选择一种测量法，但这决不是必要的。两次光学测量，如在两个波长处测量，可以线性组合以获得两种分析物浓度测定。或者，在相同波长处进行两次或更多次的光学测量，但时间要分开，可用于测定两种分析物浓度。混合物中两次发生事件之间的时间是上述的一种测量。测定两种分析物浓度需要两次或更多次测量，而测定三种分析物浓度需要三次或更多次测量，等等。在本发明方法的实施中，基于流变学现象对混合物进行光学测量和时间测量。光学测量用来测定血细胞比容，流变学测量用来测定PT。凝血时间使用流变学测量得到测定。凝血时间可用于测定任何促凝的分析物浓度例如活化部分凝血酶原时间(APTT)或活化凝血时间(ACT)。
在本发明方法中，短语‘分析物浓度’属于为物质的任何一种特性，也就是说与一些可检测的或设想的每一体积单位实体份数的数量相关。因此分析物浓度实际上是化学计量的。血液中分析物浓度测定与上述每单位体积血液的实体份数数量测定有关。如果血液是稀释的，则分析物浓度下降。这并不一定适用于给定表达方式的分析物浓度。给定表达方式分析物浓度并不一定与一些可检测的或设想的实体浓度成比例。一个例子是酸度。酸度是一种与设想的每单位体积H+离子数量相关的分析物浓度。酸度通常用pH表示。显然pH表示的酸度并不与H+离子的浓度成比例。通过非成比例表示的分析物浓度可以再表示为成比例的。例如，通过pH表示的酸度可以通过对pH取10次方再表示为酸度，也许能变成为成比例的。分析物浓度的另一个例子是凝血酶原时间(PT)。该分析物与凝血因子的浓度有关，特别是与凝血因子II、VII和X有关。因此，PT的测定可视为分析物浓度的测定。PT通常所使用的表示方式是凝血时间和INR。通过凝血时间或INR表示，PT浓度并不与凝血因子的浓度成比例。对于本发明方法的实施，重要的是按比例表示的血细胞比容；在本发明方法实施中，其它分析物浓度测定可以通过任何成比例的或不成比例的表示方式表示。某些测定程序，特别是在此所公开的计算程序需要按比例表示的分析物浓度。为确定按比例表示的分析物浓度，应当检测所测定的表观分析物浓度与反应混合物中血液浓度是否成比例。表1中的实验数据提供了对血细胞比容这样的一种检测。
在本发明的接近患者实施中，按比例表示的分析物浓度提供了对血液中分析物浓度直接了当的测定。如果血液中表观的和真实的分析物浓度分别是At和Aa，则表观的和真实的(已知的)血细胞比容分别是HCTa和HCTt。以下应用了
At＝Aa×HCTt/HCTa 方程式1血液中真实的分析物浓度和真实的血细胞比容足以测定抗凝血中分析物浓度，因为在那时血容量可以假定为预期的。
如果分析物浓度并不按比例表示，则根据以下方程式计算可用于测定真实的血容量Vbt＝Vbi×K×R/(R-K+1) 方程式2真实的和预期的血容量分别是Vbt和Vbi。K是HCTa与HCTt的比值，R是预期的试剂体积Vri与预期的血容量Vbi的比值。
为检测分析物浓度是否按比例表示，血液和试剂混合物中的血液浓度是必须的。其与混合物中的其他浓度可用下列方程式来测定X＝(Q+Q×R)/(Q+R) 方程式3在方程式3中，R是Vri/Vbi，同样地在方程式2中，Q是Vb/Vbi。方程式3给出了标准化的浓度值，即当Q为1时浓度值为1(100％)。当R趋向于无穷大时，方程式3得出X等于Q。在通过利用不同体积的几种校准血样以覆盖大范围的血细胞比容值的血细胞比容校准中，方程式3是方便使用的，见实施例1。在本发明方法目前优选的实施中，R是35。在该条件下，X和Q之间的差异仅在高Q值处明显。
一种常用的测定假定的抗凝血浆分析物浓度App的方法是通过使用假定的分析物容量Vh的概念，详述如下。根据表示为抗凝血浆中分析物浓度的抗凝血中分析物浓度测定血液中分析物浓度。为做到这一点，使用适量的在其抗凝血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血校准物校准分析物浓度测定。这些校准物具有已知的平均假定分析物容量Vhm。适量的校准物是在进行了假定的抗凝处理后血液的预期体积。测定的分析物浓度对Vh的函数关系是作为dA/dVh微分建立的。测定了血液中分析物浓度Ab及其相关的Vh。在假定的抗凝血浆中所期望的分析物浓度App获得自App＝Ab+∫(dA/dVh)×dVh 方程式4从Vh到Vhm积分。在实施例3中，根据方程式4测定App。在实施例中，微分通过ΔA/ΔVh近似，即通过将A，(A2-A1)中的宏观改变除以Vh，(Vh2-Vh1)中的宏观改变。
在某种程度上，分析物浓度随用于其测定的方法而变。因此，方法的特征通常是要标明的。一个例子是分析物浓度—血细胞比容。血细胞比容可以通过测量血细胞体积或通过测量光得到测定。取决于所使用的方法，分析物浓度可以被分别认为是测定体积的血细胞比容或测量光度的血细胞比容。如果对所使用的方法没有意见，则该解释可以扩宽或缩窄。缩窄的解释是对照法已经使用了。扩宽的解释是任何已知的方法已经使用了。在本发明方法中，短语‘分析物浓度’应当解释为扩宽的，最不受限的方式。在本发明方法的上下文中，如果血液进行了假定抗凝处理并且在该抗凝血浆中测定分析物浓度，短语‘在假定抗凝血浆中的分析物浓度’指通过任何方法所获得的分析物浓度。上述假定的措辞仅仅表明该物质不在手边，未被制备，仅仅是设想的。在本文的许多地方中，其已被省略。增加其是为了澄清，但或许失去了其目的。在检验本发明方法准确性和精确度的优选实施中，通过准确的实验室法测定抗凝血浆中分析物浓度。通过实施本发明方法测定的假定的抗凝血浆中分析物浓度并不一定与该值一致。如果对实际抗凝血浆测定事实上已进行的话，本发明方法的精神或要点是通过实施本发明方法测定抗凝血浆分析物浓度获得的值接近于应已获得的值。
在本发明方法中，血细胞比容通过任何已知能测定血细胞比容的方法得到测定。在优选的实施中，血细胞比容通过测量800nm-1100nm波长的透射光而得到测定。使用具有已知血细胞比容值的血样对血细胞比容测定进行校准。该血细胞比容值通过准确的实验室法获知。如上所指出的，为实施本发明，测量值不必被转换为血细胞比容，它们可以转换为与血细胞比容相关的其它分析物浓度或水平，或者它们根本就不需要转换。
在本发明方法中，短语‘(假定的)抗凝处理对血容量和血细胞比容的影响’属于该处理特有的或一般的影响。
三种类型的抗凝处理是临床诊法中通常使用的，用EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝。这些处理中的两种，用EDTA抗凝和用肝素抗凝，对血容量和血细胞比容仅具有很小的作用。作为通常所采用的柠檬酸盐抗凝处理则具有明显的效果。标准的柠檬酸盐抗凝处理包括增加一体积的0.11M或0.13M三柠檬酸钠到九体积的血液中。这影响了总血容量和血细胞比容。柠檬酸盐溶液可能导致血细胞张力过高和收缩，必须要考虑。如果施加柠檬酸盐到具有一体积Vb和血细胞比容HCT的血液中抗凝，抗凝血体积及其血细胞比容，Vbcit和HCTcit分别由如下方程式给出Vbcit＝Vb×10/9≈1.111×Vb 方程式5HCTcit＝HCT×9/10≈HCT/1.111方程式6该假定的抗凝血的血浆容量和细胞容积，Vpcit和Vccit分别由如下方程式给出Vpcit＝Vb×(1.111-HCT) 方程式7Vccit＝Vb×HCT 方程式8如果已知血细胞出现x％收缩，则血细胞比容减少x％并且血浆体积增加了细胞所缩小的体积。
在本发明优选的实施中，使用适量在其抗凝血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血校准物校准血液中分析物浓度测定。在校准程序中，对于每一校准物相应的血液，血细胞比容值获得自该校准物可被测定的血细胞比容。该血细胞比容提供了对每一校准物假定的分析物容量的测定，详述如下。例如，如果本发明方法要在具有10μL预期的血容量和350μL预期的试剂体积以及假定的抗凝处理是柠檬酸盐抗凝上进行，则根据方程式4，该方法通过利用11.11μL的柠檬酸盐抗凝血校准。获得了校准物的表观血细胞比容。因为已使用的是11.11μL而非预期的10μL，校准物血细胞比容非常接近于表观血细胞比容除以1.111的值。为了达到最好的准确性，表观血细胞比容应当除以方程式3的标准化浓度。代1.111的Q和35的R产生了标准化浓度，1.108的X值。
测定假定的分析物容量需要可通过独立实验获得的数据。抗凝血假定的分析物容量Vh是包含所有分析物以及具有与抗凝血浆相同浓度的体积。在本发明优选的实施中，Vh模型是血浆容量和抗凝血的血细胞容量级分之和。如果级分是b并且抗凝血体积为Vab，抗凝血的血细胞比容是HCTab，则Vh给出自Vh＝Vab×(1-HCTab+b×HCTab) 方程式9对于柠檬酸盐抗凝而言，根据方程式5和6，Vab和HCTab获得自血容量Vb和血液血细胞比容。在独立实验中确定了级分b。实施例2描述了使用柠檬酸盐抗凝血和分析物浓度PT进行的这样实验。在该情况下b被认为是0.29。
如果血液中分析物浓度测定已用适量的在抗凝血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血校准物校准，如上所述，所测定的血液中分析物浓度Ab等于假定的抗凝血中分析物浓度，只要其Vh等于该校准物的平均Vh，Vhm。如果Vh不同于Vhm，且分析物浓度按比例表示，假定的抗凝血浆中的分析物浓度App可通过下列表达式测定App＝Ab×Vhm/Vh 方程式10因此，如果分析物浓度按比例表示且假定的分析物容量概念为平均值，则所期望的结果App能方便地获得。如果分析物浓度并不是按比例表示的，则其可以再表示为成比例的。真是那样要求的话，之后方程式9因此能得到应用，分析物浓度可又再表示为最初的表达式。上述所描述的获得假定的抗凝血中分析物浓度的程序恰恰是许多通过实施本发明方法能获得的假定的抗凝血浆中分析物浓度的可能程序中的一个例子。本发明方法的实施利用了一些表达式测定血液血细胞比容和血液分析物浓度。很明显从上可知，表达式取决于校准程序和校准物。无论是哪一种表达式，本发明方法的实施提供了一种抗凝血浆中分析物浓度可被测定的方法，而无须制备抗凝血浆。
值得注意的是，在超出一些分析物浓度的范围外，成比例表示总是可以获得。血液的分析物浓度或较好地在血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血在一些表达式或在测定抗凝血分析物浓度中失效的程序中总是可以得到利用的。通过改变抗凝血体积和将抗凝血浓度，方程式3的X，对分析物浓度表达式作图，通过给定的表达式抗凝血浓度可以表示为分析物浓度的函数。在分析物浓度范围内，其包括了抗凝血浓度1，在此抗凝血浓度随着分析物浓度连续地或升或降，分析物浓度的函数被定义为该分析物浓度的比例表达式。
在本发明方法的小实验室实施中，血容量是已知的，因为其为预期的血容量。所测定的表观血细胞比容和表观分析物浓度是血液真实的血细胞比容和真实的分析物浓度。利用这些血液的真实值，测定了抗凝血中分析物浓度。在本发明方法的优选实施中，用在其抗凝血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血校准物校准分析物浓度测定，如同通过准确的实验室法所测定的。测定这些校准物与校准相关的血细胞比容。因此获知了校准物平均血细胞比容以及血液血细胞比容。通过利用所测定的血液分析物浓度、血液血细胞比容和校准物平均血细胞比容，测定了假定的抗凝血中期望的分析物浓度。假定的分析物容量的概念对于该测定是有用的。根据所期望的结果可从血液血细胞比容和血液分析物浓度获得，存在着无数程序上的改变。为了使给出这种可能性的概念，提供了例子。另外，需要将血液的已知分析物浓度和血细胞比容转换为假定的抗凝血浆的分析物浓度的数据可能有许多种形式，如以表格的形式或以两个或更多个可变函数的形式。
在本发明方法的接近患者实施中，(假定的)抗凝血分析物浓度测定以类似于小实验室实施来进行。不同之处在于事实上血液和试剂预期的体积无法实现。因此，血液和试剂混合物的组成是不精确的。为弥补该缺陷，血液的血细胞比容应当是已知的。由于有已知的或真实的血细胞比容HCTt以及测定的表观血细胞比容HCTa，通过利用方程式2测定了真实的血容量。由于有真实的血容量、真实的血细胞比容值以及相应的(表观的)分析物浓度，假定的抗凝血浆中的分析物浓度得到测定。进行该测定优选的方法是通过利用如上所述的假定的分析物浓度的概念。如上所指出的，存在着许多进行该操作的方法。方程式3提供了一种可能性；表格和多变量函数是另一种可能性。如果分析物浓度成比例表示，则假定的抗凝血浆中分析物浓度的测定是直接了当的。方程式3给出了真实的分析物浓度。通过利用方程式9和假定的分析物概念，真实的分析物浓度值、真实的(预期的)血容量和真实的(已知的)血细胞比容用来测定假定抗凝血中期望的分析物浓度。在本发明方法的接近患者实施中，通过对血液和试剂相同的混合物进行两次或更多次测量，测定表观的血细胞比容和表观的分析物浓度是关键的。共同的混合物将血细胞比容值和表观的分析物浓度值连接起来，使得期望的测定可以发生。除必须做的之外，测定要便于进行。
存在着许多适于利用本发明方法测定的医学诊断分析物浓度。这些分析物浓度包括，但不限于，包括凝血酶原时间(PT)、血纤蛋白原、血纤蛋白原降解产物、D-二聚体、活化部分凝血酶原时间(APTT)、C-反应蛋白(CRP)、胆固醇和葡萄糖的一组分析物浓度的分析物浓度。
抗凝血浆将被解释为宽的含义。其包括所有类型的获得自血液的非凝结液体，被用作分析物浓度测定的样品。所述液体包含在下面组的液体中，但不限于该组中的成员。该组液体由血清肝素化血浆、用水蛭素防凝血浆、草酸盐抗凝的血浆、柠檬酸盐抗凝的血浆、异柠檬酸盐抗凝的血浆、EDTA-血浆和热处理过的血浆组成。
在本发明方法的实施中，血液可以进行(假定的)抗凝处理，包括添加选自柠檬酸、异柠檬酸、EDTA、草酸、肝素和水蛭素的钠、钾和锂盐的抗凝剂。
在本发明方法中，对血液和试剂混合物进行的两次或更多次测量视为在18℃-40℃的室温下进行的。为达到这一点，校准在该提及范围之内的一些温度下进行，并且校准参数被确认为是温度函数。
在本发明方法的小实验室实施中，除期望的假定抗凝血分析物浓度之外，获得了血液的血细胞比容。该血细胞比容值可用来增加分析物浓度测定的可靠性。该值可与参考值或先前所测定的值相比较。如果血细胞比容值是不合理的，可作为分析物浓度测定不合格的依据。
在接近患者场所处，大多数包含在已知血细胞比容值中的信息被用于确定与预期体积的试剂混合的血液体积和/或真实的分析物浓度。然而，一些极值可能建立在HCTa和HCTt之间最大的差异上。这样的极值可用来增加分析物浓度测定的可靠性。越出允许范围的差异能使分析物浓度测定不合格。同样地，随着时间过去的重复测定能给出具有偏差的患者血细胞比容的指示，于是需要重新测定。
PT是通过实施本发明方法可在假定的抗凝血浆中测定的分析物浓度。通过对血液和试剂混合物的一次或多次测量测定了用INR表示的PT。通过将非比例INR表示的PT成比例的表示为PT％，测定通过再表示的PT可容易地进行。其可通过方程式PT％＝1/(INR×0.028-0.018)进行。然后，通过一些可选择的程序测定假定的抗凝血浆的PT％。在公布假定的抗凝血浆PT之前，用PT％表示的PT可再表示为用INR表示的PT。通过使用所提及函数的反函数INR＝[(l/PT％)+0.018]/0.028做到这一点。PT的再表示不是必须的。在实施本发明的优选程序中，不进行PT的再表示。假定抗凝血浆中的PT通过利用INR表示的PT和血液血细胞比容测定。这样的程序可能是优选的，因为它们包含很少的计算。
目前工作的主题将进行修改以更好地适应进行接近患者试验所需要的湿化学法。根据规定，湿化学测定需要样品在试剂中稀释。在本发明方法的所有实施中，样品是血液并且最小的稀释度是五倍。为通过光透射测定血细胞比容，血液的稀释度必需避免短的光程长度。短的光程长度意味着用于血液和试剂混合物的容器小的入口尺寸，其干扰了本发明方法的实施。本发明方法预期的实施包括手工步骤，如血液和试剂的接触和混合，以及试样容器尺寸的必要调节。容器入口尺寸小于4mm就使得该手工步骤不能实行乃至根本就不可能进行。在本发明方法优选的实施中，使用了带有8mm圆形截面的管状容器。在管状容器中可接受的横截面即光程在4-16mm。同样地血样体积也有其的应用极限。在实施本发明方法中，血液的预期来源是戳指尖、人工获取血液并将其转移到容器内的试剂中。血样应当在5μL-40μL。容器尺寸和试剂体积瘀血容量的比值限制血容量在100μL-1100μL。就以下所要解释的，仅在有限的800-1100nm波长范围内光线是可接受的。在最优选的实施中，管状容器的横截面尺寸在5mm-15mm，血容量在5mL-20mL，试剂体积在150μL-600μL。
在本发明方法优选的实施中，通过测量穿过血液和试剂混合物透射的光强度测定血细胞比容。在目前最优选的实施中，也测量了仅穿过试剂透射的光强度，血液血细胞比容确定自所测量的穿过试剂透射的光强度和穿过血液和试剂混合物透射的光强度的比值。通过该优选的实施，有助于消除实验偏差。偏差可能是来源于光源、试剂的光学性质或容器的光学性质。在优选的实践中，光波长在800nm-1100nm。该光位于光谱的近红外部分，几乎无法为人眼所检测到。该波长范围内的光是优选的，这是因为氧饱和和氧耗尽形式的血红蛋白对其的吸收不相上下，且吸光度相对较小。低吸光度是重要的，因为其提供了使用相对长的光程长度，如在本发明目前最优选的实施中用作容器的透明塑料管的直径，8mm。在超过1100nm的波长处，水对光的吸收明显增加了血细胞比容光学测定的困难。在800nm以下波长处，在600nm-800nm，两种所提及的血红蛋白形式吸收不同，籍此导入了误差来源。在更短的波长处，血红蛋白的吸光度非常强的。这不是排除了优选的4mm或更大的光程长度，就是迫使血液在试剂中进行过度的稀释。
在本发明方法的实施中，预期体积血液和预期体积试剂的混合物能以多种不同的方法获得。其落入本发明范围内，血液可以首先被稀释，如在9g/L的氯化钠中，然后与试剂混合。或者，试剂可分成几个组分，如第一组分、第二组分等。在本发明方法的实施中，试剂体积与血容量最终的比值是关键的。血液和试剂的接触是当血液和试剂之间反应所必需的最后组分增加时发生的。
凝血酶原时间(PT)是通过本发明方法的实施可以在假定的抗凝血浆中测定的分析物浓度。在下列应用的优选实施中。血液和PT试剂的接触意味着为凝结反应所必需的最后组分开始添加入血液和PT试剂的混合物中。该接触确定了凝结反应的开始和测量时间的开始。当首次检测到血凝块时，停止时间测量并获得凝血时间。根据现有技术，任何用于测定凝血时间的方法都可用于本发明实施中凝血时间的测定。这些方法包括通过流变学、机械学和光学手段对血凝块的检测。在优选的实施中，该血凝块通过牵引钩检测。通过该手段提供了简单自动化的血凝块检测。当凝块安装在牵引钩杆上并从透过容器的光束处除去时，到达检波器的光强度明显增加了。这些大量增加的光强度是容易得到检测并且可用于自动记录凝血时间。其优于用具有已知血浆INR值的抗凝血校准的PT测定。通过准确的Owren PT实验室法测定血浆INR值，是优选的。通过Quick PT实验室法测定的血浆INR值也可以使用，但需要大量的样品以获得可比较的准确性。
装置提供了用于进行本发明方法的测量和测定装置。本发明装置包括，1)数据处理器，2)只读存储器，3)血细胞比容校准数据，所述血细胞比容校准数据存储在所述只读存储器中，4)所述分析物校准数据，所述分析物校准数据存储在所述只读存储器中，5)对血液和试剂混合物进行两次或更多次测量的装置。
数据处理器可进行血液血细胞比容、血液分析物浓度以及假定的抗凝血浆分析物浓度测定所必需的所有计算。血液血细胞比容及血液分析物浓度测定所必需的校准数据存储在与处理器相关的只读存储器中。在某种意义上只读存储器是一种功能性只读存储器，操作人员无法改变所存储在只读存储器中的数据。只有厂商能将数据存入只读存储器中。与使用者相关的一类数据可为该使用者或医疗中心工作人员所存入。这类数据涉及个体血液、血液所属个体身份、日期以及时间和位置的信息。
一个本发明装置优选的实施方案，特征在于容器座中插入了装有血液和试剂混合物的管状容器。当在适当位置时，管状容器的纵轴和地球重力方向可形成一个25-65度的角度。在优选的实施中，容器是其中凝血时间能通过牵引钩进行测量的塑料管。当血凝块安装在牵引钩杆上时，如果容器倾斜则能更容易地移动。血凝块仅需要升起一部分，如同如果该容器是垂直的情况一样升高以抗地球重力场。这有助于更可靠的手工或自动测量凝血时间。在优选的实施方案中，与地球重力场方向相比管状容器倾斜25-65度。
试剂盒提供了用于假定的抗凝血浆分析物浓度测定的设备试剂盒。本发明试剂盒单独标记有识别标志，其标明每个试剂盒所属批次。本发明试剂盒包含试剂和本发明装置。本发明试剂盒的每个试剂盒都包含用于进行本发明方法的试剂。本发明试剂盒的每个试剂容器都具有识别标志，其与本发明试剂盒的识别标志相关。每个本发明试剂盒都包含一个或多个本发明装置。在一个本发明试剂盒中的每个本发明装置都具有识别标志，该识别标志与本发明试剂盒上的识别标志相关。每个本发明试剂盒都标有失效期；相同的失效期适用于包含在每个本发明试剂盒中试剂和本发明装置。在上下文中，‘相关的识别标志’意味着这些识别标志在某些方面是相同的。识别标志可以是相同的，或可以具有共同的特征，即标明它们属于一组。试剂盒的识别标志是其批号或其功能等价物。相关的识别标志可以是相同的批号或功能等价物，就试剂盒而言，或是批号或是功能等价物包含了相同的数字和字母符号串等等，以标明该试剂盒、试剂以及本发明装置的识别标志，所述试剂盒、试剂和本发明装置组成了应当共同使用的装置。相关的标志甚至可以是完全不同的，并且仅通过标明它们有联系的信息而联系。该信息能够在用户能访问的寄存器中显示或标在试剂盒之上或试剂盒内部，如对于使用的指令。相关的识别标志甚至可以是纯功能性的。装置仅和与该装置具有相同试剂盒批号的试剂起作用。
试剂盒具有失效期。相同的失效期适用于作为试剂盒一部分的试剂和装置。当过了失效期时，试剂盒不被允许使用，试剂和装置也不允许使用。
相关的识别标志和共有的失效期的作用是用于确保装置已进行维护，即在某个确定的时段内已检验具有相关功能。在厂家将试剂盒投放市场待售时，装置已进行了质量保证程序。从那时候起直至失效期，装置可以使用。
本发明装置具有其中校准数据用于血细胞比容和分析物浓度测定的只读存储器，所使用的试剂是与本发明装置相同的本发明试剂盒的一部分。通过该机制，本发明装置和试剂已同时得到校准。
本发明试剂盒具有允许定期维护的本发明装置与已同时校准的试剂一起使用的特点。也就是说，可靠性增强的测量，大实验室所特有的，被应用在接近患者测定场所处。
本发明试剂盒的使用设想包括了在接近患者测定场所和小实验室之间的交流，后者包括了大实验室的部门。本发明方法的首次实施，在小实验室中对某一患者的血液或抗凝血使用了本发明试剂盒的本发明装置和试剂。除假定抗凝血分析物浓度之外，在小实验室处实施本发明方法也给出患者血液的血细胞比容。该血细胞比容和患者的身份、日期和时刻存入本发明装置存储器中。因此本发明试剂盒为进行患者分析物浓度的接近患者分析作准备。所述疑患者血液的接近患者分析可提供分析物浓度的测定，该测定几乎不受不能精确分配血液和试剂体积的影响，只要血细胞比容的改变是适度的即可。一般地，除非在大量失血和输血情况下，血细胞比容改变是缓慢的。随着时间过去给定个体的血细胞比容倾向于稳定。为检验血细胞比容以及其它理由，推荐在本发明方法实施者和小实验室之间进行定期交流。

发明内容
概述通过分析预期体积的血液和预期体积的试剂混合物，提供了用于抗凝血浆分析物浓度测定的方法。所述假定的抗凝血浆来自于进行了假定的抗凝处理的血液。所述本发明方法特点在于a)所述试剂的预期体积较所述血液的预期体积大五倍或更多，b)对所述混合物进行两次或更多次测量，d)测定了所述血液血细胞比容，e)测定了所述血液的的所述分析物浓度。
提供了测量和测定装置。测量和测定装置可对血液和试剂混合物进行两次或更多次测量，还可进行必要的计算以测定假定抗凝血浆分析物浓度。本发明装置包括1)数据处理器，2)只读存储器，3)用于血细胞比容测定的校准数据，所述血细胞比容校准数据存储在所述只读存储器中，3)用于所述分析物浓度测定的校准数据，所述分析物校准数据存储在所述只读存储器中，4)对血液和试剂混合物进行两次或更多次测量的装置。
提供了用于假定的抗凝血浆分析物浓度测定的设备试剂盒。一批本发明试剂盒中的每个都具有识别标志和表示为每个试剂盒所属批次的失效期。本发明试剂盒包括1)试剂，所述试剂具有识别标志，所述识别标志与所述设备试剂盒的所述识别标志有关，所述试剂具有失效期，其与所述设备试剂盒的所述失效期相同，2)测量和测定装置，所述测量和测定装置具有识别标志，所述识别标志与所述设备试剂盒的所述识别标志有关，所述测量和测定装置具有失效期，其与所述每个设备试剂盒的所述失效期相同。
很清楚本发明并不限于特定的实施和所描述的实施方案，因而当然可以改变。也很清楚在此使用的技术名词的目的仅是为了描述特定的实施和实施方案，而不是意在限制，因为本发明的范围仅由所附加的权利要求书来限定。
实施例材料和方法制造了一种测量和测定装置—根据本发明的装置。示意图参见图4。该装置具有其中10mm外径、63mm长度、聚苯乙烯管的容器能倾斜地插入的容器座。当插入时，约22mm的底部在该容器座内。在容器座内部，从插入容器的底部起约8mm处，从发光二极管(940nmLED，Everlight IR204)发出的一束光直接垂直于该插入的容器，沿着其直径之一射向光电二极管探测器(900nm最大感光度的光电二极管，Infineon SFH 2030F)。该光电二极管连接有一个运算放大器(在光电压转换器的插脚2和8之间，Burr Brown OPT 101，其感光区涂黑)。该放大器将与入射光强度成比例的电压施加在可编程计算机(Microchip PIC16F873-201/SO)输入电路的10-比特模拟-数字转换器(A/D转换器)上。电压的数字表示，光的测量，显示在液晶显示器(LCD Seiko L167100J)上。该装置具有一个按钮，操作人员使用其使PIC与其软件相互作用。按下该按钮启动处理器从软件的一部分到另一部分的动作或起停动作。在程序的一部分中，该按钮可以起停PIC的时间函数，测定凝血时间。存在用于传送与室温成比例的电压到该PIC的另一个模-数转换器的电路。执行该程序相关的部分，PIC被编程以在LCD上显示光和凝血时间的测量。PIC存储了在18-40℃温度范围内用于PT测定的校准值；NCT和ISI作为温度函数。在测定结束时，显示血液的血细胞比容和抗凝血的PT活性。在实施例5中，根据本发明的测量和测定装置已重新设计并备有改良的软件。当血样添加并混合时，该装置具有自动进行起动时间测量的能力。通过光学装置自动检测凝血时间。该装置在凝块检测时自动进行必需的计算，并自动在LCD上显示分析物浓度测定的结果。
在本发明优选的实施中，将装有350μL PT试剂的容器置于样品座中。测量穿过PT试剂透射的光强度(lo)。将血液添加到试剂中，即与试剂接触并混合。当接触时，开始测时。再次测量穿过混合物透射并到达检测器的光强度(l)。当检测到血凝块时，停止测时。在实施例1和3中，精确确定体积的血液添加到PT试剂中。使用了在2μL-20μL范围内可调整的移液管。在实施例2中，使用了半定量的测定体积装置platineuse进行添加。在所有的实施例中，使用了精确确定的350μL PT试剂。在所有的实施例中，使用platineuse进行血液试剂的混合以及挂在牵引钩上检测血凝块。在实施例5中，添加20μL的血液或用于校准的抗凝血浆并与400μL PT试剂混合。
带有10μL环的塑料的Platineuses，Sevant Oy，Helsinki，Finland是Labora AB，Uplands Vasby，Sweden以货号007-2510供应的。
Owren PT试剂GHI 131来自Global Hemostasis Institute MGRAB，Linkping，Sweden。
解码的(decoded)血样、或者用于血细胞比容和血红蛋白浓度的EDTA抗凝样品或用于PT测定的柠檬酸盐抗凝样品是提交给大学医院(University Hospital)的中心检验室，Linkping，Sweden，用于测定的患者血浆样品。通过准确的实验室法、所提及的中心检验室的常规程序可获知EDTA样品的血细胞比容和血红蛋白和柠檬酸盐样品的PT活性。
临床实验，包括解码的患者样品的实验，是与Tomas Lindahl教授合作进行的，并为指定的大学医院的地方伦理委员会所批准。
实施例1使用本发明装置分析六个通过准确实验室法测定的具有已知或真实血细胞比容值HCTt的EDTA抗凝血样品。每个样品的血容量(Vb)被添加到350μL预期体积的PT试剂中并与之混合。预期的血容量是10μL。在添加及混合血液前后，测量穿过试剂透射的光强度(lo)和穿过混合物透射的光强度(l)。来自于六个样品中的一个，具44.0％的HCT的样品6AS也用不同的血容量4、6、8、12、14、16和18μL进行了试验。这些血样，分别称为4S-18S，根据方程式3基于血液稀释度赋予HCT值。因此，如4S的HCT为44.0％乘以方程式3中的X，为17.9％。将已知的HCT值对l/lo作图并进行线性回归分析。得到了具有r2＝0.98的回归方程式HCT＝2.03×(lo/l)+9.37。数据列于表1及图1的曲线中。将表1中lo/l值代入回归方程式中得到表观HCT值。利用方程式2，使用HCTa值和已知的或真实的血细胞比容值测定血容量。所测定的血容量Vbd可与添加的血液的已知体积Vb相比。发现所测定的血容量是已知血容量的101％±7％(平均±CV)。相同的发现还出现在HCTa和HCTt的比较中。样品的血红蛋白值也是已知的，血红蛋白(Hb)以克/升对lo/l作图的线性回归分析给出了Hb＝7.17×(lo/l)+29.8，具有r2＝0.99，数据未给出。在实施例2和实施例3中，方程式HCT＝2.03×(lo/l)+9.37用于产生表观HCT值。通过利用较预期体积更小和更大体积的血液，并通过利用方程式3以测定标准化浓度得到应用。其仅通过利用有限的样品就能有权使用宽的HCT范围。
实施例2给出了本发明方法接近患者实施的实施例。两个柠檬酸盐抗凝的血样，样品1和样品2，具有已知的HCT值，用于进行根据本发明的分析物浓度测定。分析物浓度是PT。该测定在21.5℃的室温下进行。分别对样品1和样品2分析5次和6次。采集血液，使用半定量设备platineuse与PT试剂接触并混合。血液体积因此是不精确地分配了。试剂的预期体积是350μL。patineuse也用于牵引钩以测定凝血时间。使用样品2，以湿法进行有目的地采集血液的操作以引起血容量较大的改变，如同在接近患者测定场所处所可能经历的。用INR表示的抗凝血样抗凝血浆的PT以及其血细胞比容通过准确的实验室法获知。对于样品1该值是INR 1.00和55.3％，对于样品2是INR2.44。对于抗凝血浆PT的测定HCT值是必需的，因为反应混合物的组成不精确。已知的INR值仅用于比较。根据本发明抗凝血浆中PT的测定需要对血液和试剂混合物进行两次或更多次测量。在该实施例中，这些是两次光学测量和一次流变学测量。后者获得了凝血时间。光学测量提供了表观血细胞比容HCTa的测定，如表1中所详述。流变学测量提供对PT的测定。通过准确的实验室法用具有已知的用INR表示的PT的抗凝血校准物校准PT测定。在室温下，ISI是1.17且NCT是55.2秒。校准物的平均血细胞比容是37.1％。抗凝血细胞容积的分析物浓度假定为血浆容量的29％，如在实施例2中所建立的。因此，假定的分析物容量是抗凝血体积乘以(1-HCT+0.29×HCT)。因此，校准物的平均Vh，Vhm，与样品1的Vh的比值为(1-0.368+0.29×0.368)/(1-0.553+0.29×0.553)或1.23。相应地，样品2的为1.07。假定的抗凝血浆中用INR表示的PT测定如下。通过利用Lindahl等的方程式PT％＝1/(INR×0.028-0.018)，表观INR值INRa再表示为PT％。通过利用方程式1获得PT％t表示的血液的真实PT。根据PT％pcit＝PT％t×Vhm/Vh测定假定的柠檬酸盐抗凝血浆的PT。通过对样品2的测定，本发明的值清楚地得到显示。在该测定中，血容量波动相当大，因此使得表观血液PT，(aINR±CV)，为4.21±37.1％。根据本发明，假定的抗凝血浆的PT是INR 2.43±2.2％。与通过准确的实验室法所获得的INR 2.44几乎相同。根据本发明，样品1的PT也得到了准确且精确的测定。该实施例以检测实物模型的方式来实施本发明。因为实验简单，所以测试的血样是柠檬酸盐抗凝血。在正式实施本发明中，血液应当是已校正的。并且不使用10μL的柠檬酸盐抗凝血样，应当使用9μL的血液。减少的血液体积用于弥补由柠檬酸盐抗凝处理所引起的体积膨胀。或者PT测定应当用11.11μL的柠檬酸盐抗凝血浆和10μL已校正的血液进行校准。众所周知柠檬酸盐抗凝处理本身并不影响PT测定。
实施例3从前一天已提交给Linkping大学医院中心检验室用于常规凝血分析的要被丢弃的样品中随机选择一组40个柠檬酸盐抗凝血样进行详细的分析。离心样品以便血细胞沉淀在血样管的底部并使血浆在上边。在两小时的分析中，通过该中心检验室准确的实验室法测定血浆样品的INR。将管子盖上帽子并倒置几次以再悬浮血细胞。在5分钟的重悬浮中，通过用350μL的Owren PT试剂与10μL(移液管)的血液接触，在21.5℃D室温下分析每个血样。使用platineuse进行混合和挂牵引钩。对该混合物进行两次测量，一次通过光学测定血细胞比容HCT以及一次通过流变学(挂牵引钩)测定凝血时间CT。将该组再分成三组。第一组是由6个样品组成的低HCT组，具有24.8％的平均HCT。第二组是8个样品的高HCT组，具有52.9％的平均HCT。第三组是23个样品的中HCT组，具有33.6％的平均HCT。该中HCT组用来校准本发明方法的PT测定。其产生了1.11的ISI和48.5秒的NCT。低HCT组和高HCT组的平均血浆INR和血液INR分别是1.81和1.71，及1.68和1.89。与血浆INR相比，对于低HCT组血液INR低5.8％，而在高HCT组中高12.5％。为确定假定的分析物容量Vh的大小，将高和低HCT组的平均血液INR值转换为PT％，一种成比例的PT表示。通过用校准物平均Vh与该组平均Vh的比值乘以平均血液PT％，每组的平均血浆PT％用来测定平均血液PT％。Vh假定为血浆容量与抗凝血细胞容积级分之和。级分在0-1之间变化，以0.1为一级。在每一级分水平处，测定平均血浆INR并与已知平均血浆INR比较。在级分0处，所有的PT按照血浆容量，对于低HCT和高HCT组血浆INR较已知的血浆INR分别大2.5％和小9.1％。对于低HCT组和高HCT组，在0.24和0.33的细胞容积级分处分别存在为零的差。参见图2。细胞容积级分最优值确定为0.29(29％)。当血细胞比容高时，在通过分析血液PT的假定的血浆PT测定中，本发明的实施在准确性方面产生了可观的改善。在58.8％的血细胞比容(在抗凝血中相当于52.9％)处，在小实验室处本发明的实施可消除12％的根据现有技术通过分析血液的PT测定中产生的系统误差。在2.5的治疗的INR范围内，在55％、60％、65％和70％的血细胞比容处，通过本发明的实施分别消除了11％、17％、23％和29％的系统误差。在低血细胞比容处的系统误差，尽管稍微更少，但通过本发明的实施也可以消除。在该实施例中，根据经验在本发明实施中添加10μL柠檬酸盐抗凝血而非9μL血液到PT试剂中。在这点上，在该实施例中本发明的实施是一种实物模型。但是，没有理由相信结果与通过利用血液有所不同。
实施例4利用包括方程式4的程序步骤，与实施例3中相同的数据组用来实施本发明。与实施例3一样也有相同的3组；低HCT组、高HCT组和中HCT组。使用在实施例3中确定的细胞容积级分，每个样品的Vh确定为10×(1-HCT+0.29×HCT)。对于低、高和中HCT组，平均Vh、Vhm分别为8.24μL、6.25μL和7.62μL。PT测定的校准与实施例3相同。血液PT，INRb，对已知血浆PT，INRp，作三条曲线，每组一条，参见图3a。对于低和高HCT组，线性最小二乘方回归分别得到回归方程式INRb＝0.935×INRp+0.011和INRb＝1.108×INRp+0.021。由此计算差ΔINRb＝-0.173×INRp+0.099。相应的平均Vh中的差，ΔVhm，确定为1.99μL。ΔINRb/ΔVhm视为dINRb/dVh的估计值，因此确定为-0.086×INRb+0.005。根据方程式11其用来测定低HCT组和高HCT组中样品的血浆INR，参见图3b。在校正前后对每个样品测定平均误差，(INRb-INRp)/INRp。在低HCT组中，误差变化从-4.8％-0.2％，对于高CHT组，从12.1％-0.8％。在通过利用方程式4以一种非成比例的表示测定分析物浓度中，在此使用的为实施本发明的程序较先前描述的趋于改变的程序需要很少的和简单的计算，即其中通过非成比例表示的分析物浓度再表示为通过成比例表示的分析物浓度的程序。在此描述的程序需要较少的计算，当通过利用具有有限处理能力的微处理器实施本发明方法时，可能是有利的。
实施例5以下给出如何根据本发明测定抗凝血浆中的分析物浓度的说明。特别地，其是如何进行计算的实施例。该实施例的分析物浓度是凝血酶原时间PT。分析物浓度用INR表示。
具有通过准确的实验室法测定的其相应抗凝血浆的已知INR值的59个血样组的每个成员，根据本发明的方法对其分析。在零时间处，在室温下，添加20μL血样并与聚苯乙烯管状容器中的400μL PT试剂混合，该管状容器插入并固定在本发明测量和测定装置的容器座中。对混合物进行多于两次的不同测量。测量从940nm LED发出穿过混合物透射的光强度(l)、混合物凝结的时间(CT)以及混合物的温度(t)。也测量了在添加血液之前仅穿过试剂透射的光强度(lo)。不同测量之一，l，与血液的血细胞比容相关，用于计算l/lo，对于本领域技术人员是显而易见的并示于实施例1和表1中。不同测量之一，CT，与抗凝血的PT相关，也是显而易见的且通过表2中数据得到反映。通过测量室温测得与环境取得热平衡的混合物温度。根据本发明，抗凝血的PT计算自混合物的多次测量值，即其通过l，CT和t，Fl1(1，CT，t)的数学函数进行计算。根据本发明通过函数Fl((l/lo)，CT，t)计算分别相应于59个血浆样品的抗凝血浆的PT。根据现有技术，PT仅通过CT和t，FPA(CT，t)的函数计算。通过用2个抗凝血浆样品，具有已知INR值的校准物，校准获得合适的函数，该已知INR值是通过标准化组织EQUALS，Uppsala，Sweden组织的多个医学中心运行所确定的。在19-29℃范围内的不同温度下进行校准。使得标准凝血时间NCT和国际敏感度指数ISI分别作为温度的函数NCT(t)和ISI(t)得到测定。利用计算机，在任意装置内部使用的时间和温度分别为timeU和tempU。一个tmu约为0.0665秒并根据t＝80.9-0.109×tempU的关系式将tepu转换为摄氏度(t)。该换算仅用于人，对计算指令并无影响。函数为NCT(t)＝-2329-9.547×tempU+0.0113×tempU×tempUISI(t)＝0.8785+0.0007×tempU在指定的温度范围内，利用计算机温度单位和ISI(t)的二次多项式首次描述了NCT(t)。在分析抗凝血浆中，计算简化为INR＝(CT/NCT(t))expISI(t)通过分析抗凝血样和相应的抗凝血浆样品，在该温度范围之内的不同温度处，发现血液的NCT和ISI丰碑具有温度函数1.17×NCT(t)和0.775×ISI(t)。通过测量柠檬酸盐抗凝血和液体PT试剂混合物的凝结时间CT可以测定抗凝血浆的PT。因此，如果抗凝血是样品，则抗凝血浆的INR在此称为INRcb，因为柠檬酸盐血是样品，则其为INRcb＝{CT/[1.17×NCT(t)]}exp
只有当抗凝血的血细胞比容是用于导出该表达式的抗凝血样平均值时，其才是严格地有效的。
如果用血液代替抗凝血以相同的比例与液体试剂混合，添加1.11倍更多的如上所述血样，可使用假定DE体积的概念和在PT％和INR之间的关系式计算对NCT和ISI的影响，如上所述Lindahl等描述了该关系式。NCT将减少到95.4％并且ISI增加到103.4％。实验测定使用试剂的体积减少10％，给出了基本上相同的结果。因此，根据以下相同的方案，抗凝血浆的PT可通过测量血液和PT试剂的凝血时间得到测定。用这种方法测定的抗凝血浆INR称为INRb，为INRb＝[CT/1.116×NCT(t)]exp0.801×ISI(t)在另一方面，使用相同的方案，通过混合抗凝血或血液测定的抗凝血浆PT通过上述关系式给出，但只有当血细胞比容为上述计算结果的平均水平时才是这样。根据本发明，与血细胞比容相关的至少一次测量是对血液和试剂混合物进行的。穿过混合物透射的光l的测量是这样的一种测量。对于技术原因，容器尺寸和性状的改变、容器座中容器位置、光源的能量来源以及最主要的在给定的批次装置之间的个体差异，当与血样血细胞比容相关的混合物测量时，最好使用l/lo比值而非l。根据本发明，为了校正，为了得到样品血细胞比容改变的影响，建立了INR对l/lo的函数关系。为做到这一点，上述所获得59个INRcb可以表示为对于其抗凝血浆已知的相应INR值的级分。该比值称为K，在59个样品中范围在0.85-1.23之间。K与l/lo的函数关系，血细胞比容的测量，是通过线性回归推导出的，存在显著相关性。回归直线的方程式是K＝0.032×(l/lo)+0.745。根据本发明其提供了INRcbi的计算INRcbi＝{CT/[1.17×NCT(t)]}exp
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检验已知值显示59个PT测定的平均绝对偏差为8％，对于根据现有技术测定的PT，观察到的最大偏差为23％。根据本发明该PT测定的相应值是6％和14％。显而易见，与现有技术相比根据本发明的测定在准确性上产生了明显改善。由上述关系式，K＝0.032×(lo/l)+0.745，平均血细胞比容看来似乎是7.969的lo/l。如果血液就已经是样品，则平均血细胞比容应当为8.846，因此，关系式为K＝0.032×(lo/l)+0.717。因此，根据本发明通过对血液和液体PT试剂混合物进行两次或更多次测量，下列计算结果用于抗凝血浆PT测定。测定PT被称作INRbiINRbi＝{CT/[1.116×NCT(t)]}exp
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所给出的上述实施例显示了如何实施本发明。当然，在可能进行的测量和计算方法中存在着无数的改变而不背离本发明的范围，其提供了用于在许多小医疗中心处进行抗凝血浆分析物浓度测定的方法、装置和试剂盒，在这些地方抗凝血浆不便制备或无法制备。
表格表1.6个EDTA抗凝样品，1A-6AS，具有不同的血细胞比容HCT，在本发明可以实施的分析机构分析。血容量Vb添加到350μL的PT试剂中。用样品之一的样品6AS进行不同血容量的试验。通过利用方程式3测定标准化血液浓度。建立在HCT和l/lo间关系式。使用该关系式和lo/l比值，为每次试验测定表观血细胞比容HCTd。通过利用方程式2，测定添加的血容量Vbd。
样品HCTVblolHCTaVbdVbd/Vb％1A 39.3 10731 48 40.310.3 1032A 47.7 10757 47 42.18.8883A 45.0 10753 44 44.19.8984A 25.1 10742 110 23.19.2925A 31.5 10809 65 34.611.0 1106AS 44.0 10825 50 42.99.7974S 17.9 4 797 142 20.84.61166S 26.7 6 768 92 26.35.9998S 35.4 8 806 62 35.88.110112S 52.5 12828 38 53.612.3 10214S 60.9 14808 30 64.014.7 10516S 69.2 16749 26 67.815.7 9818S 77.5 18739 22 77.618.0 100表2.本发明方法接近患者的实施，其中在两个血样，样品1和样品2中，分析物浓度PT分别测定5次和6次。通过准确的实验室法，样品1和样品2的血浆PT和HCT分别为INR 1.00和55.3％以及INR 2.44和43.5％。lo和l是仅穿过试剂或穿过血液和试剂混合物透射的光强度。CT是凝血时间。HCTa和INRa分别是表观血细胞比容和PT。PT％是表示为PT％的表观PT。PT％t是血液的真实PT％。PT％p和INRp是假定的抗凝血浆中表示为PT％和INR的PT。也给出了INRa和INRp的平均值和CV。
样品1lolCTHCTaINRaPT％aPT％tPT％pINRp817 33 5859.61.0685.8 79.6 98.3 1.01806 30 5563.91.00101.287.6 108.10.97772 36 6052.91.1077.9 81.4 100.51.00791 38 6051.61.1077.9 83.4 103.00.99843 36 5856.91.0685.8 83.4 102.90.99平均 1.06 0.99CV 4.1％ 1.2％样品2lolCTHCTaINRaPT％aPT％tPT％pINRp787 43 120 46.52.4619.6 18.4 19.7 2.46824 44 120 47.42.4619.6 18.0 19.3 2.49753 45 122 43.42.5119.1 19.2 20.6 2.38794 65 147 34.23.1114.4 18.4 19.7 2.45850 147 193 21.14.279.8 20.3 21.7 2.29817 38 111 53.02.2522.2 18.3 19.6 2.47平均 2.84 2.42CV 26.6％ 3.2％
权利要求
1.一种通过对相应于抗凝血浆的血样和液体试剂的混合物进行至少两次不同测量以测定所述抗凝血浆的分析物浓度的方法，包括步骤d)将一体积所述血样与五倍或更多体积的所述液体试剂混合，e)对所述混合物进行所述的至少两次测量，其中至少一次与所述血样的血细胞比容相关，以及其中至少一次与所述分析物浓度相关，和f)当a)中体积是精确且准确或b)中所述血样的血细胞比容是已知时，计算测量所得结果以确定所述抗凝血浆的所述分析物浓度。
2.根据权利要求1的方法，其中g)所述混合物中血液体积为血液预期体积的50％-150％，b)所述混合物中试剂体积为试剂预期体积的70％-120％，和c)当血样的血细胞比容已知时，计算结果以确定分析物浓度。
3.根据权利要求1的方法，其中a)中所述血液预期体积为5-40μL以及所述试剂预期体积为100-1000μL。
4.根据权利要求1的方法，其中a)中所述血液体积为5-20μL以及所述试剂体积为150-600μL。
5.根据权利要求1的方法，其中b)中所述测量在具有至少4mm的最小横截面尺寸的管状容器中进行。
6.根据权利要求1的方法，其中b)中所述测量在具有5mm-15mm的最小横截面尺寸的管状容器中进行。
7.根据权利要求1的方法，其中所述方法用通过已添加选自柠檬酸、异柠檬酸、EDTA、草酸、肝素和水蛭素的钠、钾和锂盐的抗凝剂进行抗凝处理的抗凝血浆校准。
8.根据权利要求1的方法，其中所述抗凝血浆是来自血液的液体，其选自由血清、肝素化的血浆、水蛭素抗凝的血浆、草酸盐抗凝的血浆、柠檬酸盐抗凝的血浆、异柠檬酸盐抗凝的血浆、EDTA-血浆和热处理的血浆组成的血液来源的液体。
9.根据权利要求1的方法，其中所述分析物浓度的测定用在抗凝血浆中具有已知分析物浓度的抗凝血进行校准，所述抗凝血浆已通过添加选自柠檬酸、异柠檬酸、EDTA、草酸、肝素和水蛭素的钠、钾和锂盐的抗凝剂进行了抗凝处理。
10.根据权利要求1的方法，其中所述分析物选自凝血酶原时间(PT)、血纤蛋白原，血纤蛋白原降解产物、血纤蛋白降解产物(D-二聚体)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、活化凝血时间(ACT)、C-反应蛋白(CRP)、胆固醇和葡萄糖。
11.根据权利要求1的方法，其中所述与b)中所述血细胞比容相关的测量是基于一次或多次使用800nm-1100nm波长的光的测量。
12.根据权利要求1的方法，其中b)中所述两次或更多次测量在18℃-40℃的室温下进行。
13.根据权利要求1的方法，其中a)中所述试剂含有0.1g/L或更多的血纤蛋白原。
14.根据权利要求1的方法，其中所述分析物浓度是用INR表示的PT，其中，在所述抗凝血浆分析物浓度测定前，分析物浓度再表示为PT％。
15.根据权利要求1的方法，其中a)中所述混合物的凝血时间是与b)中所述分析物浓度相关的至少一个测量中的一个。
16.一种用于对血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品进行测量的测量和测定装置，包括a)用于容纳含有具体批次液体试剂的容器的座，该容器容有在装置运转中用于与所述液体试剂混合的所述样品之一，b)能量来源，c)数据处理器，d)包含有用于一种或多种所述血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品混合物的计算数据集的只读存储器，每一计算数据集适用于所述的具体批次，e)用于对每一混合物进行两次或多次测量的测量装置，f)显示用户指令和基于来自d)和e)数据计算结果的显示器，以及g)用于用户控制装置的控制装置。
17.一种带有识别标志的设备试剂盒，包括用于进行血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品测定的测量和测定装置，以及一种或几种在各自带有与所述设备试剂盒的所述识别标志相关的识别标志的容器中的液体试剂。
全文摘要
描述了一种通过对相应于抗凝血浆的血样和液体试剂的混合物进行至少两次不同测量以测定所述抗凝血浆的分析物浓度的方法。该方法包括a)将一体积所述血样与五倍或更多体积的所述液体试剂混合，b)对所述混合物进行所述至少两次测量，其中至少一次与所述血样的血细胞比容相关，以及其中至少一次与所述分析物浓度相关，和c)当a)中体积是精确且准确或b)中所述血样的血细胞比容是已知时，计算测量所得结果以确定所述抗凝血浆的所述分析物浓度。此外，描述了用于进行血液、抗凝血和/或抗凝血浆样品测定的测量和测定装置，以及设备试剂盒。
文档编号G01N33/86GK1914511SQ200480041277
公开日2007年2月14日 申请日期2004年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者M·龙比 申请人:扎芬纳股份公司