专利名称：半湿蛋白质阵列及其制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质芯片技术领域，蛋白质芯片主要应用于高通量药物搜寻和蛋白质组的研究，是后基因组时代重要的研究方向之一。而蛋白质阵列可为蛋白质芯片技术提供化学实验的基础。
背景技术：
人类基因组计划宣告全序列的测序完成后，随即进入基因组功能分析的“后基因组”时代。其中，作为生物芯片的主导，基因芯片被广泛用于基因谱图的绘制，基因表达分析，分子克隆与cDNA文库的筛选，遗传病与肿瘤的诊断，药物筛选等领域。然而，DNA所存储的生物功能是通过蛋白质来实现的。理由是虽然人类基因组包含了我们身体的全部遗传信息，但那也只是制造蛋白质的原料。尽管所有的细胞都拥有同样的基因组，但在不同的细胞内会有不同基因处在活跃的状态，从而合成不同的蛋白质。病变细胞与正常细胞的差异是由合成的蛋白质的不同来决定的。目前的困难是，测序了基因组未必能识别出其中含藏的基因。测序了蛋白质的氨基酸序列也不一定能预测蛋白质的折叠和三级结构，测定了蛋白质的结构也不见得能预言蛋白质的功能和所能结合的配体分子。因此，在药物设计领域，高通量地搜寻能抑制致病关键蛋白质靶标的先导化合物，还主要依赖于生物芯片中的蛋白质芯片(参见Wilson，D.S.& Nock，S.Recentdevelopments in protein microarray technology.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，2003，42494-500)研究的进展。
蛋白质芯片也称蛋白质微阵列，是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。Ciphergen Biosystems公司较早发展了蛋白质芯片技术。Uetz等人(参见Uetz，P.；Giot，L.& Cageney，G A comprehensive analysis ofprotein-protein interactionsin Saccharomyces cerevisiae.Nature，2000，403623-627)使用酵母双杂交系统构造了蛋白质芯片，在玻片表面排列6,000个凹槽，用以检测酵母可能的全部蛋白质之间的相互作用。MacBeath等人(参见MacBeath，G.& Schreiber，S.L.Printingprotein as microarray for high-throughput function determination.Science，2000，2891760-1763)报道通过点样机械装置制作蛋白质芯片的研究。利用此装置，在半个载玻片大小的玻璃基片表面固定了10,000种蛋白质。为了做到蛋白质分子不失活而又能牢固地固定在基片表面，他们用一层小牛血清白蛋白(BSA)修饰玻片，使表面形成亲水环境。BSA中的Lys通过活性剂与点样蛋白质所含的Lys反应，使其结合在基片表面(参见Heng，Z.& Snyder，M.Protein arrays and microarrays.Curr.Opin.Chem.Biol.，2001，540-45)。
但是，与DNA芯片不同，因为蛋白质在常规干燥的条件下容易变性，所以难以制备出有实用价值的蛋白质阵列。一般认为，活体中蛋白质处于70％含水量的环境中，潮湿环境适宜于蛋白质阵列的稳定。遗憾的是，与干燥的阵列不同，潮湿的阵列至今还未得到很好的发展(参见Arenkov，P.Protein microchipsuse forimmunoassay and enzymatic reactions.Anal.Biochem.200，278123-131)。由于水凝胶含有大量固定着的溶剂，故此认为凝胶是一种介于干和湿之间的中间状态。
以小分子冻胶来固定蛋白质已进行了研究(参见Kiyonaka，S.；Sada，K.；Yoshimura，I.；Shinkai，S.；Kato N. & Hamachi I.Semi-wet peptide/protein array usingsupramolecular hydrogel.Nature Materials 2004，358-64；Yoshimura，I.；Miyahara，Y.；Kasagi N.；Yamane，H.；Ojida，A.& Hamachi，I.Molecular recognition in asupramolecular hydrogel to afford a semi-wet sensor chip.J.Am.Chem.Soc.2004，12612204-12205)。而该方法用于固定蛋白质的材料是小分子冻胶，且用氢键交联，易于溶解和熔融。
发明内容本发明目的是解决蛋白质在常规干燥的条件下容易变性，所以难以制备出有实用价值的蛋白质阵列的问题，提供一种半湿蛋白质阵列及其制备方法。
该半湿蛋白质阵列是在带有m×n阵列凹孔的玻璃片各凹孔中注入包埋蛋白质的聚合物制成。其中m、n为任意自然数。
其中聚合物为2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸与N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物。
蛋白质对所有蛋白质均适用，如胰蛋白酶、牛血清白蛋白或酪蛋白中等，不同凹孔中包埋的蛋白质可以相同，也可以不同。
一种上述半湿蛋白质阵列的制备方法，该方法包括——聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸包埋蛋白质在20mL 50～80μg/mL的胰蛋白酶、或牛血清白蛋白、或酪蛋白的Tris-HCl缓冲液中，分别加入10～20g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和4.5～9g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溶液在5℃下孵化1～3h；——蛋白质阵列点样在氮气保护下，在上述溶液中加入0.5～0.7g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂，在5℃下强烈搅拌后，聚合前迅速点样在m×n孔玻璃片上，其中的一行(或列)孔点无蛋白质的单体液；在5℃下振摇直至体系交联固化，用蒸馏水浸泡玻璃片1～3次，每次30～60min，制得半湿蛋白质阵列。
阵列中不同的斑点上可以注入不同的蛋白质，形成蛋白质阵列芯片。每个斑点内，蛋白质被聚合物网络所束缚，不易溶出和变性。聚合物由遇水膨胀高分子材料所组成，在水溶液中，聚合物链的网络被撑开，允许小分子配体(或底物)进入其内部与蛋白质接近，并被蛋白质所结合或催化。(参见图1)——配体溶液的配制和注入在烧杯内，加入1～3mL的25％苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺，4～6mL 0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，10～20mL 0.1％的NaNO2溶液。振荡5～10min后，再加入10～20mL 0.5％的氨基磺酸胺溶液。摇匀。
——检测将玻璃片浸入配体溶液5～10min，或将配体溶液用注射器注入玻璃片的各个聚合物样斑中。在玻璃片样斑的背面，用可见光照射或用560nm的紫外-可见分光光度仪，观察或测量样斑颜色的变化。
本发明的优点和积极效果本发明将蛋白质包埋在一种高分子水凝胶内，水凝胶结构中含有磺酸基亲水基团。随后，将包埋蛋白质的聚合物点样在玻璃片，经交联固化构建出半湿型蛋白质凝胶阵列，其中蛋白质被固定住，并处于活性状态。这样，由于聚合物能够吸收大量水分子，处于溶胀状态，使被包埋的蛋白质也同样处在所吸收水分子的半湿环境中。蛋白质由此得以保护，而不易因干燥而变性，这为进一步制造稳定的蛋白质阵列提供了实验的基础。
图1是制备半湿蛋白质阵列示意图。
具体实施方式实施例1——聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸包埋蛋白质在20mL 50μg/mL的胰蛋白酶、或牛血清白蛋白、或酪蛋白的Tris-HCl缓冲液中，分别加入10g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和4.5g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溶液在5℃下孵化1h；——蛋白质阵列点样在氮气保护下，在上述溶液中加入0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂，在5℃下强烈搅拌后，聚合前迅速点样在m×n孔玻璃片上(本例选4×4)，其中的每一行(或列)孔可以点一种酶溶液(如胰蛋白酶、牛血清白蛋白和酪蛋白等)，最后一行(或列)孔点无蛋白质的单体液；在5℃下振摇直至体系交联固化，用蒸馏水浸泡玻璃片1次，每次30min，制得半湿蛋白质阵列。
——配体溶液的配制和注入在烧杯内，加入1mL的25％苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺，4mL 0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，10mL 0.1％的NaNO2溶液。振荡5min后，再加入10mL 0.5％的氨基磺酸胺溶液。摇匀。
——检测将玻璃片浸入配体溶液5min，或将配体溶液用注射器注入玻璃片的各个聚合物样斑中。在玻璃片样斑的背面，用可见光照射或用560nm的紫外-可见分光光度仪，观察或测量样斑颜色的变化。
配制配体溶液，其中加入在配体发生变化时能产生颜色变化的物质。如上，在苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺中加入NaNO2和氨基磺酸胺。这样，随着苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺分子的不断水解，体系逐渐变为蓝色，并在560nm处出现吸收谱带的变化。将配体溶液注射入蛋白质阵列的每一个斑点。能与蛋白质作用的配体在颜色上就会发生变化。比如，把三种蛋白质(胰蛋白酶、牛血清白蛋白、酪蛋白)固定在吸水性树脂聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸中。注入苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺水溶液，底物分子进入水溶胀的聚合物内部，接近半湿环境下的蛋白质。由于苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺只能在胰蛋白酶的催化下发生水解反应，故芯片中只有固定了胰蛋白酶的斑点变色。
此方法可作为设计制作蛋白质芯片的基础。如果进一步将大量微量蛋白质集成化固定于芯片中，并注入不同的配体溶液，就可高通量地测定蛋白质与配体的结合或催化状况。这为药物筛选和催化活力的检验提供了一种可行的方法。
实施例2——聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸包埋蛋白质在20mL 60μg/mL的胰蛋白酶、或牛血清白蛋白、或酪蛋白的Tris-HCl缓冲液中，分别加入15g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和7g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溶液在5℃下孵化2h；——蛋白质阵列点样在氮气保护下，在上述溶液中加入0.6g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂，在5℃下强烈搅拌后，聚合前迅速点样在m×n孔玻璃片上(本例选4×6)，其中的一行(或列)孔点无蛋白质的单体液；在5℃下振摇直至体系交联固化，用蒸馏水浸泡玻璃片2次，每次40min，制得半湿蛋白质阵列。
——配体溶液的配制和注入在烧杯内，加入2mL的25％苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺，5mL 0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，15mL 0.1％的NaNO2溶液。振荡5min后，再加入15mL 0.5％的氨基磺酸胺溶液。摇匀。
——检测将玻璃片浸入配体溶液5min，或将配体溶液用注射器注入玻璃片的各个聚合物样斑中。在玻璃片样斑的背面，用可见光照射或用560nm的紫外-可见分光光度仪，观察或测量样斑颜色的变化。
实施例3——聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸包埋蛋白质在20mL 80μg/mL的胰蛋白酶、或牛血清白蛋白、或酪蛋白的Tris-HCl缓冲液中，分别加入20g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和9g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溶液在5℃下孵化3h；——蛋白质阵列点样在氮气保护下，在上述溶液中加入0.7g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂，在5℃下强烈搅拌后，聚合前迅速点样在m×n孔玻璃片上(本例选6×6)，其中的一行(或列)孔点无蛋白质的单体液；在5℃下振摇直至体系交联固化，用蒸馏水浸泡玻璃片3次，每次60min，制得半湿蛋白质阵列。
——配体溶液的配制和注入在烧杯内，加入3mL的25％苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺，6mL 0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，20mL 0.1％的NaNO2溶液。振荡10min后，再加入20mL 0.5％的氨基磺酸胺溶液。摇匀。
——检测将玻璃片浸入配体溶液10min，或将配体溶液用注射器注入玻璃片的各个聚合物样斑中。在玻璃片样斑的背面，用可见光照射或用560nm的紫外-可见分光光度仪，观察或测量样斑颜色的变化。
权利要求
1.一种半湿蛋白质阵列，其特征在于该阵列是在带有m×n阵列凹孔的玻璃片各凹孔中注入包埋蛋白质的聚合物制成，其中m、n为任意自然数。
2.根据权利要求1所述的半湿蛋白质阵列，其特征是聚合物为2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸与N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物。
3.一种权利要求1所述的半湿蛋白质阵列的制备方法，其特征是该方法包括——聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸包埋蛋白质在20mL 50～80μg/mL的胰蛋白酶、或牛血清白蛋白、或酪蛋白的Tris-HCl缓冲液中，分别加入10～20g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和4.5～9g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，溶液在5℃下孵化1～3h；——蛋白质阵列点样在氮气保护下，在上述溶液中加入0.5～0.7g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂，在5℃下强烈搅拌后，聚合前迅速点样在m×n孔玻璃片上，其中的一行或列孔点无蛋白质的单体液；在5℃下振摇直至体系交联固化，用蒸馏水浸泡玻璃片1～3次，每次30～60min，制得半湿蛋白质阵列。
全文摘要
一种半湿蛋白质阵列及其制备方法，解决蛋白质在常规干燥的条件下容易变性，难以制备出有实用价值的蛋白质阵列的问题。蛋白质阵列是继DNA芯片之后的一项新的技术，主要用于高通量筛选药物和蛋白质组学的研究。本发明以聚2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸包埋胰蛋白酶、牛血清白蛋白和酪蛋白等，聚合物内部同时处于半湿状态。将包埋蛋白质的聚合物点样在玻璃片，经交联固化构建出半湿型蛋白质凝胶阵列，其中蛋白质被固定住，并处于活性状态。这样，由于聚合物能够吸收大量水分子，处于溶胀状态，使被包埋的蛋白质也同样处在所吸收水分子的半湿环境中。蛋白质由此得以保护，而不易因干燥而变性，这为进一步制造稳定的蛋白质阵列提供了实验的基础。
文档编号G01N35/00GK1776426SQ20051001645
公开日2006年5月24日 申请日期2005年11月29日 优先权日2005年11月29日
发明者黄积涛, 郑嗣华, 张嘉琪, 黄卫洪, 谢秀荣 申请人:天津理工大学