专利名称：一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法
技术领域：
本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及一种基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法。
背景技术：
检测多种疾病标志物或病毒通常采用蛋白质阵列的方法，虽然此方法选择性好，但是操作步骤多，费时费力，成本高，并且不能同时检测不同性质的蛋白或病毒。采用均相免疫反应进行病毒检测以及疾病诊断，具有快速、灵敏、特异等优点，而且可以同时检测不同性质的多种蛋白或病毒。许多由病毒感染导致的疾病征兆很相似，单从并发症状看无法确定到底是由哪一种病毒感染导致的疾病。因此需要简便快速的高通量方法，同时检测多种病毒，并用于临床疾病早期诊断。近年来，荧光分析法以其高灵敏度、快速简便的优势在 病毒检测中得到了广泛的应用，然而传统的荧光分析法只能实现单一分析物的检测而无法实现多组分同时检测；为了实现多组分同时检测，申请人开展了同步荧光扫描法研究，建立了一种简便、快速、同步荧光检测多种抗原或病毒的均相免疫检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测多个靶分子的方法。采用荧光染料为荧光信号分子，利用同一系列荧光染料斯托克斯位移相近的特点，实现多个荧光标记物同步荧光检测；氧化石墨烯的荧光猝灭效率高，可作为荧光猝灭剂，灵敏度高；荧光染料标记抗体与待测抗原免疫反应进行检测，特异性强。首先将一定量的不同发射波长的带有琥珀酰亚胺酯的荧光染料分别与不同抗体偶联，加入氧化石墨烯后，荧光染料的同步荧光被猝灭；若加入与抗体相对应的不同量的抗原，则荧光猝灭程度不同，这样既可根据不同颜色荧光染料的同步荧光强度变化对抗原进行定性识别，还可以荧光强度变化值对抗原或病毒进行定量检测。具体地，为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将不同疾病标志物的单克隆抗体分别与不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料偶联后溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度均为I. 0X10—8 I. 0X10_4mOl/L的溶液A ；所述琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料为琥珀酰亚胺酯修饰的Alexa Fluor或Cy系列荧光染料；(2)将氧化石墨烯溶解于溶剂配制成I. OX 10_6 1. OX 10_5mol/L的溶液B ；所述步骤(I)和(2)中的溶剂为水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液；(3)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的比例按偶联物与氧化石墨烯摩尔比1:10 1:20 计；
(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，加入不同量的待测疾病标志物，用水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L后，取样以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的同步荧光强度；(6)将荧光染料的荧光强度回升值对应于抗原浓度作图，得到定量检测抗原的工作曲线；(7)在进行实际样品检测时，将处理好的待测溶液进行步骤(5)的操作，以同步荧光强度变化对抗原进行定性识别；或以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。
本方法用于四种抗原AFP、CEA、CA125和CA199及三种流感病毒Η1Ν1、Η5Ν1和Η9Ν2的定量检测，可在1-15分钟内完成。本发明方法与现有技术相比，具有以下优点和效果与蛋白质阵列分析及芯片技术相比，本方法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将本方法应用于抗原-抗体反应检测，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。多种抗原进行同时检测，只要选择不同颜色的荧光染料与抗体偶联再与氧化石墨烯作用，便可以建立一种通用的多种抗原检测新方法。基于荧光染料和氧化石墨烯均相免疫同步荧光检测，将实现肝癌标志物AFP、CEA、CA125和CA199的同时检测；亦可实现病毒如人体肠道病毒EV71，SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、柯萨奇B3病毒的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。本发明的检测方法响应快、亲水性好、灵敏度高、选择性好、通用性强。
图I为氧化石墨烯猝灭发射波长为512nm的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料AlexaFluor与流感病毒HlNl的单克隆抗体偶联物的荧光猝灭图和线性关系图；图2为氧化石墨烯猝灭发射波长为570nm的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料AlexaFluor与流感病毒H5N1的单克隆抗体偶联物的荧光猝灭图和线性关系图；图3为氧化石墨烯猝灭发射波长为620nm的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料AlexaFluor与流感病毒H9N2的单克隆抗体偶联物的荧光猝灭图和线性关系图；图4为三种流感病毒HlNl，H5N1和H9N2同时定量检测的同步荧光图(实施例1，各曲线自下而上对应的待测病毒浓度是从低到高);图5为定量检测流感病毒HlNl的工作曲线(实施例I)；图6为定量检测流感病毒H5N1的工作曲线(实施例I);图7为定量检测流感病毒H9N2的工作曲线(实施例I)。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明方法作进一步的描述，以便本领域的技术人员清楚地理解本发明，但以下实施例不以任何形式限制本发明请求保护的范围。
实施例I :一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将待测流感病毒H1N1、H5N1和H9N2的单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Alexa Fluor偶联并分离纯化后溶解于纯水中，配制成三种偶联物浓度均为I. OX 10_4mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；(2)将氧化石墨烯溶解于纯水中配制成I. OX 10_5mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用纯水定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的用量比例按三种偶联物总量与氧化石墨烯摩尔比1:10计；(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测 量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的待测流感病毒Η1Ν1、Η5Ν1和Η9Ν2 (三者同时加入)，然后均用纯水定容到600μ L，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各病毒浓度作图，得到定量检测各病毒的工作曲线。本方法用于三种流感病毒Η1Ν1、Η5Ν1和Η9Ν2的定量检测，HlNl的检出限为
O.48ng/mL,线性范围是 l_18ng/mL ；H5N1 的检出限为 O. 46ng/mL,线性范围是 1-18. 5ng/mL ；H9N2的检出限为O. 42ng/mL，线性范围是l_16ng/mL，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的流感病毒H1N1、H5N1和H9N2同时加入到血清样品中进行加标回收实验，获得了良好的实验结果，回收率在99. 4-101. 2%之间，如表I所示，自上而下依次是H1N1，H5N1和H9N2。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。表I
Added Found Recovery R.S.D.
(ng/mL) (ng/mL) (%)(%)
5.04.9S99.6().2Sample I 5.0 5.06 101.2 0.4
5.04.97 99.4 0.1
10.010.02 100.2 0.3Sample 2 10.0 10.05 100.5 0,4
10.09.96 99.6 0.2实施例2 一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将肝癌标志物AFP、CEA和CA125单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Cy3偶联并分离纯化后溶解于15mM pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成三种偶联物浓度均为I. OX 10_8mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；(2)将氧化石墨烯和石墨烯的混合物溶解于纯水中配制成总浓度为I. OX 10_6mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的用量比例按三种偶联物总量与氧化石墨烯和石墨烯混合物的摩尔比1:15计；(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的待测肝癌标志物AFP、CEA、CA125(三者同时加入到同一混合溶液中)，然后均用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的突光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各待测肝癌标志物浓度作图，得到定量检测待测肝癌标志物AFP、CEA和CA125的工作曲线。本方法用于肝癌标志物AFP、CEA、CA125的定量检测，检测AFP的检出限是O. 60ng/ mL，线性范围是I. l-17ng/mL;检测CEA的检出限是O. 72ng/mL，线性范围是I. 5-18ng/mL;检测CA125的检出限为O. 58ng/mL，线性范围是1.4-19ng/mL，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的肝癌标志物AFP、CEA和CA125同时加入到血清样品中进行加标回收实验，获得了良好的实验结果，回收率均在99. 5-101. 1%之间，RSD均在O. 3%以下。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。实施例3一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将炭疽病毒、艾滋病病毒和出血热病毒的单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Cy5偶联并分离纯化后溶解于纯水中，配制成三种偶联物浓度均为I. OX 10_5mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；(2)将石墨烯溶解于纯水中配制成I. OX 10_6mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的用量比例按三种偶联物总量与石墨烯摩尔比1:20 计;(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的炭疽病毒、艾滋病病毒和出血热病毒(三者同时加入到同一混合溶液中)，然后均用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的突光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各病毒浓度作图，得到定量检测各病毒的工作曲线。本方法用于病毒的定量检测，检测炭疽病毒的检出限为O. 68ng/mL，线性范围是
I.5-18ng/mL ;检测艾滋病病毒的检出限是O. 36ng/mL,线性范围是O. 9_12ng/mL;检测出血热病毒的检出限是O. 53ng/mL，线性范围是I. 4_16ng/mL，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的炭疽病毒、艾滋病病毒和出血热病毒同时加入到血清样品中进行加标回收实验，获得了良好的实验结果，回收率均在99. 3-101. 2%之间，RSD均在O. 3%以下。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。实施例4一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将禽流感病毒、出血热病毒和柯萨奇B3病毒的单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Alexa Fluor偶联并分离纯化后溶解于15mM pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成三种偶联物浓度均为I. OX 10_6mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；
(2)将氧化石墨烯溶解于纯水中配制成I. OX 10_5mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用纯水定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的用量比例按三种偶联物总量与氧化石墨烯摩尔比1:15计；(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的禽流感病毒、出血热病毒和柯萨奇Β3病毒(三者同时加入到同一混合溶液中)，然后均用纯水定容到600 μ L，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的突光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各病毒浓度作图，得到定量检测各病毒的工作曲线。本方法用于三种病毒的定量检测，检测禽流感病毒的检出限为O. 87ng/mL，线性范围是1.9-24ng/mL ;检测出血热病毒的检出限是O. 66ng/mL，线性范围是I. 4_19ng/mL ；检测柯萨奇B3病毒的检出限为O. 56ng/mL，线性范围是I. 2_20ng/mL，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的禽流感病毒、出血热病毒和柯萨奇B3病毒同时加入到血清样品中进行加标回收实验，获得了良好的实验结果，回收率在99. 5-101. 1%之间，RSD均在O. 3%以下。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。实施例5一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将肝癌标志物CEA、CA125和CA199的单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Alexa Fluor偶联并分离纯化后溶解于纯水中，配制成三种偶联物浓度均为I. OX 10_6mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；(2)将石墨烯溶解于纯水中配制成I. OX 10_5mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的比例按三种偶联物总量与石墨烯摩尔比1:16计；(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的CEA、CA125和CA199 (三者同时加入到同一混合溶液中)，然后均用15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600yL，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的突光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各肝癌标志物浓度作图，分别得到定量检测肝癌标志物CEA、CA125和CA199的的工作曲线。本方法用于三种癌症标志物的定量检测，检测CEA的检出限为O. 36ng/mL,线性范围是O. 8-12ng/mL ;检测CA125的检出限为O. 40ng/mL,线性范围是I. 0_15ng/mL ;检测CA 199的检出限为O. 45ng/mL，线性范围是I. 2_16ng/mL ;可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量其 在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的肝癌标志物CEA、CA125和CA199同时加入到血清样品中进行加标回收实验，获得了良好的实验结果，回收率在99. 2-101. 2%之间，RSD均在
O.2%以下。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。实施例6一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下(I)将乙肝病毒、禽流感病毒和SARS病毒的单克隆抗体分别与三种不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料Alexa Fluor偶联并分离纯化后溶解于溶剂中，配制成三种偶联物浓度为I. OX 10_4mol/L的溶液A，为三种偶联物的混合溶液；(2)将氧化石墨烯溶解于纯水中配制成I. OX 10_5mol/L的溶液B ；(3)取6 μ L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用纯水定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的用量比例按三种偶联物总量与氧化石墨烯摩尔比1:18计；(4)取溶液C 50(Tl000yL于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度；(5)取6μ L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3)，平行做多份，分别加入不同量的乙肝病毒、禽流感病毒和SARS病毒(三者同时加入到同一混合溶液中)，然后均用纯水定容到600yL，以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的荧光强度；(6)将各荧光染料的荧光强度回升值对应于各病毒浓度作图，得到定量检测各病毒的工作曲线。本方法用于三种病毒的定量检测，检测乙肝病毒的检出限为O. 25ng/mL，线性范围是O. 8-18ng/mL ;检测禽流感病毒的检出限为O. 30ng/mL,线性范围是O. 7_15ng/mL ;检测SARS病毒的检出限为O. 42ng/mL，线性范围是I. 0_22ng/mL，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液进行步骤(5)的操作，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的同步荧光强度，以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析。分别选取了两种不同浓度的乙肝病毒、禽流感病毒和SARS病毒同时加入到血清样品中进行加标回收实验,获得了良好的实验结果，回收率在99. 4-100. 9%之间，RSD均在O. 3%以下。加标回收实验结果说明本方法的准确度高。
权利要求
1.一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法，其步骤如下 (1)将不同疾病标志物的单克隆抗体分别与不同发射波长的琥珀酰亚胺酯修饰的荧光染料偶联后溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度均为I. OX 10_8 1. OX 10_4mol/L的溶液A ； (2)将氧化石墨烯溶解于溶剂配制成I.OX 10_61. OX 10_5mol/L的溶液B ； 所述步骤(I)和(2)中的溶剂为水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液； (3)取6ii L溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 u L得溶液C，溶液A和溶液B的比例按偶联物与氧化石墨烯摩尔比I: l(Tl: 20计； (4)取溶液C500^1000 u L于微量荧光比色皿中，以激发波长28(T480nm激发，测量其在发射波长35(T700nm处的同步荧光强度； (5 )取6 ii L溶液A与一定量的溶液B混合，两者的用量关系同步骤(3 )，加入不同量的待测疾病标志物，用水或15mM pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容到600 u L后，取样以相同的激发波长激发，测量各自在同一发射波长处的同步荧光强度； (6)将荧光染料的荧光强度回升值对应于疾病标志物浓度作图，得到定量检测抗原的工作曲线； (7)在进行实际样品检测时，将处理好的待测溶液进行步骤(5)的操作，以同步荧光强度变化对抗原进行定性识别；或以荧光染料的荧光强度回升值带入工作曲线进行定量分析。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述荧光染料为琥珀酰亚胺酯修饰的Alexa Fluor或Cy系列荧光染料。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述氧化石墨烯为氧化石墨烯纯净物、氧化石墨烯与石墨烯的混合物或石墨烯的纯净物。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述疾病标志物为流感病毒H1N1、H5N1、H9N2、肝癌标志物甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、糖链抗原CA125、糖链抗原CA199、人体肠道病毒EV71、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、乙肝病毒、柯萨奇B3病毒中的两种以上。
全文摘要
本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，具体公开了一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法。其步骤是首先将不同荧光染料分别与不同疾病标志物的抗体共价偶联后溶解于水或其他溶剂中，得反应液A；其次是将溶液A与氧化石墨烯溶液混合，得反应液B；第三是取反应液A、反应液B及水或其它溶剂混合，得混合溶液C；第四是在混合溶液C中加入抗原溶液，并将其转移至荧光比色皿中，测量同步荧光强度，进行定量分析和多指标分析诊断。本方法简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低、可实现高通量检测、多指标分析诊断和远程诊断。
文档编号G01N21/64GK102967708SQ20121043115
公开日2013年3月13日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者何治柯, 陈璐, 向东山 申请人:武汉大学