专利名称：一种琼脂糖凝胶膜基片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种琼脂糖凝胶膜基片及其制备方法与应用。
背景技术：
生物芯片的概念源自于计算机芯片。狭义的生物芯片是指包被在固相载体上的高密度DNA、蛋白质、细胞等生物活性物质的微阵列，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。对于广义生物芯片而言，除了上述被动式微阵列芯片之外，还包括利用光刻技术和微加工技术在固体基片表面构建流体分析单元和系统以实现生物分子进行快速、大信息量并行处理和分析的微型固体薄型器件。包括核酸扩增芯片、阵列毛细管电泳芯片、主动式电磁生物芯片等。
最近几年随着蛋白功能研究时代的到来，蛋白芯片技术已成为进行蛋白相关研究一种被广泛应用的技术。影响蛋白芯片技术应用有许多限制因素，其中最关键的是由于蛋白结构多样性和蛋白多级结构的存在，如何将蛋白分子固定于基片表面并保持蛋白活性的表面技术已成为蛋白芯片技术研究中一项关键性技术。目前用于蛋白样品固定的表面按化学修饰形式可分为一维、二维和三维结构，一维基片主要是在玻片表面修饰一层聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)或在表面进行硅烷化修饰上氨基、醛基、环氧、巯基基团等，一维基片由于其表面较为疏水，固定于基片表面的蛋白分子易变性，有较强的非特异吸附。二维基片表面主要有两种类型，一种是在表面修饰各种功能化的聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)化合物；另外一种是自组装表面，在镀金表面用长链烷基巯醇和长链烷基巯醇功能化的化合物进行自组装，二维基片表面在固定蛋白分子方面性能较佳，但存在化合物合成难题，不适合于大规模制备。三维基片表面主要有两种类型，一种是在玻片表面修饰上树枝状大分子化合物，然后在树枝状大分子表面修饰上双功能基团连接臂，用于同蛋白分子共价结合。如美国Fullmoon公司的“protein slides”即属于这种类型的用于蛋白固定的基片。这类三维基片表面较为稳定，并且蛋白分子同基片表面通过共价作用或高亲和力的方式结合，结合也很牢固。另一类三维结构基片是滤过膜(filter membrane)和水凝胶(hydrogel)的三维基片。滤过膜主要有聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)、硝酸纤维素(Nitrocellulose)膜用于蛋白芯片研究，这类膜通过静电力和疏水力等作用力同蛋白分子结合，具有蛋白固定量高的特点，但这类膜表面非特异吸附较强，如德国Schleicher and schuell公司的Fast Slides膜基片是一种硝酸纤维素膜基片。水凝胶(Hydrogel)基片是一类目前应用较多的三维基片，水凝胶基片通过扩散的方式固定蛋白。水凝胶分子为蛋白分子提供半湿(semi-wet)的环境，易于保持蛋白活性；水凝胶基片本身有自发荧光背景非常低且非特异吸附低，在玻片表面机械强度较好。如美国Perkin-Elmer Life Scienc公司的Hydrogel聚丙烯酰胺水凝胶基片即为此类基片中的一种。
发明内容
本发明的目的是提供一种带有多个独立区域的琼脂糖凝胶膜基片及其制备方法与应用。
本发明所提供的琼脂糖凝胶膜基片，是在基片表面形成琼脂糖凝胶膜，其中，所述琼脂糖凝胶膜被分隔成不少于两个的独立区域。
这里，常用分隔采用不高于1mm的橡胶或丝印桨料。基片选用玻璃基片。
该琼脂糖凝胶膜基片的制备方法，有两种方法方法一，包括如下步骤1)在基片上制备琼脂糖凝胶膜；2)将粘贴有双面胶的带有多个分隔区域的橡胶贴在琼脂糖凝胶膜表面形成不少于两个的独立区域，然后，在40～90℃下烘烤5分钟～2小时，得到所述琼脂糖凝胶基片；或者，采用丝网印刷方法在琼脂糖凝胶膜表面形成不少于两个的独立区域，然后，固化浆料，得到所述琼脂糖凝胶基片。
方法二，包括如下步骤1)将粘贴有双面胶的具多个分隔区域的橡胶贴在基片上，将基片分隔为不少于两个的独立区域；或者，在基片上将浆料通过丝网印刷方法印刷于基片表面，固化浆料，将基片分隔为不少于两个的独立区域；2)在各个区域内加入琼脂糖溶液，干燥成膜，经高碘酸钠溶液氧化，洗涤干燥得到所述琼脂糖凝胶基片。
这里，浆料可选用5100系列聚丙烯油墨、白干金属油墨、玻璃油墨等。
本发明的琼脂糖凝胶膜基片是一种性能优良的生物芯片基底材料，可广泛应用于各种生物芯片的制备上。
琼脂糖本身是一种高分子聚糖化合物，琼脂糖水溶液是一种水凝胶，能够在固体(如玻片/塑料片/硅片等)表面成膜；琼脂糖膜能够较好保持固定于其中的生物物质活性。本发明利用琼脂糖凝胶的良好成膜性和生物相容性，并将基片采用隔断方法将基片分隔为多个独立区域，由于分隔物的存在，使不同区域内的不同生物样品之间不会产生交叉污染。用含有多个独立分隔点样区域的琼脂糖凝胶片制备芯片时，可以实现多项指标样品和多份相同、不同生物样品的同时检测，大大提高了芯片检测效率。
图1是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为2×6个；图2是图1所示的仰视图；图3是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为1×2个；图4是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为3×8个；图5是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为4×4个；图6是点阵设置为1×2点阵琼脂糖凝胶基片制备蛋白芯片结果图；图7是点阵设置为2×5点阵琼脂糖凝胶基片制备蛋白芯片结果图；图8是点阵设置为2×6点阵琼脂糖凝胶基片制备抗核抗体检测芯片结果图。
具体实施例方式
本发明提供了一种含有多个独立分隔点样区域的琼脂糖凝胶基片，它含有独立分隔的区域数目不小于2个；这些分隔物可以是粘贴有双面胶的橡胶，也可以是疏水性丝网印刷浆料，并且这些分隔物不会破坏生物样品的活性。
其结构如图1-图5所示，其中，图1是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为2×6个；图2是图1所示的仰视图；图3是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为1×2个；图4是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为3×8个；图5是一种多点阵琼脂糖凝胶基片的主视图，点阵设置为4×4个。
该琼脂糖凝胶基片的制备方法可采用如下两种方法来制备方法一，在清洁玻片或基片表面首先形成多个面积相等的独立分隔区域，然后向多个独立分隔区域中分别加入一定浓度琼脂糖溶液，制备含有多个独立分隔区域的琼脂糖凝胶基片。为了能够在清洁玻片或基片表面首先形成多个面积相等的独立分隔区域，可以采用以下方法，但不仅限于以下方法。
在一定厚度的橡胶表面粘贴能够同玻片或基片表面能够结合的双面胶，双面胶和橡胶厚度之和不能够高于1mm，采用冲压方法在粘贴有双面胶橡胶表面形成所需要的多个面积相等的分隔区域；将该橡胶粘贴于清洁玻片或基片表面；然后，在这些通过橡胶分隔的区域中加入琼脂糖溶液，含有琼脂糖溶液的基片放置干燥成膜，成膜后琼脂糖基片放入高碘酸钠溶液中氧化，然后超纯水洗涤，离心甩干干燥。
同样，也可以在清洁玻片或基片表面用丝网印刷方法形成多个面积相等的独立分隔区域，将具有一定疏水性浆料通过丝网印刷方法印刷于玻片或基片表面，然后按所选择疏水性浆料性质在一定温度和时间条件下进行固化，固化后浆料厚度不能高于1mm。在这些通过疏水性浆料分隔区域中加入琼脂糖溶液，将含有琼脂糖溶液基片放置干燥成膜，成膜后琼脂糖基片放入高碘酸钠溶液中氧化，超纯水洗涤，离心甩干干燥。这里，浆料可选用5100系列聚丙烯油墨、白干金属油墨、玻璃油墨等。
方法二，在清洁玻片或基片形成整片琼脂糖膜，然后在琼脂糖基片表面粘贴含有多个独立分隔的橡胶围栏或通过丝网印刷方法在琼脂糖膜层表面形成多个独立分隔区域。
含有整片的琼脂糖可以采用浸润方法、滴加方法、刮膜方法和甩胶的方法制备浸润方法就是将清洁玻片或基片浸入一定浓度的琼脂糖溶液中，然后将玻片从溶液中取出，根据所要求膜厚度需要，可以反复多次，以形成较厚膜；滴加方法是将一定浓度溶液滴加于清洁玻片或基片表面，让琼脂糖溶液在整个玻片表面充分铺展，然后干燥成膜。刮膜方法是取一定浓度和一定量的琼脂糖溶液滴加玻片一端，然后用一定工具(如玻棒)将溶液通过刮的方法将琼脂糖溶液均匀分布于玻片或基片表面，干燥成膜；甩胶方法是将琼脂糖溶液滴加于玻片或基片表面，然后通过甩胶机将溶液在玻片或基片表面均匀分布，干燥成膜。
为了能够将整片琼脂糖膜分隔成多个独立分隔区域，可以采用以下方法，但不仅限于以下方法。将粘贴有双面胶的一定厚度的橡胶采用冲压方法在表面形成所需要的多个面积相等的分隔区域，将其粘贴于玻片或基片表面，双面胶和橡胶厚度之和不能够超过1mm。由于琼脂糖水凝胶特性，粘贴于琼脂糖膜表面的橡胶在水中容易脱落，这样可造成样品之间的污染，使在同一片琼脂糖基片表面不能够实现多样品的检测；为了能够将橡胶围栏牢固粘贴于琼脂糖膜表面，并且保证在芯片反应过程中不脱落，可以在多点阵橡胶围栏粘贴于琼脂糖膜表面后，放入烘箱中在一定温度下烘烤一定时间。在该方法中烘烤温度为40～90℃，烘烤的时间为5分钟～2小时；经过烘烤后橡胶围栏能够牢固粘贴于琼脂糖膜表面而在芯片反应过程中不脱落。
同样，也可以通过丝网印刷方法在琼脂糖膜表面形成需要的多个独立分隔的区域。通过丝网印刷方法将桨料丝印于琼脂糖膜表面，然后按浆料要求进行固化；通过丝网印刷到琼脂糖膜表面的桨料应该具有生物相容性，并且在其固化时不会造成琼脂糖膜的损害，丝网印刷后桨料厚度不高于1mm。
本发明所用玻璃基片通常是尺寸为75.6mm×25mm×1mm的显微镜通用载玻片，可以使用未经修饰的载玻片为基底材料，也可以对载玻片进行表面修饰。
本发明的的多个独立分隔点样区域琼脂糖凝胶基片是一种性能优良的生物芯片基底材料。以含有多个独立分隔点样区域的琼脂糖凝胶片制备芯片时，可以在采用美国Cartesian、Genomic Instrumentation、中国博奥生物等公司生产的微阵列点样仪按一定规则将多样品以阵列形式排布于多个独立分隔的琼脂糖凝胶基片表面，在进行芯片反应时可以将相同或不同的生物样品加入各独立分隔的琼脂糖凝胶基片点阵内进行生物反应。由于分隔物的存在，使加入的不同生物样品之间不会产生交叉污染。用含有多个独立分隔点样区域的琼脂糖凝胶片制备芯片时，可以实现多项指标样品和多份相同、不同生物样品的同时检测。
以下以具体的实施例来说明本发明。
实施例1、滴加法制备整片琼脂糖凝胶基片，然后用丝网印刷方法制备多点阵琼脂糖基片称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解；用加样枪取1000μL的琼脂糖溶液滴加到用H2O2/H2SO4(3∶7)洗液清洗的普通载玻片表面，让琼脂糖溶液在玻片表面均匀分布；然后室温下放置干燥成膜。
用光化学方法制备5行×2列的10点阵丝网板，丝网每点阵大小是10×10mm，两点阵中心距离为12mm；用杜邦疏水性浆料L8026(杜邦公司)在上述整片滴加的琼脂糖基片表面丝印5行×2列10点阵，丝网印刷后琼脂糖凝胶基片放入烘箱中加热固化，然后用超纯水清洗，清洗后基片放入0.1M的高碘酸钠(NaIO4)溶液中氧化反应30min；氧化反应后离心甩干，得到10点阵大小琼脂糖凝胶基片。
按相同光化学方法制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列等不同大小和不同点阵丝印板，按上述相同方法进行丝网印刷和高碘酸钠进行氧化，制备不同点阵形式的多点阵琼脂糖凝胶基片。
按以上相同方法，称量0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0克琼脂糖溶解于500ml超纯水中，制备不同浓度琼脂糖溶液，按上述方法滴加于清洁玻片表面制备整片滴加琼脂糖，然后按上述相同方法进行丝印制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的琼脂糖凝胶基片。
实施例2、浸润法制备整片琼脂糖凝胶基片，然后用丝网印刷方法制备多点阵琼脂糖基片称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解。用H2O2/H2SO4(3∶7)洗液清洗的普通载玻片30片插入30片装玻片架，将玻片架浸入溶解好的琼脂糖溶液中，玻片架迅速提出溶液，如此反复，让琼脂糖溶液均匀分布玻片表面；然后室温下放置自然挥发干燥成膜。
按实施例1中相同方法溶解不同浓度的琼脂糖溶液，进行基片表面的丝网印刷和氧化，制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的琼脂糖凝胶基片。
实施例3、甩胶法制备整片琼脂糖凝胶基片，然后用丝网印刷方法制备多点阵琼脂糖基片称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解。将用H2O2/H2SO4(3∶7)洗液清洗的普通载玻片放入甩胶机中，800μL的琼脂糖溶液滴加到玻片中央，以500转/分钟速度匀胶，以1000转/分钟甩胶，让琼脂糖溶液均匀分布在玻片表面；然后室温下放置自然挥发干燥成膜。
按实施例1中相同方法溶解不同浓度的琼脂糖溶液，进行基片表面的丝网印刷和氧化，制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的琼脂糖凝胶基片。
实施例4、先制备整片琼脂糖凝胶基片，然后用贴围栏方法制备多点阵琼脂糖凝胶基片称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解10min；保持琼脂糖溶液温度为40～80℃；按实施例1或实施例2或实施例3中相同方法制备整片滴加琼脂糖基片，按实施例1中方法用0.1M的高碘酸钠溶液氧化反应30min。
在天然橡胶表面粘贴双面胶，然后采用机械冲压方法在橡胶表面冲压出1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的橡胶围栏，将围栏粘贴于琼脂糖基片表面，放入烘箱中烘烤；烘完后琼脂糖基片室温放置自然冷却，得到多点阵围栏分隔的琼脂糖基片。
实施例5、先在玻片表面丝网印刷，然后用滴加法制备多点阵琼脂糖凝胶基片用光化学方法制备5行×2列的10点阵丝网板，丝网每点阵大小是10×10mm，两点阵中心距离为12mm；用杜邦疏水性浆料L8026在清洁载玻片表面丝印5行×2列的10点阵，放入烘箱中加热固化，然后用超纯水清洗，离心甩干得到分隔为10点阵的玻片。类似此方法，可以在玻片表面丝印有多点阵丝印围栏。
称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解。用加样枪在玻片每个丝印小格中加入30μL琼脂糖溶液，室温放置干燥；干燥后基片放入0.1M高碘酸钠(NaIO4)溶液中氧化反应30min；氧化反应后离心甩干，得到10点阵琼脂糖凝胶基片。
采用以上类似方法制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列和8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的琼脂糖凝胶基片。
实施例6、先在玻片表面粘贴多点阵围栏，然后用滴加法制备多点阵琼脂糖凝胶基片将厚度为0.5mm的天然橡胶表面粘贴双面胶，然后采用机械冲压，冲压出5行×2列的10点阵围栏，围栏每点阵大小是10×10mm，两点阵中心距离为12mm；然后将10点阵围栏粘贴于玻片表面。
称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解。用加样枪在玻片每个点阵中加入30μL琼脂糖溶液，室温放置干燥；干燥后基片放入0.1M高碘酸钠(NaIO4)溶液中氧化反应30min；氧化反应后离心甩干，得到10点阵琼脂糖凝胶基片。
采用以上类似方法制备1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×2列、8行×3列不同点阵大小和不同点阵形式的琼脂糖凝胶基片。
实施例7、多点阵琼脂糖凝胶基片应用于芯片制备生物芯片的制备过程如下1.将10mg/ml的人IgG样品用60％的甘油点样缓冲液(60％甘油/40％1×PBS)稀释，配制出1.0mg/ml的人IgG样品，取出10μL转移加入384孔样品板中；2.通过自动点样装置将准备好的点样液按照一定点阵方式排分配到10点阵的琼脂糖凝胶基片表面。每张芯片包含10(2行×5列)个阵列，每个阵列包含25个点，每个点间距离是400μm。每个阵列形成独立的反应腔；3.将点样后芯片室温放置固定过夜；4.固定后芯片用0.1％BSA溶液摇动封闭反应30min；5.封闭后芯片用超纯水清洗，然后离心甩干；6.在10点阵的琼脂糖基片每个孔中加入30μL的荧光标记的羊抗人抗体溶液，随后室温反应30min；7.反应后芯片用超纯水清洗，离心甩干；8.芯片扫描和数据处理。检测结果如图7所示。
图6所示的检测结果，可采用与上相同的方法进行，只需换用含2(1行×2列)个阵列的琼脂糖凝胶膜基片制备芯片即可。
实施例8、多点阵琼脂糖凝胶基片应用于抗核抗体检测芯片制备生物芯片的制备过程如下1.将各种抗核抗体样品用60％的甘油点样缓冲液(60％甘油/40％1×PBS)稀释到一定浓度，每种样品取出10μL转移加入384孔样品板中；2.通过自动点样装置将准备好的点样液按照一定点阵方式排分配到12点阵的琼脂糖凝胶基片表面。每张芯片包含12(6行×2列)个阵列，每个阵列包含63个点，每个点阵间距离是400μm。每个阵列形成独立的反应腔；3.将点样后芯片室温放置固定过夜；4.固定后芯片用0.1％BSA溶液摇动封闭反应30min；5.封闭后芯片用超纯水清洗，然后离心甩干；6.在12点阵的琼脂糖基片每个孔中加入30μL的血清样品，随后室温反应30min；7.反应后芯片用超纯水清洗，离心甩干；8.加入荧光标记的羊抗人抗体溶液，室温下反应30min；9.反应后芯片用超纯水清洗，离心甩干；10芯片扫描和数据处理。结果如图8所示。
权利要求
1.一种琼脂糖凝胶膜基片，是在基片表面具有琼脂糖凝胶膜，其特征在于所述琼脂糖凝胶膜被分隔成不少于两个的独立区域。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖凝胶膜基片，其特征在于所述分隔采用不高于1mm的橡胶或丝印桨料。
3.根据权利要求1或2所述的琼脂糖凝胶膜基片，其特征在于所述基片为玻璃基片。
4.权利要求1所述琼脂糖凝胶膜基片的制备方法，包括如下步骤1)在基片上制备琼脂糖凝胶膜；2)将粘贴有双面胶的带有多个分隔区域的橡胶贴在琼脂糖凝胶膜表面形成不少于两个的独立区域，然后，在40～90℃下烘烤5分钟～2小时，得到所述琼脂糖凝胶基片；或者，采用丝网印刷方法在琼脂糖凝胶膜表面形成不少于两个的独立区域，然后，固化浆料，得到所述琼脂糖凝胶基片。
5.权利要求1所述的琼脂糖凝胶膜基片的制备方法，包括如下步骤1)将粘贴有双面胶的具多个分隔区域的橡胶贴在基片上，将基片分隔为不少于两个的独立区域；或者，在基片上将浆料通过丝网印刷方法印刷于基片表面，固化浆料，将基片分隔为不少于两个的独立区域；2)在各个区域内加入琼脂糖溶液，干燥成膜，经高碘酸钠溶液氧化，洗涤干燥得到所述琼脂糖凝胶基片。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述浆料选自聚丙烯油墨、白干金属油墨、玻璃油墨。
7.权利要求1-3任一所述的琼脂糖凝胶膜基片在制备生物芯片上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种琼脂糖凝胶膜基片及其制备方法与应用。本发明所提供的琼脂糖凝胶膜基片，是在基片表面形成琼脂糖凝胶膜，其中，所述琼脂糖凝胶膜被分隔成不少于两个的独立区域。本发明利用琼脂糖凝胶的良好成膜性和生物相容性，并将基片采用隔断方法将基片分隔为多个独立区域，由于分隔物的存在，使不同区域内的不同生物样品之间不会产生交叉污染。用含有多个独立分隔点样区域的琼脂糖凝胶片制备芯片时，可以实现多项指标样品和多份相同、不同生物样品的同时检测，大大提高了芯片检测效率。
文档编号G01N35/00GK1818649SQ20061006505
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者潘满根, 杨文军, 邢婉丽, 徐峰, 王佳, 张梁, 程京 申请人:北京博奥生物芯片有限责任公司, 清华大学