专利名称：胆红素标准液及其制备方法和保存方法
技术领域：
本发明涉及天然胆红素或人工合成胆红素与载体活性蛋白的结合机理、利用白蛋白上的胆红素结合位点，胆红素与白蛋白形成复合物的反应；从而增强了胆红素标准液的抗氧化性和水溶性。以及规模生产工艺及保存方法。
背景技术：
胆红素是临床医学实验中常规检验项目之一，对肝胆疾病及溶血性疾病的诊断有着重要的意义。血中的胆红素分为结合胆红素和非结合胆红素。测定胆红素的常用方法有重氮法、酶法和直接氧化比色法；根据胆红素与重氮试剂的反应特点，将其分为直接胆红素和间接胆红素。临床医学实验测定胆红素时，一般测定总胆红素和直接胆红素。胆红素测定试剂盒种类繁多，方法各异，与之配套的标准品也不尽相同。不管采用那种方法来测定胆红素，胆红素标准品为临床医学检验必备。
天然胆红素或人工合成胆红素本身不稳定，见光容易分解，不易保存。由于国内目前没有统一的标准品供应，造成胆红素标准品的标准化问题得不到解决；目前市场上销售的胆红素标准品多为各种胆红素的混合物(或异构体)，不适于作为直接胆红素测定的标准物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗氧化性和水溶性的胆红素标准液及其制备技术和保存方法。
本发明采用模拟人体胆红素代谢途径中与蛋白质结合的反应；从而有效地利用白蛋白上的胆红素结合位点，胆红素与白蛋白形成复合物后，将胆红素包裹其中，增强了胆红素的水溶液，使冻干后的胆红素标准液复溶非常容易。白蛋白结合胆红素体积变大，并将胆红素完全包裹，从而阻隔氧气与胆红素接触，防止其被氧化；与冻干技术相结合有效地实现了胆红素标准液能较长期保存。本胆红素标准液是将天然胆红素或人工合成胆红素与牛血清白蛋白在碱性缓冲剂条件下相结合，再缓慢加入一定浓度的稳定剂，低温保存12小时，使胆红素与牛血清白蛋白充分作用并有效结合，形成较为稳定的胆红素-白蛋白结合物。待胆红素与牛血清白蛋白结合后，调整PH值至接近人体生理状态(7.15～7.35)；然后，按一定规格分装冻干、真空或冲氮、压盖密封保存。
本发明胆红素标准液配方组成原料为分析纯，每升浓度范围分别为碳酸钠0.053+-0.5g、0.1N氢氧化钠2.0-4.0ml、0.1盐酸0.5--2ml、蔗糖40--60g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)0.625-1.0g、碳酸氢铵4.94-5.5g、小牛血清8-12.0g、胆红素(Bilirubin)45--60.0mg、Proclin300 0.1-0.25u。
上述基础试剂配制方法如下①试剂I1.06％Na2CO3配制精称Na2CO3 1.06g置100ml容量瓶中，加蒸馏水至100ml刻度；②试剂II0.1N NaOH配制精称NaOH 0.4g置100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度即成；③试剂III0.1N HCl配制量取12N浓盐酸45ml，加蒸馏水至500ml即为0.1N HCl，④试剂IV10％蔗糖配制取Sucrose200g+EDTA-2Na 2.0g用DW溶解至2L加热溶解；⑤试剂VNH4HCO3配制称取19.75g NH4HCO3加蒸馏水至200ml，用HAC调PH至7.0±0.05；⑥试剂VI5.0％牛血清白蛋白配制称取40g BSA，用200ml试剂V溶解，加蒸馏水至400ml，最后用蒸馏水定容至800ml。
本发明胆红素标准液配制方法由以下工艺制成，(1)取试剂I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入试剂II0.1N NaOH3.0ml，混匀加酚酞作指示剂，用试剂0.1N HCl滴定至红色消失；(2)取胆红素200mg～220mg置100ml烧瓶中，加入试剂I 20.0ml、试剂II 12.0ml迅速混匀，10分钟内使其充分溶解，转入5L容器中，(3)慢加入试剂试剂IV10％蔗糖，600ml～720ml，边加边摇匀并用其清洗2～3次烧瓶，(4)慢加入试剂III0.1N HCl，边加边摇匀，再加试剂VI及蒸馏水定容至2000ml，4℃过夜避光保存，PH＝8.22；(5)装冻干前加入等体积的试剂IV(2000ml)混匀至总体积为4000ml加冰醋酸2.0ml，调PH＝7.12。
本发明胆红素标准液保存方法与成品鉴定1.保存方法①将配制好的胆红素标准液，充分混匀后每瓶2.0ml分装，25℃速冻，低温真空干燥10～12小时后，逐步升温至5～18℃继续真空干燥4～8小时便可自动真空压盖。
②如真空冻干设备无自动压盖装置，必须将冻干好的胆红素标准液冲入96％以上的氮气后压盖。
③真空干燥的胆红素标准液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期为4年。
2.成品鉴定①将冻干的胆红素标准液成品随机抽取30瓶，每瓶用2.0ml DW复溶冻干品，用T.Bil测定方法，在生化分析仪上测定λ＝492nm，其OD值为0.3±0.05，②胆红素标准液成品以测定胆红素的方法测定其值，“B”管OD值应小于0.01。
具体实施例实施例1本发明胆红素标准液配方组成原料为分析纯，每升浓度范围分别为碳酸钠0.055g、0.1N氢氧化钠2.40ml、0.1盐酸0.9ml、蔗糖50g、乙二胺四乙酸二钠盐EDTA-2Na 0.75g、碳酸氢铵5.0g、小牛血清11.0g、胆红素(Bilirubin)56.0mg、Proclin300 0.2u。
上述的胆红素标准液由以下工艺制成，(1)取试剂I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入试剂II0.1N NaOH 3.0ml，混匀加酚酞作指示剂，用试剂0.1N HCl滴定至红色消失，记录用量为x ml；(2)取胆红素200mg～220mg置100ml烧瓶中，加入试剂I 20.0ml、试剂II 12.0ml迅速混匀，10分钟内使其充分溶解，转入5L容器中，(3)慢加入试剂试剂IV10％蔗糖，600ml～720ml，边加边摇匀并用其清洗2～3次烧瓶，(4)慢加入试剂III0.1N HCl，4x ml，边加边摇匀，再加试剂VI及蒸馏水定容至2000ml，4℃过夜避光保存，PH＝8.22；(5)装冻干前加入等体积的试剂IV(2000ml)混匀至总体积为4000ml加冰醋酸2.0ml，调PH＝7.12。
上述的胆红素标准液的保存方法为(1)配制好的胆红素标准液，充分混匀后每瓶2.0ml分装，25℃速冻，低温真空干燥10～12小时后，逐步升温至5～18℃继续真空干燥4～8小时便可自动真空压盖；(2)空干燥的胆红素标准液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期为4年。
权利要求
1.一种胆红素标准液，其特征在于按以下组分和浓度范围制成，胆红素标准液配方组成原料为分析纯，每升浓度范围分别为碳酸钠0.043--0.62g、0.1N氢氧化钠2.0-4.0ml、0.1N盐酸0.5-2.0ml、蔗糖40--60g、乙二胺四乙酸二钠盐0.625-1.0g、碳酸氢铵4.94-5.5g、小牛血清8-12.0g、胆红素45--60.0mg、Proclin3000.1-0.25u。
2.一种如权利要求1所述的胆红素标准液的制法，其特征在于由以下工艺制成，(1)取试剂I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入试剂II0.1NNaOH3.0ml，混匀加酚酞作指示剂，用试剂0.1N HCl滴定至红色消失，记录用量为xml；(2)取胆红素200mg～220mg置100ml烧瓶中，加入试剂I20.0ml、试剂II 12.0ml迅速混匀，10分钟内使其充分溶解，转入5L容器中，(3)慢加入试剂试剂IV10％蔗糖，600ml～720ml，边加边摇匀并用其清洗2～3次烧瓶，(4)慢加入试剂III0.1N HCl，4x ml，边加边摇匀，再加试剂VI及蒸馏水定容至2000ml，4℃过夜避光保存，PH＝8.22；(5)装冻干前加入等体积的试剂IV(2000ml)混匀至总体积为4000ml加冰醋酸2.0ml，调PH＝7.12。
3.一种如权利要求1所述的胆红素标准液的保存方法，其特征在于(1)配制好的胆红素标准液，充分混匀后每瓶2.0ml分装，25℃速冻，低温真空干燥10～12小时后，逐步升温至5～18℃继续真空干燥4～8小时便可自动真空压盖；或将冻干好的胆红素标准液冲入96％以上的氮气后压盖；(2)空干燥的胆红素标准液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期为4年。
全文摘要
本发明为一种胆红素标准液及其制备方法和保存方法，胆红素标准液配方组成原料为分析纯，每升浓度范围分别为碳酸钠0.043－0.62g、0.1N氢氧化钠2.0－4.0ml、0.1N盐酸0.5－2.0ml、蔗糖40－60g、乙二胺四乙酸二钠盐0.625－1.0g、碳酸氢铵4.94－5.5g、小牛血清8－12.0g、胆红素45－60.0mg、Proclin3000.1－0.25u。本发明为一种具有抗氧化性和水溶性的胆红素标准液。
文档编号G01N33/50GK1664588SQ200510018340
公开日2005年9月7日 申请日期2005年3月4日 优先权日2005年3月4日
发明者颜箫, 周洪华 申请人:江西特康科技有限公司