专利名称：流式细胞仪专用溶血素及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志时所用溶血素及其制备方法与应用。
背景技术：
流式细胞仪已应用于科学研究和医学临床检验的各个领域，如免疫功能的检查，肿瘤抗原、转移基因与抑癌基因及其他疾病相关基因检测，细胞凋亡，艾滋病诊断与预后判断等。随着流式细胞仪的普及和应用，其配套试剂的开发和研制也显得越来越重要。目前，流式细胞仪所用溶血素基本依靠进口，主要有美国Becton Dickinson(BD)公司和Beckman Coulter公司的产品，其价格昂贵，并且不能及时供应，给使用者带来很大的不便和浪费。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供流式细胞仪专用溶血素及其制备方法与应用。
本发明流式细胞仪专用溶血素的组成如下NaCl5～12gNa2HPO4·12H2O 1～8g或Na2HPO4.2H2O 0.5～6g或K2HPO45～10gKH2PO40.1～0.6g或NaH2PO4.2H2O 0.1～3gKCl 0～0.5g多聚甲醛[(CH2O)n] 20～50g加双蒸水至 1L多聚甲醛分子式(CH2O)n，其中n＝8-100。
本发明流式细胞仪专用溶血素的制备方法如下1.原料称量将所需各种原料按以上配方比例分别称量。
2.配制将各种称量好的原料混合，置45-50℃水浴中4-5小时，其间每隔30-40分钟搅拌混匀一次。
3.过滤将上述溶液用双层滤纸过滤去除沉淀，即得本发明的溶血素。
然后进行产品分装将过滤好的产品进行分装，50ml/瓶。将分装好的产品贴好标签，标注使用说明及注意事项等。成品验收合格入库。
本发明流式细胞仪专用溶血素用于流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。具体可用于BD、Beckman Coulter或其它公司生产的各系列的流式细胞仪。
具体使用方法如下方法一1.按外周血溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟。
2.加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。
方法二1.使用前将溶血素用双蒸水10倍稀释，混匀。
2.按20∶1体积比将稀释溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。
与现有技术相比本发明的优良效果如下1.本发明流式细胞仪专用溶血素组分中包括多聚甲醛，多聚甲醛具有固定白细胞膜作用，可以最大程度地保护白细胞膜完整、不受破坏，并保持白细胞膜抗原性不受影响。多聚甲醛对血液中可能存在的病原微生物如乙肝病毒、SARS-CoV等具有固定作用，降低其毒性和传染性。以保护环境和实验操作人员免受病原生物的感染。
2.溶血素优选的PH值5.0-8.0，如果PH值太低或太高，对白细胞的破坏增加。本发明流式细胞仪专用溶血素组分中包括磷酸缓冲液，PH值为7.2-7.4，较为稳定，这一PH值接近人体血液的PH值，是白细胞生存的最适合PH值，能够保护白细胞免受破坏和抗原改变。
3.本发明流式细胞仪专用溶血素使用浓度中含有大量的水成分，这是使红细胞溶解的主要成分。水依靠低渗作用，使红细胞涨裂，达到红细胞溶解的作用。
4.本发明流式细胞仪专用溶血素各成分价格低廉，供应方便，容易获得，使产品成本和造价降低。
5.本发明流式细胞仪专用溶血素制作工艺简单，配置过程不需要昂贵的仪器设备条件，使生产简单易行。
6.本发明流式细胞仪专用溶血素使用方法简易，多样化，使用者可以根据自己的习惯自行选择，方便易行。
7.本发明流式细胞仪专用溶血素没有毒性，对使用者和环境无危害。
图1是使用本发明实施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图，可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。
图2是BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图。可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。另外还有一团较明显的细胞碎片，这是由于红细胞的溶解不彻底造成的。
图3、4分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD14表达直方图。
图5、6分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD14表达直方图。
图7、8分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD14表达直方图。
图9、10分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD45表达直方图。
图11、12分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD45表达直方图。
图13、14分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD45表达直方图。
具体实施方式
实施例1流式细胞仪专用溶血素的组成如下NaCl8gNa2HPO4.12H2O 2.89gKH2PO40.2gKCl 0.2g多聚甲醛30g加双蒸水至 1L制备方法1.原料称量将所需各种原料按以上配方比例分别称量。
2.配制将各种称量好的原料混合，放入50℃水浴中4小时，其间每隔30分钟搅拌混匀一次。
3.过滤双层滤纸过滤去除沉淀。
然后进行产品分装将过滤好的产品进行分装，50ml/瓶。将分装好的产品贴好标签，标注使用说明及注意事项等。成品验收合格入库。
表1是40例人抗凝外周血在本发明流式细胞仪专用溶血素实施例1和BD公司生产的溶血素分别作用下在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞CD14、CD45表达水平统计结果，二者比较具有高度一直性。这表明使用本发明流式细胞仪专用溶血素检测白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)膜抗原表达水平与使用BD公司生产的溶血素检测白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)膜抗原表达水平结果具有很好的一直性。
表1.使用本发明实施例1的溶血素和BD溶血素淋巴细胞、单核细胞、粒细胞CD14、CD45表达结果
本实施例溶血素具体使用方法为按外周血溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟。加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。用流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。
图1是使用本发明实施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图，可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。
图2是BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图。可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。另外还有一团较明显的细胞碎片，这是由于红细胞的溶解不彻底造成的。
图3、4分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。
图5、6分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。
图7、8分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。
图9、10分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。
图11、12分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。
图13、14分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。
实施例2.
制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下NaCl 7.2gNa2HPO4·12H2O 3.73gKH2PO40.43g多聚甲醛 40g加双蒸水至 1L实施例3.
制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下NaCl9gNa2HPO4·12H2O 6gNaH2PO4·2H2O 0.4g多聚甲醛25g加双蒸水至 1L实施例4.
制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下NaCl 7.2gK2HPO47.52gNaH2PO4·2H2O 1.49g多聚甲醛 30g加双蒸水至 1L
权利要求
1.流式细胞仪专用溶血素，其特征在于，组成如下NaCl5～12gNa2HPO4·12H2O 1～8g或Na2HPO4.2H2O 0.5～6g或K2HPO45～10gKH2PO40.1～0.6g或NaH2PO4.2H2O 0.1～3gKCl 0～0.5g多聚甲醛[(CH2O)n]，n＝8-10020～50g加双蒸水至 1L。
2.权利要求1所述流式细胞仪专用溶血素的制备方法，步骤如下(1)原料称量将所需各种原料按比例分别称量；(2)配制将各种称量好的原料混合，置45-50℃水浴中4-5小时，其间每隔30-40分钟搅拌混匀一次；(3)过滤将上述溶液用双层滤纸过滤去除沉淀，即得溶血素。
3.权利要求1所述流式细胞仪专用溶血素用于流式细胞仪检测血液白细胞各群表面标志。
4.如权利要求3所述流式细胞仪专用溶血素的用途，其特征在于使用方法如下按外周血∶溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟；加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解；用流式细胞仪检测。
5.如权利要求3所述流式细胞仪专用溶血素的用途，其特征在于使用方法如下使用前将溶血素用双蒸水10倍稀释，混匀；按20∶1体积比将稀释溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解；用流式细胞仪检测。
全文摘要
流式细胞仪专用溶血素及其制备方法与应用，属于医疗检测用试剂技术领域。溶血素主要由NaCl、Na
文档编号G01N33/50GK1632576SQ20051004200
公开日2005年6月29日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者肖东杰, 汪运山, 李晓英, 王戒, 黄平, 张慧林, 刘杰 申请人:济南市中心医院