专利名称：一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，主要适用于大批量蔬菜、水、土壤等样品中甲萘威残留的快速测定。属于酶免疫分析
背景技术：
氨基甲酸酯类杀虫剂是我国生产应用的主要杀虫剂类型，甲萘威是其中的一种，它的商品名是西维因。在我国甲萘威的生产量大，应用较广，用于防治水稻稻飞虱、稻叶蝉、棉花红铃虫、大豆食心虫等多种农作物害虫，也用于防治畜禽寄生虫和家用卫生杀虫剂，它的主要有毒代谢产物是1-萘酚。甲萘威被认为是一种安全的杀虫剂，但是很多学者的研究表明甲萘威对人畜有毒副作用如长期接触甲萘威，能够引起小鼠肝脏微粒体酶的变化，在离体培养条件下，引起大型粒状淋巴细胞免疫功能的变化；对动物具有亚慢性神经毒性。甲萘威的广泛应用，也引起人们对土壤、水源污染的关注，它在食品、水果及其制成品中的残留出现频率不断增加。我国强制性国家标准规定的儿种农产品中甲萘威的最高残留量如下。
表1 几种农产品中甲萘威的最高残留量
氨基甲酸酯类农药残留常用的分析方法主要是应用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器在实验室进行。应用这些理化分析技术对环境、生物、食品等样品中痕量甲萘威残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，又造成了新的环境污染。许多理化分析技术本身就具有局限性，如甲萘威的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术。
酶抑制法是目前使用最为广泛的农药残留速测法，它是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制作用原理而建立的一种农药残留检测方法，其灵敏度在0.1～10mg/L范围内，酶抑制速测法的缺点是酶大多数来源于动物或植物，材料昂贵，从不同材料中获取的酶的敏感程度和稳定程度不一样，且保存困难，该法只能用于一类农药的定性检测。
本发明以甲萘威单克隆抗体为基础，采用酶联免疫吸附分析方法。该方法特异性强、灵敏度高而且简便快速，可以弥补色谱分析方法和酶抑制方法的缺陷，因此本发明对于现实环境和食品样品中的甲萘威残留检测具有重要的意义。
发明内容
为了解决目前甲萘威农药残留色谱分析方法成本高、操作复杂以及酶抑制快速检测方法中特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、成本低、操作方法简单并能用于大批量样品快速检测的甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒。
甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒包括盒体、设在盒体内的可拆卸96孔酶标板、海绵托架和托架内试剂瓶装有的浓缩洗涤液、不同浓度的甲萘威标准液、抗甲萘威单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记半抗原、A液、B液、反应终止液等试液。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是首先设计合成甲萘威的半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸，再将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联后制备人工免疫原，免疫Balb/c小白鼠，取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备出甲萘威单克隆抗体。单克隆抗体被吸附于酶标板孔内，每孔抗体的含量相同。将半抗原与辣根过氧化物酶偶联制备酶标半抗原。在酶标板孔内先加入已知浓度的甲萘威标准液，然后加入酶标半抗原；孔内甲萘威和酶标半抗原相互竞争与固相单克隆抗体反应，由于每个孔中的固相抗体的含量均一致，所以当孔内的甲萘威浓度高时，则被抗体结合的酶标半抗原就少，加入底物液(A液)和显色液(B液)，显色反应浅(OD值低)，表明抑制率高；反之，当孔内甲萘威浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。当在孔内加入待测样品进行检测时，根据用已知甲萘威浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测甲萘威的浓度。
本发明的优点是能准确灵敏地检测水、土壤和蔬菜等食品中甲萘威残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。试剂盒在4℃的条件下保存期超过6个月。
四
附图为甲萘威的标准抑制曲线，曲线的回归方程为Y＝-0.3515X+1.0635(R2＝0.9812)，抑制50％抗原抗体反应所需浓度IC50＝39.8ng/mL，抑制20％抗原抗体反应所需浓度IC20＝5.6ng/mL。
五具体实施例方式
试剂盒操作从4℃冰箱中取出试剂盒，在室温下平衡5～10分钟备用；待测样品经前处理后，用稀释20倍后的PBST定容备用。拆开真空包装袋并取出酶标板，加入50μL的甲萘威标准液和处理好的样品到各孔中，标样和样品做2～4个重复；酶标半抗原按试剂盒操作要求用PBST稀释一定的倍数，再加入50μL到上述标样和待测样孔内，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗2～6次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加100μL混合液，在37℃条件下，暗处显色10～15分钟。最后每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。
结果计算将含0ng/mL标准液孔的OD值减去含最大浓度标准液孔的OD值定为B0，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B；以B/B0值为纵坐标，相应标准液浓度的对数值(logC)为横坐标，绘制甲萘威标准抑制曲线。根据曲线的回归方程可以推算出对应样品的浓度，也可以推算出甲萘威抑制50％抗原抗体反应所需浓度IC50(B/B0＝50％)及最小检测限IC20(B/B0＝80％)。
实施例1合成半抗原将5.6g NaOH(0.139mol)溶于56mL蒸馏水中；在溶液中加入20g1-萘酚(0.139mol)。混合物在85℃下搅拌反应1h，冷却至室温。在通风橱内缓慢加入过量的三光气(19.3g三光气+100mL甲苯；三光气剧毒，小心)，室温下搅拌反应1h。有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压脱掉有机溶剂，得棕色油状物质。将它溶于二氯甲烷，然后真空蒸馏(1mmHg)收集100℃的馏分，得13.7g(48％)淡黄色油状中间产物(氯甲酸萘基酯)。
称7.37g 6-氨基己酸(56.1mmol)溶于7.5mL 4mol/L的NaOH中，冷却至4℃。将6.25g中间产物(30.3mmol)溶于11mL1，4-二氧杂环己烷中，冷却至4℃，然后与7.5mL冷4mol/L NaOH混合，分5次等批量加入6-氨基己酸碱液中，每次加入至少间隔5min，混合液搅拌反应3h后，用浓盐酸将pH值调至4，这两步反应均在冰浴中进行。所得油状产物用乙酸乙酯萃取(3×35mL)，有机相用1mol/L的盐酸洗涤(2×15mL)，然后用1mol/L的NaHCO3萃取(3×50mL)，萃取液最后在冰浴中用pH3的浓盐酸酸化，得黄色固体物，用蒸馏水洗涤2次，干燥后得7.5g粗产物，用无水乙醇重结晶，干燥后得2g白色产物，产率65％，熔点128～130℃。白色产物即是半抗原。
实施例2制备免疫原和酶标半抗原(1)免疫原取半抗原约12.2μmol溶于200μL无水N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后按顺序加入2.9μL(约12.2μmol)三正丁胺、1.6μL(约12.3μmol)氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1h。反应液用1.8mL无水DMF稀释。
称30mg BSA溶于2mL碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH9.6)中，搅拌状态下分别往BSA溶液中逐滴加入100μL第一步反应液，约20min加完，室温下搅拌反应3h。然后透析、离心、冷冻干燥，4℃保存。
(2)酶标半抗原采用的方法与免疫原合成相同，将辣根过氧化物酶(HRP)替代BSA。最后在偶联物中加入等体积的甘油，-20℃保存。
实施例3甲萘威单克隆抗体制备(1)免疫Balb/c小白鼠，免疫原剂量每次为100μg/只，免疫前将免疫原稀释至一定的浓度。初次免疫时用弗氏完全佐剂与免疫原混合乳化，加强免疫用弗氏不完全佐剂，每2周免疫一次，共免疫5次，注射部位为小鼠背部皮下。最后一次免疫不用任何佐剂，小鼠腹腔注射。
(2)制备饲养细胞，取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤融合，脾细胞与骨髓瘤细胞比率为10∶1～3，融合剂为PEG2000；(3)融合后第8天，先以间接非竞争ELISA法检测融合细胞培养上清液抗体水平，OD值大于1.0的孔定为阳性。再用间接竞争ELISA法检测阳性细胞孔，加入的甲萘威浓度为1μg/mL，选择抑制率大于70％的阳性细胞进行克隆；(4)有限稀释法亚克隆3次，第3次克隆后，非竞争ELISA检测各细胞孔仍均为阳性者，即为筛选出的单克隆株，而后扩大培养及冻存；(5)动物体内诱生方法制备单克隆抗体。接种杂交瘤细胞将细胞瓶中培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下来，收集细胞，将细胞数调至106个/mL，注射1mL至预先用石蜡油处理过的小鼠腹腔中。
(6)接种杂交瘤细胞后7～9d开始收集腹水，腹水用饱和硫酸铵(S·A·S)盐析法沉淀收集单克隆抗体。
实施例4包被抗体(1)配制0.02mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，用缓冲液稀释单克隆抗体，抗体的浓度为2μg/mL，用微量加样枪将上述稀释液加入酶标板中(100μL/孔)，4℃过夜，弃缓冲液，用PBST洗板3次，在吸水纸上拍干。
(2)配制封闭液将1g BSA溶于100mL的0.02mol/L pH7.2 PBS中。往上述酶标板孔内加封闭液(150μL/孔)，在室温下封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤3次。拍干孔中的液体后抽真空包装。
实施例5试剂盒保存期实验将试剂盒放置于4℃保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的试剂盒进行实验，绘制标准抑制曲线，并根据回归方程计算IC50。保存期测定结果见表2表2 试剂盒保存期实验结果
从以上结果可以看出，不加甲萘威标准品的孔OD值变化小，IC50变化也不大，试剂盒在4℃下至少可保存6个月。
实施例6试剂盒特异性实验选择甲萘威的代谢物α-萘酚和常用氨基甲酸酯类农药克百威、叶蝉散、灭多威、涕灭威作为待测物，分别绘制这些待测物的标准抑制曲线，得到各种物质的抑制中浓度(IC50)，再用下式计算单克隆抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体对甲萘威的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。
交叉反应(CR％)＝IC50(甲萘威)/IC50(供试物)×100％。
本实验测定结果见表3，从表3可以知道，采用直接ELISA法，单克隆抗体对常用氨基甲酸酯类农药和α-萘酚的交叉反应均小于1％，说明该试剂盒的特异性好，可保证对样品中甲萘威残留测定结果的可靠性。
表3 交叉反应
实施例7添加回收实验取适量甲萘威标样添加到样品中，设置50μg/kg，100μg/kg和200μg/kg三个浓度，每个浓度设6个重复，进行测定。试剂盒测定结果与高效液相色谱(HPLC)测定结果比较。
ELISA检测样品的前处理水样加入10mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，过滤后即可取样进行ELISA分析。
土样取10g土壤用20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。
蔬菜样品取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g，20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。
试剂盒的检测结果见表4，水样回收率为87.45～93.46％，变异系数5.64～6.89％，土壤样品回收率为85.3～89.7％，变异系数5.30～5.88％，蔬菜样品回收率为88.9～92.45％，变异系数4.5～5.20％。试剂盒的回收率在允许范围内，而且与HPLC测定结果一致，符合农药残留分析对精确度的要求。
表4 试剂盒测定结果与HPLC测定结果的比较
权利要求
1.一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，其特征在于由盒体、可拆卸96孔酶标板、海绵托架和装有浓缩洗涤液、不同浓度的甲萘威标准液、辣根过氧化物酶标记半抗原、A液、B液和反应终止液的试剂瓶组成。所有试剂瓶安放在海绵托架的孔槽内，海绵托架及酶标板均安放在盒体内。
2.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的海绵托架上有装试剂瓶的孔槽。
3.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的辣根过氧化物酶标记半抗原为辣根过氧化物酶与半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸偶联的复合物。半抗原化学结构式 应用混合酸酐法偶联辣根过氧化物酶与半抗原。
4.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的可拆卸96孔酶标板用铝箔袋真空包装，酶标板的板条可从板架上拆卸下来，每个孔内均包被相同量的抗甲萘威单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗甲萘威单克隆抗体，其制备方法如下将半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸与牛血清白蛋白偶联的复合物作为免疫原，免疫Balb/c小白鼠后，取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交融合，筛选出能够稳定分泌抗甲萘威单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，然后收集腹水，可获取大量的单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的不同浓度的甲萘威标准液用甲醇和蒸馏水配制，溶液中甲醇的含量小于0.5％。浓度分别为0ng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，90ng/mL，270ng/mL，810ng/mL。
7.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液(PBST)内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾3～6g、吐温-20 1mL、双蒸水50mL。
8.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的A液过氧化尿10mg，103mg柠檬酸，358mg Na2HPO4·12 H2O，吐温-20 1μL，蒸馏水10mL，pH5；B液四甲基联苯胺(TMB)4mg(用500μL二甲亚砜溶解)，103mg柠檬酸，蒸馏水9.5mL，pH2.4。
9.根据权利要求1所述的一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的反应终止液为2mol/L的硫酸液。
全文摘要
本发明公布了一种甲萘威残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，属于酶免疫分析技术领域。本发明克服了甲萘威理化分析方法操作复杂、检测成本高及速度慢等缺点，能准确快速地检测水、土壤和蔬菜等食品中甲萘威残留。检测过程中，待测甲萘威和酶标半抗原相互竞争与酶标板孔壁上吸附的单克隆抗体反应，竞争结果通过酶催化反应显色显示出来。通过检测已知浓度的甲萘威并绘制标准曲线，可以推算出待测甲萘威的浓度。试剂盒的保存期超过6个月。
文档编号G01N33/543GK1687782SQ20051004198
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者许艇, 潘峰, 李季, 井德明 申请人:西安绿盾生物科技发展有限责任公司