专利名称：方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于刺激吞噬作用(特别是凋亡细胞的吞噬)的方法和手段。
载脂蛋白E(apoE)与载脂蛋白B一起构成了在富含甘油三酯的脂蛋白颗粒LDL和VLDL中存在的蛋白质的大部分。
apoE组分是LDL受体(LDLR)和LDL受体相关蛋白(LRP)家族的配体[Herz，J.和U.Beffert.2000.Nat Rev Neurosci 151]。小鼠中apoE基因的纯合缺失对胆固醇转运有显著的影响，由于无法进行由LDLR和LRP介导的从血液中清除这些脂蛋白而导致LDL和VLDL血浆水平的大大增加[Moghadasian，M.H.等人，2001.Faseb J152623；Zhang，S.H.等人，1992.Science 258468]。apoE缺陷型小鼠最明显的表型是类似早期人动脉粥样硬化的血管脂质病变的发展，甚至是发生在饮食中具有正常脂肪含量的情况下。
apoE基因的三种常见的等位基因变体存在于人中，称为apoε2、ε3和ε4，它们分别编码apoE2、E3和E4。
ApoE2和E4各自由于单个氨基酸取代而与最常见的E3同种型不同。与野生型apoε3纯合子相比，甚至单个拷贝的apoε4等位基因的存在也导致冠心病的风险增加[例如，见Davignon，J.等人，1988.Arteriosclerosis 81；Eichner，J.E.等人，2002.Am J Epidemiol155487]。apoε2等位基因与脂蛋白代谢中复杂的缺陷(如III型高脂蛋白血症)相关，并且依靠研究设计，已经与动脉粥样硬化的增加和降低相关联。apoE基因型和心血管疾病发病率之间的关联性的确切分子基础仍未明确。
apoε4等位基因的存在已经与阿尔茨海默病的风险增加[Corder，E.H.等人，1993 Science 261921、Poirier，J.等人，1993.Lancet 342697；Mahley，R.W.等人，2000.Annu Rev GenomicsHum Genet 1507]和骨质疏松症的风险增加[Cauley，J.A.等人，1999.J Bone Miner Res 141175；Salamone，L.M.等人，2000.JBone Miner Res 15308]相关联。实际上，apoE单倍型和一系列流行的病症之间的关联足够强，以至于apoE仍旧是已经明确与寿命相关的几个基因座之一apoε2等位基因在八十多岁的人中过量表达暗示apoE基因型有助于长寿[Schachter，F.等人，1994.Nat Genet629]。
ApoE也可能通过不依赖于脂蛋白转运的受体介导的信号传导级联反应来调控局部炎症。例如，apoE以及一种不结合胆固醇的14个氨基酸的受体结合肽能抑制对于体内实验性脑缺血的局部炎症反应[Lynch，J.R.等人，2001.J Neuroimmunol 114107；和Sheng，H.等人，1998.J Cereb Blood Flow Metab 18361]。细胞培养研究暗示，这种效果可以通过巨噬细胞功能的抑制来介导[Laskowitz，D.T.等人，1997 J Neuroimmunol 7670；和Laskowitz，D.T.等人，2001.Exp Neurol 16774]。在apoE缺陷型小鼠中慢性感染的研究得到了相似的结论，即apoE以某种方式抑制巨噬细胞的功能[Van Oosten，M.等人，2001.J Biol Chem 2768820；和Roselaar，S.E.和A.Daugherty.1998 J Lipid Res 391740；和de Bont，N.等人，1999.J Lipid Res 40680]。
本发明人已经发现了apoE基因的蛋白质产物(载脂蛋白E)的一种迄今未为人知的作用，即作为凋亡细胞清除的调控物。ApoE模拟物及刺激凋亡细胞清除的其他化合物可用于治疗一系列病症。
本发明的一个方面提供了鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于在个体中治疗与内源性apoE活性降低相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。
可以将在所述测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入与在测试化合物不存在时在相当的反应培养基和条件下的摄入相比较。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与内源性apoE活性降低相关的病状。
在一些实施方案中，可在测定凋亡细胞摄入前将巨噬细胞暴露于测试化合物。
与内源性apoE活性降低相关的病状可以是遗传起源的(例如，存在一个或多个apoE4等位基因)、环境起源的(例如，由暴露于高水平的胆固醇的细胞所产生的apoE减少)，或可以是选自以下的疾病状况阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。
在一些实施方案中，可在ApoE存在时测定摄入。例如，可以在ApoE水平正常的条件下实施方法，例如通过在含有生理水平的ApoE的缓冲液中使用野生型巨噬细胞和凋亡细胞(其中存在ApoE)。在这样的实施方案中，可以鉴定出是ApoE激动剂并相对于正常条件增加吞噬速率的测试化合物。在一些实施方案中，方法可以包括将巨噬细胞暴露于测试化合物并将所述巨噬细胞与凋亡多肽接触的步骤。
在其他实施方案中，方法可以在apoE不存在时进行，例如通过在无ApoE的条件下(例如使用不含任何apoE的培养基和缓冲液)使用ApoE缺陷型巨噬细胞和凋亡细胞(例如来源于apoE缺陷型小鼠的细胞)进行。在这样的实施方案中，可以鉴定出重现apoE刺激凋亡细胞吞噬的功能的测试化合物。方法可以包括测定在测试化合物存在时在无ApoE的条件下ApoE缺陷型巨噬细胞对ApoE缺陷型凋亡细胞的摄入。
在此显示出减少的凋亡细胞清除，导致明显的促炎症表型。在此描述的方法可用于鉴定具有抗炎性质的化合物。合适的化合物刺激凋亡细胞清除、减少募集如此多的巨噬细胞至发炎组织的需要、减少由所述吞噬细胞产生炎症介质并因而导致全身性的抗炎作用。因此，在此描述的方法可用于鉴定治疗剂，所述治疗剂可用于广泛的具有炎性组分的疾病，即使这样的疾病并不是明确地与apoE功能降低或对细胞碎片清除的需求增加相关。
本发明的另一个方面提供了鉴定和/或获得用于治疗或预防与炎性活性增加相关的病状的化合物的方法测定在测试化合物存在时ApoE多肽刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力。
可将ApoE多肽在所述测试化合物存在时对于巨噬细胞摄入或吞噬凋亡细胞的刺激与在测试化合物不存在时在相当的反应培养基和条件下的摄入相比较。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与炎性活性增加相关的病状。
ApoE多肽可以是来自任何哺乳动物物种的ApoE多肽，例如小鼠ApoE或人ApoE(例如人ApoE2、ApoE3或ApoE4)，或可以是其片段或变体，所述片段或变体保留了野生型蛋白的一种或多种活性，特别是对于凋亡细胞吞噬的刺激。
例如，ApoE多肽可以含有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人ApoE3具有大于约30％、大于约40％、大于约45％、大于约55％、大于约65％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％的序列同一性。所述序列可以与人ApoE3具有大于约30％的相似性、大于约40％的相似性、大于约50％的相似性、大于约60％的相似性、大于约70％的相似性、大于约80％的相似性或大于约90％的相似性。
序列相似性和同一性通常是参考算法GAP(Genetics ComputerGroup，Madison，WI)来定义的。GAP使用Needleman和Wunsch算法来比对两个完整序列，所述算法使得匹配的数目最大化并使得缺口的数目最小化。通常，使用默认参数，缺口形成罚分(gap creationpenalty)＝12和缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝4。可以优选使用GAP，但也可以使用其他算法，例如BLAST(其使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA 852444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol Biol.147195-197)或Altschul等人(1990，同前)的TBLASTN程序，通常采用默认参数。特别是，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。序列同一性和相似性也可以用GenomequestTM软件(Gene-IT，Worcester MA USA)来测定。
序列比较优选在本文描述的全长相关序列上进行。
相似性允许“保守变化”，即一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被置换成另一个疏水性残基，或一个极性残基被置换成另一个极性残基，例如精氨酸置换为赖氨酸、谷氨酸置换为天冬氨酸或者谷氨酰胺置换为天冬酰胺。
在一些实施方案中，ApoE多肽可以是哺乳动物的ApoE多肽，例如具有数据库登录号为AAH83351.1的序列的鼠ApoE或具有数据库登录号为P02649或NP_000032.1的序列的人ApoE或在此描述的等位基因变体。
全长序列的片段可以由比全长序列少的氨基酸组成。例如片段可以由全长序列的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、或至少100个氨基酸，但是290个或更少、280个或更少、270个或更少、260个或更少、250个或更少、240个或更少、230个或更少、220个或更少、210个或更少或2000个或更少的氨基酸组成。
与炎性活性增加相关的病状可以包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠应激综合征、克罗恩病、中风、心肌梗死、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、牛皮癣或接触性过敏性皮炎。
在一些实施方案中，所述ApoE多肽可以在巨噬细胞和/或凋亡细胞的表面上。在另外的实施方案中，所述ApoE多肽可以存在于反应培养基中。
在一些实施方案中，测试化合物刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力可以在ApoE不存在时测定。鉴定和/或获得用于治疗或预防与炎性活性增加相关的病状的化合物的方法可以包括测定在测试化合物存在时ApoE缺陷型巨噬细胞对一种或多种凋亡的ApoE缺陷型细胞的摄入。
ApoE缺陷型细胞可以例如从ApoE缺陷型小鼠获得，所述缺陷型小鼠可以根据已知的方法产生，如在此描述的。
可以将在所述测试化合物存在时ApoE缺陷型巨噬细胞对凋亡细胞的摄入与在测试化合物不存在时在相当的ApoE缺乏性反应培养基和条件下的摄入相比较。
细胞碎片在个体中的积聚可以导致重大的医学问题，所述细胞碎片积聚是例如由组织创伤(例如颅脑损伤或枪伤)或蔓延性传染疾病(例如细菌性脓毒症、胰腺炎或心包炎)引起的。
在此描述的方法可以用于鉴定和/或获得刺激凋亡细胞清除并可用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的化合物。
鉴定和/或获得用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的化合物的方法可以包括测定在测试化合物存在时ApoE多肽刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力。
可将ApoE多肽在所述测试化合物存在时对于巨噬细胞摄入或吞噬凋亡细胞的刺激与在测试化合物不存在时在相当的反应培养基和条件下的摄入相比较。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时刺激的增加可以表明，所述化合物可用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状。
在一些实施方案中，所述ApoE多肽可以在巨噬细胞和/或凋亡细胞的表面上。在另外的实施方案中，所述ApoE多肽可以存在于反应培养基中。
与凋亡细胞积聚相关的病状包括组织创伤、创伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征、细菌性脓毒症、胰腺炎或心包炎。
在一些实施方案中，测试化合物刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力可以在ApoE不存在时测定。鉴定和/或获得用于治疗或预防与凋亡细胞积聚相关的病状的化合物的方法可以包括在测试化合物存在时将ApoE缺陷型巨噬细胞与一种或多种凋亡的ApoE缺陷型细胞接触；和测定巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。
可以将在所述测试化合物存在时ApoE缺陷型巨噬细胞对凋亡细胞的摄入与在测试化合物不存在时在相当的ApoE缺乏性反应培养基和条件下的摄入相比较。
巨噬细胞是大的单核吞噬细胞，其存在于血液、淋巴和其他组织中，并摄入外源物质和细胞碎片，包括凋亡细胞。巨噬细胞参与特异性和非特异性的免疫应答。
用于本发明方法的巨噬细胞可以是培养的巨噬细胞。培养的巨噬细胞可以通过一系列合适方法的中的任一种方法获得，所述的合适方法包括例如，新制备的人外周血单核细胞的体外分化(例如通过暴露于佛波醇酯类)；单核细胞系(例如人骨髓单核细胞系THP-1)的体外分化；以及通过用无菌缓冲液洗涤动物(如小鼠或大鼠)的腹膜并培养得到的腹膜渗出物来制备腹膜巨噬细胞。
凋亡细胞是正在经历或已经经历凋亡(或程序性细胞死亡)的细胞。用于本发明方法的凋亡细胞优选是哺乳动物细胞，并且可以来自与所述巨噬细胞相同的组织、相同的生物体或相同物种的生物体，或可以来自不同的组织、生物体和/或物种。便利地，凋亡的胸腺细胞可用于本发明方法。
一系列用于获得凋亡细胞的合适方法是本领域已知的，所述的合适方法包括，例如，从培养的初级淋巴细胞(通常是胸腺细胞)撤除血清；用凋亡诱导剂(例如Fas配体或粒酶B)处理培养的细胞；以及用可选择的凋亡诱导细胞表面标记物(如膜联蛋白V结合)分离经历体内凋亡的细胞。通常，要使用的群体中多于50％的细胞将经历凋亡，凋亡可以这样确定，例如，通过用标记的膜联蛋白V染色，或通过对活性的胱天蛋白酶3进行染色。
巨噬细胞对凋亡细胞的摄入可通过任何便利的方法测定。例如，可将固定数目的凋亡细胞加入至在例如多孔平板的重复孔(replicatewells)中的巨噬细胞或巨噬细胞群中，浓度范围是每个巨噬细胞0.1个凋亡细胞至每个巨噬细胞1,000个凋亡细胞，通常是每个巨噬细胞1-100个凋亡细胞。在优选的实施方案中，测试化合物在当发生吞噬作用时的整个时间过程中存在于培养基中。
可将巨噬细胞与凋亡细胞孵育确定的一段时间，在这段时间中发生吞噬作用。通常，孵育在25℃-40℃的温度下，更通常在37℃下进行。可以选择孵育的持续时间，使得可检测数目的凋亡细胞被摄取，但是少于50％的所加入的总凋亡细胞被摄取(这样使得凋亡细胞的可用性不至于限制进一步的吞噬作用)。这可以例如在37℃下进行10分钟至10小时，更通常是30分钟至2小时。
在一些实施方案中，可以测定已经通过吞噬作用而被摄取入巨噬细胞中的凋亡细胞的数目或比例。这可以方便地如此来完成检测加入至巨噬细胞的凋亡细胞，并将在巨噬细胞外或在其外表面上的凋亡细胞与在巨噬细胞内或在其内表面上的凋亡细胞区分开。
凋亡细胞可以通过本领域已知的任何合适方法来检测，并通过在诱导凋亡前预先标记细胞而方便地完成。一系列合适的标记和染料可商购获得，包括Cell Tracker Green(Molecular Probes Inc.)。然后可以通过在合适的条件下检测所述标记(例如通过显微术)来鉴定经标记的凋亡细胞并计数。
内部和外部的凋亡细胞可以通过在一定条件下洗涤所述巨噬细胞来区分，在所述条件下，在巨噬细胞外或粘附在其外表面上的凋亡细胞被移除并丢弃，而在巨噬细胞内或粘附在其内表面上的凋亡细胞被保留。可采用移除外部而不是内部的凋亡细胞的任何合适的洗涤过程，包括例如一系列使用冰冷的Dulbecco’s PBS的洗涤。洗涤后，可计算摄入的凋亡细胞的数目，同时计算实施吞噬作用的巨噬细胞的总数。
吞噬速率可以从在确定时期内发生的吞噬作用的程度来测定，并可以方便地表示为每小时每个巨噬细胞摄取的凋亡细胞(例如胸腺细胞)的数目。通常，在吞噬作用刺激物不存在时，该值在野生型细胞中为0.1-100。例如，对于鼠腹膜巨噬细胞摄入凋亡的胸腺细胞，该值可以为2-4，以及对于apoE缺陷型巨噬细胞摄入apoE缺陷型胸腺细胞，该值可以为0.5-1。
所述测试化合物的效用可以表示为，相对于未暴露于所述化合物的对照细胞，该值的倍数变化。将重组人apoE作为测试化合物的典型应答显示于图2中。
所述测试化合物可以以合适的浓度加入，所述合适的浓度通常通过根据所使用的化合物类型的试验和误差来确定，但是通常在10pM和10mM之间，更通常在1nM和100μM之间。所述测试化合物可以加入至本领域已知的任何合适的生物学相容性缓冲液中，在所述缓冲液中所述化合物是充分溶解的，例如DMSO、乙醇、甲醇、DMSO、DMA、DMF或水。
通常，将培养的巨噬细胞暴露于不同浓度的测试化合物(包括仅暴露于媒介物的对照)，例如可将化合物以2-10孔(更通常地是3-5孔)的组加入至多孔板的重复孔中。然后可以让所述细胞暴露于所述测试化合物多种不同的时间段(从数分钟至数小时或更长)，通常在37℃下。
适合用于本发明方法的测试化合物可以是小的化学实体、肽、抗体分子或要检测其对凋亡细胞吞噬的影响的其他分子。可以使用天然的或合成的化合物，或可以使用含有数种经表征或未表征的组分的植物提取物。
合适的测试化合物可选自化合物集合和设计的化合物。组合文库技术(Schultz，JS(1996)Biotechnol.Prog.12729-743)提供了有效的方法来测试潜在大量的不同物质刺激凋亡细胞吞噬的能力。
在一些优选的实施方案中，合适的测试化合物可以是哺乳动物ApoE多肽(例如人ApoE)的肽片段或其类似物、模拟物、衍生物或修饰物。例如，可以检测ApoE的5-40个氨基酸(例如6-10个氨基酸)的肽片段刺激凋亡细胞吞噬的能力。
ApoE的肽片段可以通过本领域已知的任何肽合成方法来产生，例如通过化学合成或重组体的体外或体内表达。
ApoE肽可以全部或部分通过化学合成来产生。在此描述的ApoE肽可以容易地根据已为大家接受的、标准的液相或优选固相肽合成方法来制备，上述方法的一般描述可广泛地获得(见，例如J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，PierceChemical Company，Rockford，Illinois(1984)；M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，SpringerVerlag，New York(1984)；Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California；Roberge，J.Y等人，(1995)Science 269202-204；Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.215-223；Horn，T.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232；以及Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)，或者可以在溶液中通过液相方法或通过固相、液相和溶液化学的任意组合来制备，例如通过首先完成各个肽部分，然后，如果需要并且合适，在去除存在的任何保护基团后，经各个碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应而引入残基X。自动化合成可以例如使用ABI 431 A肽合成仪(Applied Biosystems)来完成。
ApoE肽可以具有氨基末端(N-末端)封端基团(例如乙酰基)和/或羧基末端(C-末端)封端基团(例如酰胺基团)以便在使用过程中保护末端残基免于不需要的化学反应，或者允许对所述肽进行进一步的缀合或操作。例如，如上面描述的肽片段的调节性质可以通过添加一种下列基团至C末端来增强氯甲基酮、醛和硼酸。这些基团是丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸蛋白酶的过度态类似物。肽片段的N末端可以用苄基羰基(carbobenzyl)封闭以抑制氨肽酶并提高稳定性(Proteolytic Enzymes，第二版，由R.Beynon和J.Bond编，Oxford University Press 2001)。
新合成的肽可以通过制备型高效液相色谱(例如，Creighton，T.(1983)Proteins，Structures and Molecular Principles，W HFreeman and Co.，New York，N.Y.)或本领域可利用的其他类似技术而得到实质上的纯化。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解法)来确认。
ApoE肽的重组体体内或体外产生可通过如此来达到，即使用常规重组技术来表达含有编码性核苷酸序列的核酸。
其他候选化合物可以基于，建立ApoE的3-维结构模型并利用合理药物设计以提供具有特定分子形状、大小和电荷特性的有效的增强剂化合物。合理药物设计的方法和手段是本领域熟知的。
通过上述方法鉴定的化合物的效用可以在第二轮筛选中评估。例如，所述化合物对在此描述的病状的一种或多种症状的影响可以在动物模型中进行体内测定。
当合适时，可以在本文描述的方法中进行对照实验。合适的对照的实施完全在本领域技术人员的能力和技能范围内。
在此描述的方法可以包括将测试化合物鉴定为刺激、增强或提高凋亡细胞吞噬的试剂。
可以分离和/或纯化所述经鉴定的化合物。在一些实施方案中，所述化合物可以用常规的合成技术来制备、合成和/或生产。
任选地，用在此描述的方法被鉴定为刺激凋亡细胞吞噬的试剂的化合物可以进行修饰或接受合理药物设计技术，以优化活性或在施用给个体时提供其他有利特性例如增加的半衰期或减少的副作用。
然后可以进行进一步的优化或修饰，以得到一种或多种最终化合物或达到体内或临床测试。
通过上述的本发明方法产生的化合物可以与本领域技术人员熟知的可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他物质一起制备成组合物，例如药物、药物组合物或药物。
可药用赋形剂或其他物质应该是无毒性的，并且不应该干扰活性成分的效力。载体或其他物质的确切性质取决于施用途径，所述的施用途径可以是口服或者注射施用，例如皮肤、皮下或静脉内注射施用。
生产用于治疗本文描述的病状的药物组合物的方法包括使用本文描述的方法来鉴定和/或获得刺激凋亡细胞吞噬的化合物，和将由此鉴定的化合物与可药用载体混合。
如上面描述的，可以修饰所述化合物以优化其药学性质。
用于制备用于治疗本文描述的病状的药物组合物的方法包括
i)鉴定和/或获得刺激凋亡细胞吞噬的化合物，例如使用本文描述的方法，ii)合成所述鉴定的化合物，和iii)将所述化合物整合进药物组合物中。
除了被鉴定为凋亡细胞吞噬的刺激物的化合物之外，药物组合物还可以包含可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可以包含固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖的溶液或者二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、皮肤或皮下注射或在病患位点处注射，所述组合物可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液是无致热源的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能使用例如，等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液而很好地制备合适的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
本发明包括用上面描述的方法鉴定和/或获得的化合物(作为可用于治疗在此描述的病状的试剂)，含有这样的化合物的药物学或兽医学组合物、药物、药品或其他组合物，包括施用这样的组合物至个体(例如，人或非人动物)以治疗(可以包括预防性治疗)在此描述的病状的方法，这样的化合物在制备用于施用(例如用于治疗在此描述的病状)的组合物中的用途，以及制造药物学或兽医学组合物的方法，所述方法包括将这样的化合物与赋形剂、媒介物或载体(例如可药用赋形剂、媒介物或载体)以及任选其他成分混合。
所述化合物的施用优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(根据具体情况而定，尽管预防可以被认为是疗法)来进行，这足以显示出对所述个体的益处。施用的确切量以及施用的速率和时程将取决于所要治疗的病状的性质和严重性。治疗的处方，例如剂量的决定等，在普通执业医生和其他医学博士的职责范围之内。
本发明的其他方面涉及将ApoE多肽及其模拟物用于刺激凋亡细胞的清除，例如用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状。
用于在个体中治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的方法可以包括增加所述个体中ApoE的表达和/或活性。
与凋亡细胞积聚相关的病状包括组织创伤、创伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征、细菌性脓毒症、胰腺炎或心包炎。
ApoE活性可以例如通过向所述个体施用ApoE多肽或其模拟物来增加。
ApoE多肽在上面有更详细的描述。
ApoE模拟物是保留了ApoE刺激凋亡细胞吞噬的活性的化合物。ApoE模拟物可以例如通过如此来产生确定所述化合物的特定部分，所述特定部分在决定靶性质中是关键和/或重要的。这可以例如通过系统地改变所述肽中的氨基酸残基(例如通过依次置换每个残基)来完成。构成ApoE的活性区域的这些部分或残基被称为其“药效团”。
一旦找到药效团，就使用来自一系列来源(例如光谱技术、X-射线衍射和NMR)的数据根据其物理性质(例如立体化学、成键、大小和/或电荷)来将其结构建立模型。在该建模过程中可以使用计算分析、相似性作图(其建立了药效团的电荷和/或体积的模型，而不是原子间的成键)和其他技术。
然后可选择一个模板分子，在所述模板分子上可连接模拟所述药效团的化学基团。所述模板分子和连接在其上的所述化学基团可方便地选择，以便所述经修饰的化合物易于合成，有可能是药理学上可接受的，并且在体内不降解，同时保留刺激凋亡细胞的吞噬的能力。然后，可以将通过这种方法产生的ApoE模拟物用在此描述的方法进行筛选以观察它们是否刺激凋亡细胞的吞噬或达到何种程度。
本发明的其他方面提供了用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的ApoE多肽或其模拟物，并提供了ApoE多肽或其模拟物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状。
本发明的其他方面涉及刺激凋亡细胞的清除，例如在治疗与内源性apoE减少或炎性活性增加相关的病状中。
用于在个体中治疗与内源性apoE减少或炎性活性增加相关的病状的方法可以包括施用刺激凋亡细胞的吞噬的化合物。
所述化合物可以是人ApoE的肽片段或其类似物或衍生物。合适的化合物在上面有更详细的描述。
与内源性apoE减少相关的病状可以选自阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。
与炎性活性增加相关的病状可以选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠应激综合征、克罗恩病、中风、心肌梗死、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、牛皮癣和接触性过敏性皮炎。
本发明的其他方面提供了刺激凋亡细胞的吞噬的化合物，所述化合物用于治疗与内源性apoE减少或炎性活性增加相关的病状，以及提供了刺激凋亡细胞的吞噬的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与内源性apoE减少或炎性活性增加相关的病状。
鉴于本公开内容，本发明的各种进一步方面和实施方案对于本领域技术人员来说将会是明显的。在该说明书中提到的文献以其整体在此引用作为参考。
本发明包括上面描述的特征的每一个以及全部组合和亚组合。
现在，本发明的某些方面和实施方案将会通过实施例并参考下述附图来举例说明。
图1显示了构成对于损伤的组织应答的三条途径。组织损伤(例如中风期间的脑梗死，显示在正常的(左边)和梗死的(右边)脑的顶部图像中，所述的脑经染色而显示了受损区域(白色))后，身体必须应付来自受损细胞的细胞因子和其他产物的释放、损失的组织的功能丧失以及碎片和凋亡细胞的清除。所述应答的这第三个分支在某些个体(例如在apoE基因中具有某些多态性的那些个体)中可能不太活跃。
图2显示了在体外apoE缺乏对于吞噬作用的影响。(a)于37℃下摄取经标记的凋亡胸腺细胞30分钟后，巨噬细胞的荧光显微照片。在对照图像中没有加入胸腺细胞。该图像以高增益(gain)捕获，这样使得除了经标记的胸腺细胞(箭头)之外，未标记的巨噬细胞也通过自发荧光而可见。比例尺为25μm。(b)从图像(如在(a)中显示的那些)中定量每个巨噬细胞摄取的野生型胸腺细胞的数目。将十个视野中胸腺细胞的总数除以巨噬细胞的总数。值为来自在三次实验的每次实验中的三份重复孔(triplicate wells)的平均值±SEM。(c)定量每个巨噬细胞摄取的apoE缺陷型胸腺细胞的数目。还显示了用1μM可溶性重组人apoE3进行预孵育的效果。(d)于37℃下摄取经荧光标记的胶乳小珠30分钟后，巨噬细胞的典型的流式细胞术直方图。没有摄取小珠的细胞具有低的荧光强度(FL1-H)，而摄取1、2、3或更多个小珠的细胞逐步变为更高的荧光强度。野生型巨噬细胞的典型直方图以黑色显示，apoE缺陷型巨噬细胞的典型直方图以红色显示。(e)从流式细胞术直方图(如在(d)中显示的直方图)定量每个巨噬细胞摄取的胶乳小珠的数目。值为在三个独立实验的每个实验中的三份重复孔的平均值±SEM。
图3显示了小鼠肝脏的TUNEL染色。(a)来自apoE缺陷型小鼠的典型肝脏切片的相同视野的两张荧光显微照片。巨噬细胞(大部分是库普弗细胞(Küpffer cell))用单克隆抗体F4/80在红色通道照亮(右图)。细胞残余物和濒死细胞(dying cell)在绿色通道用TUNEL反应染色(左图)。在该图像中的所有TUNEL+细胞也是F4/80+，但是大约50％的F4/80+细胞为TUNEL-(白色箭头)。比例尺为25μm。(b)10张肝脏切片中TUNEL+F4/80+细胞的绝对数目的定量，所述肝脏来自每种基因型的6只小鼠中的每只，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。(c)TUNEL+F4/80+细胞的数目，其表示为在(b)中所分析的相同切片中F4/80+细胞数目的百分比。(d)TUNEL+F4/80-细胞(其为细胞残余物或不是巨噬细胞的濒死细胞)的数目，其表示为所分析的细胞核总数的百分比。在(b)-(d)中，值为6只动物的平均值±SEM。
图4显示了小鼠肝脏中的巨噬细胞群体动态。(a)来自野生型和apoE缺陷型小鼠的典型肝脏切片的低倍荧光显微照片，用F4/80单克隆抗体进行染色。在该放大倍数下(比例尺为25μm)，巨噬细胞显示为白色斑点，其在高放大倍数下(插入的图片；比例尺为10μm)被确认为特异性细胞染色。(b)10张肝脏切片中F4/80+细胞数目的定量，所述肝脏来自每种基因型的6组小鼠中的每个，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。(c)在与(b)相同的切片中M1/70+细胞(表达高水平的整联蛋白CD11b，代表最近募集的巨噬细胞)数目的定量。描述了M1/70+细胞的绝对数目，其表示为所分析的细胞核总数的百分比，并且每个柱上方的数字代表M1/70+细胞的数目，该数目表示为相同切片中F4/80+细胞数目的分数。在(b)和(c)中，值表示6只小鼠的平均值±SEM。(d)野生型(左图)和apoE缺陷型(右图)小鼠中巨噬细胞群体动态的总结。每张图的面积与F4/80+细胞的总数成比例，并且其经再次分割以显示该巨噬细胞群体的比例，所述巨噬细胞群体为新募集的巨噬细胞(M1/70+TUNEL-；绿色)、成熟的巨噬细胞(M1/70-TUNEL-；灰色)或濒死的巨噬细胞(M1/70-TUNEL+；红色)。还显示了活的、成熟的巨噬细胞(M1/70-F4/80+TUNEL-细胞)的数目，其表示为细胞核总数的百分比。
图5显示了小鼠肺和脑中的巨噬细胞群体。(a)来自肺的10张切片中F4/80+细胞(大部分是肺泡巨噬细胞)的数目，所述肺来自每种基因型的6只小鼠，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。(b)在与(a)中相同的切片中TUNEL+F4/80+细胞的数目，其表示为F4/80+细胞数目的百分比。(c)来自脑的10张切片中II类MHC+细胞(主要是小胶质细胞)的数目，所述脑来自每种基因型的6只小鼠，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。(d)在与(c)中相同的切片中TUNEL+II类MHC+细胞的数目，其表示为II类MHC+细胞数目的百分比。在每种情况中，值为6只动物的平均值±SEM。
图6显示了小鼠肝脏中炎症的标记物。(a)来自野生型小鼠的典型的肝脏切片的荧光显微照片，就TNF-α进行染色。所述切片的大部分区域含有稍微能检测或不能检测的TNF-α，但是在小血管区域中的细胞的染色为强阳性。比例尺为25μm。(b)10张肝脏切片中的TNF-α染色，所述肝脏来自每种基因型的6只小鼠中的每只，通过如先前描述的定量免疫荧光方法来测量。(c)来自野生型小鼠的典型的肝脏切片的荧光显微照片，就纤维蛋白原进行染色。在肝脏内的每个功能单元的中央静脉中以及在窦状隙中可见高水平的染色。比例尺为25μm。(d)10张肝脏切片中的纤维蛋白原染色，所述肝脏来自每种基因型的6只小鼠中的每只，通过如先前描述的定量免疫荧光方法来测量。在每张图中，值为6只小鼠的平均值±SEM。
图7显示了改变的脂蛋白代谢对于巨噬细胞群体的影响。(a)汇集的血清的脂蛋白谱，所述血清来自在22周龄时处死的、喂饲高脂肪饮食(空心圆)或正常食物饮食(normal chow diet)(实心正方形)10周的6只野生型小鼠。显示了来自6只apoE缺陷型小鼠的汇集的血清的脂蛋白谱(简单的线条)用于比较。在该方案中，VLDL在级分10前洗脱，LDL在级分10和20之间洗脱，HDL在级分20后洗脱。(b)10张肝脏切片中F4/80+细胞的数目，所述肝脏来自每组中的6只小鼠中的每只，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。(c)来自6只LDL受体缺陷型小鼠的汇集的血清的脂蛋白谱，所述小鼠始终给予正常食物饮食。显示了来自6只apoE缺陷型小鼠的汇集的血浆的脂蛋白谱(简单的线条)用于比较。(d)10张肝脏切片(暗色柱)或肺切片(浅色柱)中F4/80+细胞的数目，所述肝脏或肺来自每种基因型的6只小鼠中的每只，结果表示为所分析的细胞核总数的百分比。在每张图中，值为6只小鼠的平均值±SEM。
图8显示了小鼠肝脏中巨噬细胞群体动态的模型。增加成熟巨噬细胞(F4/80+)的平衡群体的过程包括募集单核细胞前体穿过血管内皮，经由M1/70+F4/80+新募集的巨噬细胞的分化，和增殖。减少成熟巨噬细胞的平衡群体的过程包括穿过内皮而迁出进入淋巴或血液中，并通过凋亡或坏死(TUNEL+F4/80+细胞；带点的粉红色细胞)而死亡，随后经吞噬作用而被清除。我们证明，apoE缺陷削弱了凋亡细胞残余物的清除。
实验方法和材料体外吞噬作用测定鼠腹膜巨噬细胞用于所有的吞噬作用测定。通过用冰冷的无菌Hank’s溶液(Sigma)清洗鼠腹膜而从C57B1/6(野生型)或apoE-/-小鼠中无菌分离出巨噬细胞。将腹膜渗出物细胞存储于预先冷却的无菌玻璃管中并随后用RPMI培养基洗涤两次(于300g离心10分钟获得粒状沉淀)。最终，将所述细胞沉淀再悬浮于RPMI+10％FCS中并以5×105个细胞/ml涂布于塑料组织培养腔式载玻片(Nunc)上。让巨噬细胞在37℃下粘附2小时，然后用冷的Dulbecco’s PBS洗涤，随后在RPMI+10％FCS中孵育直至在分离后4-10天用于吞噬作用测定。将用于吞噬作用测定的所有细胞彻底洗涤并在无血清条件下孵育以消除由于在用于细胞维持的FCS中存在牛apoE而引起的任何可能的影响。
胶乳小珠吞噬测定改编自Ichinose[Ichinose，M.等人，1994Cell Immunol 156508]。简而言之，将2μm在蒸馏水中的荧光微球(羧基化的(carboxylate modified)，Molecular Probes)以4.5×109个小珠/ml用1％BSA包被，然后超声处理5分钟。将巨噬细胞单层用HEPES-缓冲的盐水(pH 7.5)洗涤，并用250μl相同的溶液预孵育30分钟。加入经BSA包被的胶乳小珠以得到2.5×106个小珠/孔，然后在37℃下将巨噬细胞孵育1小时，在此期间发生吞噬作用。然后通过用冰冷的Dulbecco’s PBS用力洗涤5次来去除未摄入的小珠。然后通过在37℃下加入0.25％的胰蛋白酶(来自猪胰腺的IIS型，Sigma)2小时来释放巨噬细胞，并通过加入戊二醛(0.5％终浓度)来固定。使用每管分析10,000个细胞的FACStar(BectonDickinson)通过流式细胞术来测量摄入的颗粒的数目，并用FCSPress软件计算每个巨噬细胞摄入的平均颗粒数(吞噬指数)。
凋亡胸腺细胞的吞噬测定法改编自先前描述的方法[Scott，R.S.等人，2001.Nature 411207]。通过将胸腺移入用20mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲的RPMI+10％FCS中并将其通过具有40筛目的细胞解离筛(Sigma)而从C57B1/6或ApoE-/-小鼠中制备胸腺细胞。将得到的细胞悬浮液离心而得到粒状沉淀(500g×5分钟)，并以107个细胞/ml再悬浮于RPMI+10％FCS中。在将细胞用于吞噬作用测定的前一天(将它们进行培养之后3-9天)，将胸腺细胞用无菌Dulbecco’s PBS洗涤三次并重构至5×106个细胞/ml，然后用CellTracker Green(Molecular Probes，2μM终浓度)在37℃下标记30分钟。然后将经标记的细胞在PBS中洗涤，并在37℃下于新鲜的无血清RPMI培养基中孵育30分钟，在PBS中再次洗涤，随后在无血清RPMI中孵育过夜。通过膜联蛋白V染色和流式细胞术测量，除去血清得到多于70％的调亡胸腺细胞。如对于胶乳小珠一样进行吞噬作用测定，不同的是每孔加入2×106个凋亡胸腺细胞。对摄入的胸腺细胞进行计数，方法是用70％乙醇中的1％乙酸将巨噬细胞固定在载玻片上90分钟，并在连接有图像分析系统的荧光显微镜(Provis AX；Olympus)下观察。在每孔18个视野的每一个中计数摄入的胸腺细胞的数目和巨噬细胞的总数，并计算出平均吞噬指数。
组织制备成年雄性小鼠(C57/B16、ApoE-/-或LDLR-/-小鼠[Ishibashi，S.等人，1994.J Clin Invest 931885]；每组6只动物)通过CO2窒息而被处死，并通过心脏穿刺来采血以制备血清。迅速切下组织(肝的左叶、左肺和大脑左半球)并置于冰冷的盐水中，然后包埋于OCT包埋介质中并在-80℃下冷冻。对于接受膳食脂质攻击的动物，在处死前用高脂质含量的食物(1.25％胆固醇，7.5％饱和脂肪)代替正常食物10周。所有的其他动物始终随意接受正常食物饮食和水。
然后，从每种组织制备冷冻切片(4μm)并收集至经聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，并在冰冷的丙酮中固定90分钟，风干并在-20℃下冷冻直至分析。横切片取自大约位于前后向(anterioposterior)轴上的组织中部的点，在4mm的距离上。对于每种抗原(或在双色或三色免疫荧光实验中为抗原组)，使用在4mm距离上均匀间隔的16个切片(每个250μm)，其中10个切片接受一抗，而6个切片(从16个切片中随机选出)作为不接受一抗的对照，如Mosedale及其同事所推荐的[Mosedale，D.E.等人，1996.J Histochem Cytochem441043]。
免疫荧光染色所有的免疫荧光染色是在对于定量免疫荧光的优化条件下如Mosedale等人描述的来进行[Mosedale等人，见上]。简而言之，将切片在含有3％无脂肪酸的BSA的PBS中再水化30分钟，然后暴露于在PBS/3％BSA中的一抗18小时。在PBS中进行3×3分钟洗涤后，将载波片暴露于在PBS/3％BSA中的25μg/ml合适的经荧光标记的二抗6小时，除了当使用了直接标记的一抗时。在PBS中进一步洗涤3次后，将载波片在水中漂洗，风干，并置于Citifluor AF-1下，然后于-20℃下保存直至用图像分析系统进行分析。使用了下列可商购获得的一抗抗-巨噬细胞F4/80抗原(MCAP497；Serotec；25μg/ml)；抗-CD11b(M1/70(MCA74G)；Serotec；25μg/ml)；抗-II类MHC(I-Ab)(MCA1500F；Serotec；20μg/ml)；抗-纤维蛋白(原)(4440-8004；Biogenesis；20μg/ml)；抗-鼠TNF-α(AB-410-NA；R&D Systems；50μg/ml)；抗-PCNA(M0879；Dako；12μg/ml)。所有二抗是最小交叉反应性驴抗体(Jackson Immunoresearch)。所有抗体溶液还含有Hoechst 33342(1μg/ml终浓度)以复染细胞核，其在蓝通道上可见。
凋亡细胞和坏死细胞的检测濒死细胞用TUNEL反应来检测，如先前描述的[Gavrieli，Y.等人，1992.J Cell Biol 119493]，根据生产商的说明书使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)。将用牛DNA酶I(Roche；10μg/ml终浓度，在50mM Tris pH 7.5、1mM MgCl2中)预处理的切片用作阳性对照；将用荧光素标记的dUTP的缺漏(omission)用作阴性对照。在小鼠肝脏中，大约70％的TUNEL+细胞对于活性胱天蛋白酶-3也呈阳性染色(使用CM-1抗体)，并且当就Hoechst 33342荧光进行观察时显示出细胞核浓缩的迹象，这暗示着，根据Stadelmann & Lassmann的定义[Stadelmann，C.和H.Lassmann.2000.Cell Tissue Res 30119]，使用这种试剂盒检测为TUNEL+的大部分细胞正在经历凋亡，而不是坏死，正如生产商所声称的。
脂蛋白谱分析使汇集的血清样品接受凝胶过滤层析，使用Sepharose 6B柱，并完全按照先前所描述的[Grainger，D.J.等人，1995.Nat Med11067]。采用胆固醇氧化酶方法来检测在得到的级分中的胆固醇，并基于载脂蛋白洗脱谱将其归类至各种脂蛋白类型，所述的载脂蛋白洗脱谱是通过如先前所述[Yokode，M.等人，(1990)Science 2501273]经凝胶电泳和蛋白质印迹法进行分析而得到的。
结果apoE缺乏对于在体外巨噬细胞摄取凋亡细胞的影响腹膜巨噬细胞从apoE缺陷型小鼠(E-/-)和野生型(WT)小鼠制备，来自野生型(WT)小鼠的腹膜巨噬细胞用作对照。培养96小时后，将E-/-和WT细胞各自与经荧光标记的凋亡WT胸腺细胞接触，让它们在37℃下摄入所述胸腺细胞超过1小时。每个巨噬细胞摄入的胸腺细胞的数目通过免疫荧光显微术来定量(图2A)，作为巨噬细胞清除凋亡小体的能力的量度。在这段时期，每个WT巨噬细胞摄入1.65±0.12个凋亡的WT胸腺细胞，但是如果使用活的胸腺细胞则没有观察到摄入(数据没有显示)，这证实这种测定法对于凋亡小体的摄取是特异性的。与之相反，在相同时间段，E-/-巨噬细胞摄入少25％的凋亡胸腺细胞(p＜0.05，非配对Student’s t-检验；图2B)。
使用针对鼠apoE的FITC-标记的抗体的流式细胞术证明，胸腺细胞表达apoE，尽管是以比巨噬细胞低的水平。因而，我们用E-/-胸腺细胞重复了该实验。有趣地是，WT巨噬细胞没有与它们摄入WT胸腺细胞一样有效地摄入E-/-胸腺细胞(p＜0.05，Student’s t-检验；图2C)，并且当摄入性巨噬细胞和凋亡的胸腺细胞都是apoE缺陷型时观察到对凋亡小体摄取的更大损害，与在野生型系统中相比，被摄入的凋亡细胞少了大约60％。总之，这些结果证明，尽管在完全不存在apoE时可以发生凋亡体的摄入，但该过程明显受到削弱。
因为巨噬细胞或胸腺细胞配对物上apoE缺乏将对于凋亡小体的摄入降低至相似的程度，所以我们测试了外源性加入可溶性apoE是否能够恢复正常的功能。加入1μM(与人血浆类似的浓度)的人apoE3逆转了由内源性apoE缺乏而引起的胸腺细胞摄入的减弱(相对于没有加入apoE，p＜0.05；相对于野生型细胞，p＝0.98，非配对Student’s t-检验；图2C)。我们得出结论apoE是凋亡小体摄取的重要调节物，但是其不可能于在摄取期间参与直接细胞相互作用的受体配体对中发挥功能，而是具有更复杂的调控作用，所述调控作用可能涉及细胞表面的信号传导。
接着，我们检测了apoE是否为巨噬细胞吞噬作用的广谱调节物或者其是否对于凋亡细胞的摄取具有特异性。E-/-巨噬细胞对经荧光标记的胶乳小珠的摄取(用流式细胞术测量(图2D))不能与WT巨噬细胞对所述胶乳小珠的摄取相区分(p＝0.86，非配对Student’s t-检验；图2E)，这证明，对于凋亡小体的摄取来说，apoE对吞噬作用的影响是特异性的。
apoE缺乏对于在体内凋亡小体的清除的影响分析了在apoE缺陷型小鼠和野生型同窝出生的对照小鼠体内存在的凋亡小体的数目。从4mm的肝脏左叶上以250μm的间距制备冷冻切片，并使用TUNEL反应(其标记DNA断裂)检测濒死细胞和细胞残余物。对于一般的巨噬细胞标记物F4/80的共染色揭示野生型和apoE缺陷型肝脏中大部分(＞98％)的TUNEL阳性细胞是F4/80+(大部分TUNEL阳性细胞是巨噬细胞)。但是，重要的是要注意到，TUNEL标记法不仅使凋亡细胞染色，并且可能使坏死细胞或甚至健康细胞染色，这取决于组织制备的方法。然而，在我们的切片中，当观察Hoechst荧光时(即染色质浓缩以及细胞核空泡化是明显的)，许多TUNEL+细胞具有凋亡细胞的特征。此外，60-70％的TUNEL+细胞在活性胱天蛋白酶-3方面也是着色的。总而言之，这些观察结果表明TUNEL染色是肝脏中巨噬细胞死亡的有用指数，这与Stadelmann和Lassmann[见上]的发现一致。
与野生型同窝出生的对照相比较，在apoE缺陷型小鼠中，肝脏中濒死巨噬细胞(F4/80+TUNEL+)的数目显著增加(图3A-C)。凋亡巨噬细胞的绝对数目(p＜0.01，非配对Student’s t-检验；图3B)和TUNEL+的巨噬细胞群的比例(p＜0.05，非配对Student’s t-检验；图3C)都得到增加。在野生型动物中大约10％的F4/80+细胞也是TUNEL+的，而在apoE缺陷型动物中多于50％的是TUNEL+的。我们还检验了apoE缺乏对凋亡的肝细胞(F4/80-TUNEL+细胞)数目的影响。然而，在非巨噬细胞的细胞区室(compartment)中细胞死亡的比率比在巨噬细胞的区室中低很多(所有TUNEL+细胞中＜2％的细胞是F/480-的)，所以我们的实验不足以检测apoE缺乏对该群体的影响(图3D)。
观察到的在apoE缺陷型小鼠肝脏中凋亡巨噬细胞的增加可能是由于巨噬细胞死亡速率的增加或凋亡小体清除速率的降低而引起的。为了区分这两种可能性，我们更全面地分析了巨噬细胞群体以提供小鼠肝脏中巨噬细胞群体动态的图景。首先，我们估计了肝脏巨噬细胞群体的大小，所述评估是通过将F4/80+细胞总数表示为肝脏中细胞核总数的百分比(图4A，B)。尽管apoE缺陷型小鼠中TUNEL+巨噬细胞的数目和比例显著增加，但在apoE缺陷型动物中总的肝脏巨噬细胞群体显著更大(p＜0.05；非配对Student’s t-检验；图3B)。对于这种明显的矛盾至少有两种简单的解释在apoE缺陷型小鼠中凋亡小体的清除效率明显更低，这与我们的体外观察结果一致，或者是在apoE不存在时巨噬细胞募集得以增加至比巨噬细胞死亡的任何增加更大的程度。
为了研究这第二种可能性，我们利用了这样的观察结果，即在单核细胞上高度表达的整联蛋白CD11b(通过单克隆抗体M1/70检测)在募集至组织巨噬细胞群体中后被下调。因此，肝脏中M1/70+F/480+细胞的数目可用作巨噬细胞募集的替代指数。在肝脏中，ApoE缺乏以多于2倍的量增加了M1/70+F4/80+巨噬细胞的绝对数目(p＜0.05，非配对Student’s t-检验；图4C)，但是这仅代表新募集的巨噬细胞的比例的小量增加(在apoE缺陷型小鼠中为10.0％，与之比较的是在C57/B16小鼠中为8.3％)。因而，巨噬细胞募集速率的增加基本上小于所看到的死亡或濒死巨噬细胞数目的大量增加。因为巨噬细胞群体的增殖是十分罕见的事件(在所分析的肝脏切片中没有看到PCNA+F480+细胞)，所以我们得出结论巨噬细胞募集的增加不可能导致所看到的在apoE缺陷型小鼠中巨噬细胞群体的增加。
在来自野生型和apoE缺陷型小鼠的肝脏中巨噬细胞群体动态的概括显示于图4D中。ApoE缺乏显著地扰动了巨噬细胞群体的稳态，导致巨噬细胞募集的小量但是在统计上显著的增加，导致活的巨噬细胞数目的更大增加，但是最显著的效果是凋亡小体数目的明显增加。基于这样的分析，我们得出结论在体内以及体外，在apoE缺陷型小鼠的肝脏中凋亡小体的清除降低。
其他组织中的巨噬细胞群体动态冷冻切片从相同小鼠的大脑(左半球)和左肺制备，从所述小鼠中已经获取了肝脏样品。像在肝脏中一样，apoE缺乏增加了肺泡巨噬细胞群体的大小(图5A)，造成这种增加的主要因素是死亡和濒死细胞的积聚(图5B)。肺中所见的影响大小与肝脏中所见的十分相似。
使用相同的抗体标记物来表征脑组织巨噬细胞群体(小胶质细胞)是不可能的，因为它们用F4/80单克隆抗体仅微弱着色。然而，针对II类MHC的抗体(其仅使肝脏和肺中的一亚类F4/80+细胞着色)使小胶质细胞着色。ApoE缺乏增加了脑中II类MHC+细胞的数目(图5C)，尽管比关于肺和肝脏中F4/80+群体所看到的具有更小的程度。然而，与我们在其他组织中的观察结果一致，为TUNEL+的II类MHC细胞的绝对数目和比例都显著地增加(图5D)。使用针对CD14的抗体来检测小胶质细胞群体获得了相似的结果，尽管CD14可以选择性地检测新募集的巨噬细胞或激活的小胶质细胞。
总而言之，这些观察结果表明，在体外观察到当apoE不存在时凋亡小体摄取减弱，这在apoE缺陷型小鼠中导致了未清除的凋亡小体的全身性积聚至平衡，并且表明在将巨噬细胞募集至一系列组织中的方面有小的但在统计上显著的增加，这有可能是对在清除凋亡细胞方面的缺陷的应答。
apoE缺乏对于肝脏中炎症标记物的影响将定量免疫荧光用于测量肝脏中两种炎症标记物的相对水平，所述肝脏来自apoE缺陷型小鼠和它们的同窝出生的野生型小鼠。细胞因子TNF-α在急性炎症过程中被上调，但是其通常仅以十分低的水平存在于健康肝脏中，主要存在于血管周围区域中(图6A)。与同窝出生的野生型小鼠相比较，在apoE缺陷型小鼠中对TNF-α的染色要高1.5倍(p＜0.05；Mann-Whitney U-检验；图6B)。尽管这种细胞因子的水平在这两组中都低，但apoE缺乏导致TNF-α水平在统计上(以及可能在生物学上)显著的变化。
apoE缺乏也增加了肝细胞产物纤维蛋白原的染色(图6C)(p＜0.05；非配对Student’s t-检验；图6D)。尽管主要参与血液凝固，但已知纤维蛋白原为阳性急性期反应物(即其水平在急性炎症应答期间增加的基因产物)。与它们的对照相比较，在apoE缺陷型小鼠中，这两种不相关的全身性炎症标记物(TNF-α和纤维蛋白原)被升高。
血浆胆固醇浓度对于巨噬细胞群体动态的影响在体内，apoE缺陷导致对脂蛋白代谢十分显著的错误调控。为了测定脂蛋白代谢的改变是否可能间接地影响巨噬细胞群体动态，我们使用了两种不依赖于apoE缺失的策略来改变脂蛋白代谢。首先，我们检验了给野生型小鼠喂饲高胆固醇饮食10周的影响，其导致血浆LDL-和VLDL-胆固醇浓度的增加，和HDL-胆固醇的减少，这样使得喂饲脂肪的C57/B16小鼠的脂蛋白谱更接近地类似于apoE缺陷型小鼠，如先前观察到的。在这一时期结束时，肝脏巨噬细胞群体没有不同(p＝0.94；非配对Student’s t-检验，相对于喂饲正常食物饮食的野生型小鼠；图7B)。类似地，LDL受体的遗传缺失仅对肝脏中的巨噬细胞群体有有限的影响(marginal effect)(p＝0.07；非配对Student’st-检验；图7D)，并且对脑和肺中的群体没有影响(p＝0.88，Student’st-检验；图7D)，尽管以与在apoE缺乏后所看到的程度相当的程度引起了脂蛋白代谢的缺陷(图7C)，如先前观察到的。我们得出结论，脂蛋白代谢的全身性改变不可能引起在apoE缺陷型小鼠中所观察到的巨噬细胞群体动态的变化，并且进一步地，apoELDL受体相互作用不可能介导我们所观察到的凋亡小体清除的减弱。
在此显示出，巨噬细胞中apoE蛋白的完全缺乏特异性地削弱了在体外凋亡细胞的摄入，而不影响一般的吞噬作用功能。这种缺陷导致，在体内，在apoE缺陷型小鼠的一系列组织中，凋亡细胞及片段积聚的明显增加，并且还导致在这些组织中更大的活巨噬细胞群体。接下来，这又与促炎症标记物(包括TNF-α和纤维蛋白原)的全身性增加相关联。尽管先前已经报道，apoE的遗传缺失促进将巨噬细胞募集至血管壁[例如，Lessner，S.等人，2002.Am J Pathol 1602145；和Reckless，J.，J.C.等人，1997.Circulation 951542]，但这被认为是对局部脂质沉积的间接响应，而不是apoE缺乏的直接结果。在此显示，脂质代谢的改变不是这些效应的原因，并且目前的数据为apoE对于不依赖于脂蛋白代谢的组织巨噬细胞募集(图8)的全身性影响提供了第一手的直接证据，所述的组织巨噬细胞募集是由于对凋亡细胞残余物的摄取被削弱而引起的。
这些结果给出了关于中枢生理机制(central physiologicalmechanism)的直接证据，所述机制支持apoE基因型与一系列具有富含巨噬细胞的炎性组分的疾病之间的关联。ApoE是有效清除凋亡小体所需要的，并且不同的apoE基因型与凋亡小体清除速率的稍微不同相关联。随着时间过去，在体内，甚至凋亡小体清除的这种小的降低也导致通过单核细胞/巨噬细胞途径的流量的增加，并在表型方面造成全身性促炎变动(shift)。这种变动的一个后果是出现了导致功能性组织结构丧失的纤维化趋势，所述组织结构丧失是阿尔茨海默病和动脉粥样硬化的标志。
权利要求
1.鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于在个体中治疗与内源性apoE活性降低相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。
2.根据权利要求1所述的方法，其中相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加表明，所述化合物可用于治疗与内源性apoE活性降低相关的病状。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述疾病状况选自阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在ApoE不存在时测定摄入。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在ApoE存在时测定摄入。
6.鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于治疗或预防与炎性活性增加相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时ApoE多肽刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力。
7.鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于治疗或预防与炎性活性增加相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时ApoE缺陷型巨噬细胞对一种或多种凋亡的ApoE缺陷型细胞的摄入。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加表明，所述化合物可用于治疗与炎性活性增加相关的病状。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中与炎性活性增加相关的病状是多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠应激综合征、克罗恩病、中风、心肌梗死、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、牛皮癣或接触性过敏性皮炎。
10.鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时ApoE多肽刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力。
11.鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于治疗或预防与凋亡细胞积聚相关的病状，所述方法包括在测试化合物存在时将ApoE缺陷型巨噬细胞与一种或多种凋亡的ApoE缺陷型细胞接触；和测定巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加表明，所述化合物可用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述病状是组织创伤、创伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征、细菌性脓毒症、胰腺炎或心包炎。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物是人apoE的肽片段或其类似物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括将测试化合物鉴定为刺激凋亡细胞吞噬的试剂。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法包括分离所述测试化合物。
17.根据权利要求15所述的方法，所述方法包括合成和/或制备所述测试化合物。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，所述方法包括修饰所述化合物以优化其药学性质。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，所述方法包括将所述化合物与可药用赋形剂一起配制成组合物。
20.生产药物组合物的方法，所述药物组合物用于治疗与内源性apoE活性降低、炎性活性增加或凋亡细胞积聚相关的病状，所述方法包括使用根据权利要求1-18中任一项所述的方法来鉴定和/或获得刺激凋亡细胞吞噬的化合物，和将由此鉴定的化合物与可药用载体混合。
21.用于在个体中治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的方法，所述方法可以包括增加所述个体中ApoE的表达和/或活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中通过将ApoE多肽或其模拟物施用给所述个体来增加ApoE活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述ApoE多肽是人ApoE的肽片段。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述与凋亡细胞积聚相关的病状选自组织创伤、创伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征、细菌性脓毒症、胰腺炎或心包炎。
25.ApoE多肽或其模拟物在制备用于治疗与凋亡细胞积聚相关的病状的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述ApoE多肽是人ApoE的肽片段。
27.用于在个体中治疗与内源性apoE减少相关的病状的方法，所述方法包括施用刺激凋亡细胞的吞噬的化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述化合物是人ApoE的肽片段或其类似物或衍生物。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述疾病状况选自阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。
30.刺激凋亡细胞的吞噬的化合物在制备用于治疗与内源性apoE减少相关的病状的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述化合物是人ApoE的肽片段或其类似物或衍生物。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的用途，其中所述疾病状况选自阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。
33.用于在个体中治疗与炎性活性增加相关的病状的方法，所述方法包括施用刺激凋亡细胞的吞噬的化合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述化合物是人ApoE的肽片段或其类似物或衍生物。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中与炎性活性增加相关的病状是多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠应激综合征、克罗恩病、中风、心肌梗死、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、牛皮癣或接触性过敏性皮炎。
36.刺激凋亡细胞的吞噬的化合物在制备用于治疗与炎性活性增加相关的病状的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述化合物是人ApoE的肽片段。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的用途，其中与炎性活性增加相关的病状是多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠应激综合征、克罗恩病、中风、心肌梗死、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、牛皮癣或接触性过敏性皮炎。
39.鉴定调节吞噬效率的化合物的方法，所述方法包括(a)将培养的巨噬细胞暴露于源自apoE的肽、模拟物或其他测试化合物；(b)使所述巨噬细胞与凋亡细胞的悬浮液接触；和(c)测定被巨噬细胞摄入的凋亡细胞的数目。
全文摘要
本发明涉及用于刺激吞噬作用(特别是凋亡细胞的吞噬)的方法和手段，并且公开了apoE基因的蛋白质产物(载脂蛋白E)作为凋亡细胞清除的调控物的作用。ApoE模拟物及刺激凋亡细胞清除的其他化合物可用于治疗一系列病状。本发明的一个方面提供了鉴定和/或获得用于在个体中治疗与内源性apoE活性降低相关的疾病的化合物的方法，所述方法包括测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与内源性apoE活性降低相关的病状。
文档编号G01N33/68GK101048664SQ200580036525
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月25日 优先权日2004年10月25日
发明者D·格兰杰 申请人:剑桥企业有限公司