专利名称：万古霉素单位的hplc分析方法
技术领域：
本发明涉及一种万古霉素单位的HPLC分析方法。
背景技术：
万古霉素属于糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌有较强的抗菌作用，尤其是对MRSA有较好的疗效，故万古霉素的生产与研发日益受到重视。最早研究万古霉素是国外的Micormick等从一株东方链霉菌的发酵液中分离得到；国内的研究主要有东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis SIPI-43491)(申请号CN01132048.6)及其突变株东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183(申请号CN200410067197.7)，它们的发酵液中都可以分离出万古霉素。很显然，万古霉素发酵液单位的检测在万古霉素的生产与研发中也日益突出，目前最常用的发酵液单位的检测是高效液相色谱法(HPLC)。相对于生物检测或其他方法，高效液相色谱仪(HPLC)法具有快速、准确的优点，所以其应用也日益广泛。
现有技术中，万古霉素单位的HPLC分析技术(陈代杰等.万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页)是流动相0.4％的三乙胺，用磷酸调pH至3.3，然后与甲醇以85∶15的比例等度洗脱。此方法缺点在于如果一批分析多个样品时，会因前一样品的弱极性物质未被洗出而干扰后一样品，影响分析准确性。
发明内容
本发明的目的旨在提高样品中万古霉素单位的分析准确性，提供一种万古霉素单位的HPLC分析方法。
在本发明的方法中固定相为C4、C8或C18的反相柱，流动相为pH3～6的缓冲液与极性有机溶剂的混合液，其特征在于流动相是以梯度洗脱的方式洗脱万古霉素样品，流动相中极性有机溶剂的起始浓度为5～50％，最终浓度为50～100％。
在该梯度洗脱的方式中，极性有机溶剂的浓度是连续性递增或者间歇式递增，较佳地是连续性递增。
在本发明的一较佳实施例中，流动相中极性有机溶剂的起始浓度为10～25％，最终浓度为75～95％。
所述的缓冲液可以是三乙胺、醋酸铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾缓冲液。
所述的极性有机溶剂为乙腈、甲醇、或者甲醇与乙腈的任何比例混合得到的混合溶剂。
所述的万古霉素样品可以是万古霉素发酵液粗品、经过前处理的万古霉素发酵液、或者万古霉素发酵液提取过程中间样品，或者其它万古霉素样品。
本发明的积极进步效果在于将现有技术中可用于万古霉素样品的HPLC等度洗脱的流动相缓冲液与极性有机溶剂以梯度洗脱方式分析样品，改用梯度洗脱后，多个样品间相互干扰大为减少，目的峰理论塔板数明显提高，分析样品万古霉素准确性提高。
具体实施例方式
实施例1用反相HPLC方法分析万古霉素提取中间样品(同现有技术“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，P10页”)该样品为该文献第10页中D1300树脂的解析液)。固定相C18硅胶柱；流动相缓冲液为0.1％NH4AC，调pH至6，极性有机溶剂为甲醇，将两者混合。紫外检测波长为280nm，梯度洗脱起始流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝85∶15，极性有机溶剂的浓度连续性递增，洗脱40分钟后，流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝50∶50。同时进行等度洗脱试验(缓冲液∶有机溶剂的体积比＝80∶20)，其他条件不变。洗脱完毕，梯度洗脱法的目的峰理论塔板数8165；等度洗脱法的目的峰理论塔板数为3385，由此可见梯度洗脱效果明显优于等度洗脱。
实施例2用反相HPLC方法分析万古霉素提取中间样品(同现有技术“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，P10页”)该样品为该文献第10页中D1300树脂的解析液)。固定相C8硅胶柱；流动相缓冲液为0.2％KH2PO4，调pH至3，极性有机溶剂为乙睛，将两者混合。紫外检测波长为280nm，梯度洗脱起始流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝95∶5，极性有机溶剂的浓度连续性递增，洗脱40分钟后，流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝40∶60。同时进行等度洗脱试验(缓冲液∶有机溶剂的体积比＝85∶15)，其他条件不变。洗脱完毕，梯度洗脱法的目的峰理论塔板数9563，等度洗脱法的目的峰理论塔板数为4722，梯度洗脱效果明显优于等度洗脱。
实施例3取一定量万古霉素发酵液(同现有技术“陈代杰等，万古霉素的研究开发，中国抗生素杂志，2004年1月，第29卷，第1期，p8页”)，用HAC调pH至4.0，于4000r/min离心15min，去除菌丝体与固体杂质；吸取一定量的上清液，按体积比1∶1加入甲醇，混合均匀，在12000r/min条件下离心10min；然后再用0.45μm偏氟膜过滤，得到经过经过前处理的万古霉素发酵液。
用反相HPLC方法分析经过前处理的万古霉素发酵液。固定相C18硅胶柱；流动相缓冲液为0.4％NaH2PO4，调pH至4.5，极性有机溶剂为甲醇和乙睛(体积比1∶1)，将两者混合。紫外检测波长为280nm，梯度洗脱起始流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝75∶25，极性有机溶剂的浓度连续性递增，洗脱40分钟后，流动相中缓冲液∶有机溶剂的体积比＝60∶40。同时进行等度洗脱试验(缓冲液∶有机溶剂的体积比＝80∶20)，其他条件不变。洗脱完毕，梯度洗脱法的目的峰理论塔板数5909，而等度洗脱法的目的峰理论塔板数为3861，梯度洗脱效果明显优于等度洗脱。
权利要求
1.一种万古霉素单位的HPLC分析方法，在该方法中固定相为C4、C8或C18的反相柱，流动相为pH3～6的缓冲液与极性有机溶剂的混合液，其特征在于流动相是以梯度洗脱的方式洗脱万古霉素样品，流动相中极性有机溶剂的起始浓度为5～50％，最终浓度为50～100％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在该梯度洗脱的方式中，极性有机溶剂的浓度是连续性递增或者间歇式递增。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于流动相中极性有机溶剂的起始浓度为10～25％，最终浓度为75～95％。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的缓冲液是三乙胺、醋酸铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾缓冲液。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的极性有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的万古霉素样品是指经过前处理的万古霉素发酵液样品或者万古霉素发酵液提取过程中间样品。
全文摘要
本发明公开了一种万古霉素单位的HPLC分析方法，在该方法中固定相为C
文档编号G01N30/00GK1862257SQ200610025449
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月4日 优先权日2006年4月4日
发明者刘垚, 李继安, 戈梅, 陈代杰 申请人:上海医药工业研究院