专利名称：不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种引物和大黄鱼，尤其是涉及不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法。
背景技术：
大黄鱼(Pseudosciaena crocea(Richardson))又名黄鱼、黄瓜、黄花鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)，石首鱼科(Scieanidae)，黄鱼属(Pseudosciaena)，曾是我国著名的“四大海洋经济鱼类”之一，其产量仅次于带鱼和中上层鱼类。在我国黄海的山东半岛以南至南海的雷州半岛以东均有分布。我国科学工作者在20世纪50～60年代对大黄鱼的地理种群(地方族)的划分有过详细的研究，依据鳃耙数、鳔侧枝数和尾柄高等形态量度特征以及寿命、年龄组成和性成熟年龄等种群结构特征，并结合地理分布区的特点，比较分析了7个生殖鱼群和3个非生殖盛期鱼群的资料，提出我国沿海大黄鱼可大致分为岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群。岱衢族，包括江苏岱衢洋、吕泗洋、猫头洋和洞头洋等4个大黄鱼鱼群，分布在黄海南部到东海中部；闽粤东族，包括福建官井洋、厦门外海、广东南澳和汕尾等4个鱼群，主要分布在东海南部和南海北部(珠江口)；硇洲族，主要为广东硇洲近海的大黄鱼鱼群，它的主要分布区为珠江口以西到琼州海峡以东。20世纪60年代以来，由于人工捕捞强度过大以及适合大黄鱼产卵和索饵的生殖生长环境遭到严重破坏，曾经是四大渔汛之一的大黄鱼已面临灭绝的境地。1985年以来，经过几年养殖实践，大黄鱼人工育苗工作获得突破性进展，随后大面积的养殖得到蓬勃发展。目前大黄鱼的3个野生种群在各海区还有零星分布，但由于数量少和市场价格高，其市场价格是养殖群体价格的20～30倍，常有不法商贩用养殖的个体充当野生个体从中牟取暴利。
目前常用于鉴别大黄鱼野生群体与养殖群体的主要方法有以下几种(1)普通百姓通常依据大黄鱼的体色是否亮黄或者价格；(2)有经验的渔民通过看鱼鳞和鳃耙的形状及数量；(3)根据专利ZL2004 1 0060149.5所提供的方法，通过特定引物对线粒体CytB基因进行PCR扩增并测序，依据序列上57、66、223、291碱基的变异。以上几种方法都只能辨别野生群体与养殖群体，无法区别野生群体中的岱衢族、闽粤东族、硇洲族3个地理种群且其中的判断标准具有较多主观因素，不利于客观准确地判断大黄鱼的来源。本发明利用一条引物对大黄鱼的DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以辨别3个地理种群以及1个养殖群体，具有准确快捷、公正客观、经济实用的特点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有检测大黄鱼种群方法中的不足，提供一种能够同时鉴别岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群以及养殖群体等4个种群大黄鱼的鉴别引物。
本发明的另一目的在于利用上述鉴别引物进行不同种群大黄鱼鉴别的方法。
本发明所述的能够同时鉴别岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群以及养殖群体的引物序列5’TGCCGCACTT-3’。
本发明所述的不同种群大黄鱼的鉴别方法其步骤如下1)采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA；2)PCR扩增反应PCR扩增反应体系的总体积为25uL，其各种成分及终浓度分别为Buffer10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，引物0.2mM，Taq 1U，大黄鱼DNA 50ng，用双蒸水补齐到25uL；单引物序列为5’TGCCGCACTT-3’，PCR反应程序是95℃ 5min→(94℃ 40sec→42.5℃ 40sec→72℃ 60sec)×35cycles→72℃ 5min→4℃∞；3)电泳染色对比图谱PCR反应结束后，取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，并用紫外透射反射分析仪观察、照相、记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，若图谱中出现一条1875bp的条带，则该DNA样品来自大黄鱼养殖群体；若在1000～1500bp区间内仅有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自岱衢族野生大黄鱼；若在1000～1500bp区间内仅有1条1085bp的条带，则该DNA样品来自闽粤东族野生大黄鱼；若在1000～1500bp区间内即有1条1085bp的条带又有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自硇洲族野生大黄鱼。
所述的PCR反应程序是在经典的反应程序的基础上作部分修改。这一反应程序与该引物的配合使用能够获得较佳的实验结果。
在电泳染色对比图谱时，PCR反应结束后，取产物10uL，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭(EB，5mg/L)染色。
与现有的检测大黄鱼种群方法相比，本发明由于利用能够同时鉴别岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群以及养殖群体的引物序列5’TGCCGCACTT-3’，因此可以快捷地鉴别养殖大黄鱼与野生大黄鱼的不同地理种群。
图1为电泳染色对比图谱。在图1中，M是DNA marker(DiamondTM250bp DNA Marker)，1是岱衢族大黄鱼，2是闽粤东族大黄鱼，3是硇洲族大黄鱼，4是养殖大黄鱼。
具体实施例方式
实施例1选用硇洲族大黄鱼以及养殖大黄鱼，按常规方法采用酚氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取大黄鱼DNA，设计合成引物5’TGCCGCACTT-3’，对其基因组进行扩增，扩增程序为95℃ 5min→(94℃ 40sec→42.5℃ 40sec→72℃ 60sec)×35cycles→72℃ 5min→4℃∞；扩增结果经电泳、染色并与图谱对比，图谱中出现一条1875bp的条带，则该DNA样品来自大黄鱼养殖群体；若在1000-1500bp区间内即有1条1085bp的条带又有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自硇洲族野生大黄鱼。PCR扩增反应体系的总体积为25uL，其各种成分及终浓度分别为Buffer 10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，引物0.2mM，Taq 1U，大黄鱼DNA 50ng，用双蒸水补齐到25uL。
在电泳染色对比图谱时，PCR反应结束后，取产物10uL，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭(EB，5mg/L)染色，并用紫外透射反射分析仪观察、照相、记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比。
实施例2与实施例1相似，其不同在于选用岱衢族与闽粤东族大黄鱼，对比图谱时若在1000～1500bp区间内仅有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自岱衢族野生大黄鱼；若在1000～1500bp区间内仅有1条1085bp的条带，则该DNA样品来自闽粤东族野生大黄鱼。
权利要求
1.不同种群大黄鱼的鉴别引物，其特征在于能够同时鉴别岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群以及养殖群体的引物为5’TGCCGCACTT-3’。
2.如权利要求1所述的不同种群大黄鱼的鉴别方法，其特征在于其步骤如下1)采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA；2)PCR扩增反应PCR扩增反应体系的总体积为25uL，其各种成分及终浓度分别为Buffer10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，引物0.2mM，Taq 1U，大黄鱼DNA 50ng，用双蒸水补齐到25uL；单引物序列为5’TGCCGCACTT-3’，PCR反应程序是95℃ 5min→(94℃ 40sec→42.5℃ 40sec→72℃ 60sec)×35cycles→72℃ 5min→4℃∞；3)电泳染色对比图谱PCR反应结束后，取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，并用紫外透射反射分析仪观察、照相、记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，若图谱中出现一条1875bp的条带，则该DNA样品来自大黄鱼养殖群体；若在1000～1500bp区间内仅有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自岱衢族野生大黄鱼；若在1000～1500bp区间内仅有1条1085bp的条带，则该DNA样品来自闽粤东族野生大黄鱼；若在1000～1500bp区间内即有1条1085bp的条带又有1条1250bp的条带，则该DNA样品来自硇洲族野生大黄鱼。
3.如权利要求2所述的不同种群大黄鱼的鉴别方法，其特征在于在电泳染色对比图谱时，PCR反应结束后，取产物10uL，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色。
4.如权利要求3所述的不同种群大黄鱼的鉴别方法，其特征在于溴化乙锭的浓度为5mg/L。
全文摘要
不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法，涉及一种引物和大黄鱼。提供一种能够同时鉴别岱衢族、闽粤东族和硇洲族3个地理种群以及养殖群体等4个种群大黄鱼的鉴别引物。引物为’TGCCGCACTT－3’。鉴别时，采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA；PCR扩增反应反应体系总体积25uL，各种成分及终浓度为Buffer10mM，dNTP 0.2mM，Mg
文档编号G01N27/26GK1966723SQ200610135259
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月28日 优先权日2006年11月28日
发明者王德祥, 王军, 苏永全 申请人:厦门大学