专利名称：：一种检测肿瘤复发转移及评估疗效的试剂盒和方法
技术领域：
：本发明涉及一种非使入性检測、评估危重病人试刑盒的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被WCX/SAX磁珠或抗体捕获的血淸淀粉样蛋白A进行糖确地鉴别、检M的方法，本发明提供方法能够检測肿癍转移及复发、评估肿瘤病人的疗效，其灵敏度为100%，特异性为100%。变异的血洧淀粉样蛋白A足—个早期发现肿瘤恶化、预測转移及复发发生的早期预曹蛋白指纹组。它的持续阴性表达可以提示肿痛患者病情稳定，而其从阳性经治疗转阴也可达到此目的，因此，将其作为一种临床检拥平台，以预ftl肿癍的发展，并提示相应治疗，对患者长期生存有明确的临床意义.
背景技术：
：随着人类基因组计划的实施和完成，科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蚩白质，1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Willi鹏首先提出蛋白质组(proteo鹏)的概念，指的是"一种基闲组所表达的全部蛋白质"，即包括一种细胞乃至…种生物所表达的全部蛋白质.对于蛋白质组的研究是功能基肉组学研究的核心，称为蛋白质组学(proieoinics),蛋白质组学被认为是后基闲组研究中虽主要的部分，与基闲组相比，蛋白质组的组成吏复杂，功能吏活跃，应用前豕更广泛，蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质厲性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用邻，并由此获得对于疾痫过程、细胞生理生化特征和调控网络的广泛完整的认识.所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学等的豕要研究手段，不论是细胞的正常功能还是痫理特性都在一定程度上取决于细胞所表培的蛋白质功能，因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及怖査，并S终用于药物开发和疾病治疗，而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度，但细胞内许多物质往往以微Jt存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析.用抗体及质谱联合可克股这一技术缺点，
发明内容本发明的目的是建立一种在生物样品中检劂某种或多种疾病在离体血液中生物标志的试剂盒和方法.该方法为疾病的检測提供了新的途径，并为进-步发现新的变异的或修饰的生物标志提供了基础，本发明涉及一种非侵入性检測、评估危重病人的新方法，其特征是采用质谱法对样品中巳被WCX/SAX磁珠或抗体捕获的变异的血疳淀粉样蛋白A进行糖确地鉴别、检拥的方法，变异的血洧淀粉样蛋白A(—组分子量为11439土15Da,11527土15Da及11683土15Da或11860土15Da变异的蛋白指纹)是一个早期发现肿瘤恶化、预拥转移及复发发生fl^期预曹蛋白指纹组.它的持续阴性表达可以提示肿痛坦者病情稳定，而其从阳性经治疗转阴也可达到此目的.闲此，将其作为—种临床检測平台，以预測肿痛的发展，并提示相应治疗，对患者长期生存有明确的临床窓义.本发明中的变异的血消淀粉样蛋白A生物标志是利用一台质谱仪来发现的，该设备的质量精确度约为+/~0.1%,血消淀粉样蛋白A生物标志物首先能够被具有能与生物标志物结合的抗休或磁珠基质WCX/SAX吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在飞行质谁仪中被检新.生物标志物通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离于被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检ffi器将检測的离子信息转换为质荷比，定量性控制及质谱激光能ft调控每次翻试前，用质瞎的标准化质控血消，将标准化质控血消中用于定量的标准峰4091.IDa或6634.()Da强度调至5QK质敏信号强度的最大值。生物标志物的检翻明显地将与信号强度的检測有关，这样，生物标志物的数量与质量都可以被检测出来.飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱，该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能i攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和.这样降低了干扰，并増加了动态范围，该飞行时间数据受数据处理软件的彩响.软件中数据处理主髮包括转换飞行时间与质荷比而产生质谙，降低基线而减少仪器的偏移撒，和过滤离频噪音而减轻离频噪音，通过对生物标志物的吸附和检測而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析.该计算机程序分析这些数据以显示检测出的标记物的数tt，并显示信号的强度和确定被检測的每个生物标志物的分子i。数据分析还能包括-系列的确定生物标志物的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离.例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的离度，可规范观測到的峰.该参数可能是由仪器和类似能tf:吸收分子邻化学成分产生的不宽要的千扰，这可以设S调零，计算机可以将计算销果数据转换成各种形式来表现.其标准镥可以表示，但在一种形式中只有峰离和质量信息可以在镥带中保留，产生一个较消晰的图，并使具有儿乎相同分子量的生物标志物更易显现.在另一种形式中，两个或吏多的镥比较，便于突显独特的生物标记物和那些髙于或低于校准样本的生物标志物.分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图镥中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检測峰.一般情况下，该软件通过旌定信号具有信噪比离于—个选择两值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作，在一个有效的程序中，比较许多谁线以认定出现在质谱中某-选定范网内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光请的峰，对所有在质l:(质荷比〉中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇，对生物标志的检測糖耍将一个样本放基质的一个吸附点上，接着进行洧洗。向吸附点.l:加入SINAPINIC酸等并让其干燥.而后，用质谁測定法对基质进行分析,而一个显示了蛋白质分子的迪留物图将生成，这张图是在蛋白质分子的质豕-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。因为本项发明中的生物标记是通过质景和抗体来标识的，因而它们可通过质镥翻定法进行检測而直接知道它们特定的身份。这种方法比抗体为基础的ELISA及免疫荧光法更准确，然而，如果有必要，这些生物标志也可通过，比如，确定多肽的氰基酸序列来进行鉴别.例如，一个生物标志能用许多描绘出来，例如V8蛋白瞎(V8protease)或肤蛋白解，而且消化片段(digestionfragmentO的分子世可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与由多种鵜生成的消化片断的分子世相吻合，或者，如果此生物标志不是已知数据库中的蛋白质分子，在生物标志的N极氰基酸序列(N-tenni旭LAminoAcidS叫uence)的基础上，可使用降解探针，而后，这些探针会被用来描绘由探劂到了生物标志的样本所生成的基闲组或c咖A库，最后，蛋白质生物标志可用蛋白质梯状排序法(prou'inladdersequencing)进行排序，通过将分子碎成碎片并将碎片用籌解作用或其他可按顺序从碎片末除去—'个单个ft基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质梯度(proteinLadders)，然后，用质谱对此梯度进行分析，阶梯状碎片(ladderfragments)在质it上的差异可鉴别出从分子末坩被除去的豕基酸。特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征，通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来，对专有特征的识别往往依賴于特殊的检測方法，例如耍了解某种疾病是否存在有特异性抗原就要用有关特异性抗体来检測.自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检測和界定方法有了很大的突破。如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿痛的标志，根据基因到蛋白质表达的复杂过程，一种特异性基丙的产ft"蛋白质必定有相关多组分蛋白质的表达，通过对这些不同组分的检翻形成一个综合模式图(蛋白指纹图班)，将这种图谱(如某种肿癍)与其他图镥(如正常人或其他疾病)相比较，进而识别这种特异蛋白(如肿瘤抗原或其片段)，从而将正常人与忠某种疾病病人血液区分开来，通过分析阴离子表面基质所捕获的肿癍无转移病人、肿癍转移病人、肿痛复发病人及复发、转移肿痫病人有效治疗后(肺痛、食管痛、s癌、肝痛、肠癌、乳膝痛、宫颈癌、脑肿、淋巴癍、卵巢痛、前列腺癌、胰腺痫、膀胱痛、冉咽癌邻)的血样品(血疳和血浆)中蛋白指纹峰(圉1),发现下述--组分子量为11439土15,11527土15及1l明3土15Da蛋白指纹可以用于区分肿痛无转移病人、肿痛转移病人、肿痛复发病人及^[发、转移肿痛病人有效治疗后的血洧，对于鉴别肿瘤有无转移、复发及疗效具有宽要意义。特征为—组(簾)三个峰值11683峰值>11527峰值>11439峰值(特征为11683峰值岛于11527峰值、11527峰值髙于11439峰值.)(囲1).部分肿痛转移病人有一组(銜四个峰值:11683峰值>11527峰值>11439峰值>11860峰值(特征为11683峰值高于11527峰值、11527峰值离于11439峰值、11439峰值布于11860峰值)(面2),通过这个组峰的鉴别，实验中50例肿瘤无转移病人的血消，加例肿痛转移病人的血清，30例不问肿瘤复发病人的血消，加例复发、转移肿痛病人有效治疗后的血消被准确的检出.此结果表明，该方法的灵敏度为100%,特异性100%.用抗血消淀粉样蛋白A抗体基质与质谱仪联合应用发现被分析物与阴离子表面基质所捕获的一致，则11439土15Da，11527±15Da及U683±15Da成11860土15Da化学结构可以推測为变异的血清淀粉样蛋白A。将11439土15,11527±15及11683土15Da生物标志用多级质醣(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(proteinladders叫u抑cing)进行排序，鉴别出11439土15，11527土15及11683土15Da生物标志为变异的血洧淀粉样蛋白A。其化学结构为(从N袖至C端排列为104个豕基酸)11683±15Da生物标志的化学结构(N塌助ffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggvwaaeaisdareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpa6lpekyC塌).11527土15Da生物标志的化学结构(N塌sffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggvwaaea旧dareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpa6lpekyC端)，11439土15Da生物标志的化学结构(N端ffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggvwaaeaisdareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpaglpekyC袖).所述的11683±15Da蛋白指纹为血洧淀粉样蛋白A,11527±15Da歪白指纹的化学结构为变异的血淸淀粉样蛋白A(其氨基段除去糖贫酸)，11439土15处Da蛋白指纹的化学结构为变异的血潸淀粉样蛋白A(其氨基段除去精氨酸及丝氨酸)，将变异的血消淀粉样蛋白A制备单克隆抗体(组)或多克隆抗体(组)来检測变异的血洧淀粉样蛋白A的试剂盒.本试剂盒可鉴别一组分子量为"439土15，11527土15及11683土15Da或11860±15Da变异的蛋白指纹的变化，并对于肿癍有无转移、复发及疗效有意义。将来自具有统计意义的肿痛无转移病人、肿痛转移病人、肿《复发病人及复发、转移肿痛病人有效治疗后的血清比较，用WCX敏珠所捕获的11439土15,11527土15及11683土15Da或11860土15Da组或抗血糖淀粉样蛋白A抗体吸附表面所捕获的血清淀粉样蛋白A生物标志是一致的，抗血淸淀粉样蛋白A抗体吸附表面所捕获的新型变异血疳淀粉样蛋白A或用WCX磁珠所捕获的11439土15，11527±15及11683土15Da或11860土15Da组的试剂盒可检籌肿瘤转移及g发、评估肿痛病人疗效.本发明提供方法能够检測肿癍转移及复发、评估肿癍病人疗效，其灵敏度为100%，特异性为100%,具体操作步骤以下是用本发明提供的一个操作方案实例，1.样品处理及标准化质控血消制备将生物样品稀释在稀释锾冲溶液中，视需要离心澄清样品，质谮的标准化质控血潘制备定义符合如下标准供血者10人，5男5女，血型为0型年龄为18-30岁民族汉，生化指标正常，包括总胆圃醉、甘油三酯、空股血糖、乙肝表面抗原、肝功检査、肾功检査；无遗传病家族史无宽大传染病史.女性不能怀孕，男性为不吸烟者。2.样品上样将质谱的标准化质控血消及样品点样在雄性珠子(雄珠)作为支持物的華质上[a.可用WCX或SAX基质的磁珠，阴离子表面(WCX,W幼kCationicExchanger,~~%酸基团)基质碟珠(实施例1)及阳离子表面(SAX,StrongAnionicExch助ger，^氨基基团)或用b.已标记上抗血消淀粉样蛋白A抗体基质的雄珠(实施例2)],可以将质请的标准化质控血疳用于质谙的定量方法.基质的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多荣体或S印harosebeads-3.洗潘用结合缓冲液洗条，在样品完全T燥前将第一份洗潘溶滚加到该位点.洗涤溶液在位点上至少停留10秒，彻底消除第一份洗潘溶液，用第二份洗涤液宽复以上步骤.0.5~2%三氣乙欲彻底洗潘整个磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金展片(有.3x3mn岡孔)上，自然千燥金M片，加0.5)iL吸能分子(以50%乙腈，O.战三IR乙酸的制备的标准溶液).吸能分子可用Si卿inicacid或alplurCyano+hydroxycinnamicacid等，4.质谁的定量控制及測试用徵光解吸/离子化飞行时间质谁仪，用尻激光仪(337mn)和抑cm或l加cm飞行管分析阵列去分析滞留与各位点的生物标志或蛋白质，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色'质谙联用仪(LC-MS)标准方法去分析滞苗于各位点的生物标志或蛋白质.用卡t算机分析数据进行数据S4展示，定量性质镥调控每次试前，用质请的标准化质控血消，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至50%信号强度的鬼大值.本发明与其他非设入性的体外检測方法比较，具有以下的特点(1)准确及糖确用抗体及质镥联合精确检测多种生物标志方法的一个特点是能够从复杂的样品混合物中准确地分辨出分析物.抗体与抗原铕合的准确率超过9战.这是ELISA及免疫荧光试剂盒等的基楚，质请直接分析有很强的糖确性，一般误差率只有0.1Da。闵为蛋白质是由ft基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指敏基酸变化)就很容易被推拥出来，但ELISA及免疫荧光试剂盒无法知道抗原的变异，所以，用抗体及质據联合精确检測生物标志方法可提供被分析物(扭原或生物标志)化学或结构特征的直接信息，(2)方便本方法将蛋白质分成了阴离子、阳离子、抗体作用的蛋白质，这样，可用质谱仪直接进行分析。蛋白质被鉴定以后可以用数码格式(条码带)永远地保留下来，这样可以节省标本库的面积。(3)快徒用本发明提供的已知抗体及质谁联合精确检測生物标志方法进行疾病血消检拥时，无需对蛋白质进行SI序即可知"变异的或修饰的生物标志"，不像免疫荧光法试剂盒，无法知道"变异的或修饰的生物标志修饰的生物标志指甲基化、乙酰化、羟基化、磯酸化修饰等的离表达或低表达变化，用本发明提供的蛋白指纹法进行疾病血淸诊断时，无糖对蛋白质进行測序。本方法用WCX基质、血洧淀粉样蛋白A抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检拥发现一种新型变异的血洧淀粉样蛋白A，变异的血洧淀粉样蛋白A可用于检M肿瘤转移及复发、评估肿癍病人疗效.变异的血消淀粉样蛋白A升高者提示疗效差、肿瘤转移及复发.所以它是一个早期发现肿痛恶化、预ii转移及复发发生的早期预，蛋白指纹组，它的持续阴性表达可以提示肿痛边者病情租定，而其从阳性经治疗转阴也可达到此目的.因此，将其作为一种临床检SI平台，以预M肿痛的发展，并提示相应治疗，对患者长期生存有明确的临床窓义，通过WCX基质及被抗体吸附表面基质上捕获的变异的血清淀粉样蛋白A,用标准化质控血消控制下的定量性质镥分析来检翻，可以应用到已经脱离人体的体液屮的生物标志组合的检拥方法或试剂盒开发，本方法准确、方便且快捷，附围说明围1不同复发、转移肿癍病人血疳中11439土15,11527土15及11683上15Da蛋白指纹峰值圉2二例肿癍转移病人的血洧中11860±15Da蛋白指纹峰值图3肿痛转移病人疗效评估图4肿痛复发病人疗效评估具体实旌方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1—种检測肿痛复发、转移及评估疗效的试剂盒和方法(1)实接方法—、材料1.标本来源肺痛、食管痛、宵痛、肝痛、肠痛、乳腺痛、宫颈痛、脑肿痛、淋巴痛、卵巢痛、前列膝癌、胰腺痛、膀胱癌、典咽痛等的血样品(血洧和血荣)，A.50例肿瘤iSMM^病人的血消B.20例肿瘤SM^^人的血消；C.30例不同肿瘤a;i病人的血洧；D.20例复发、转移肿瘤病人S^g^的血稱，2.质Jt控制A.人标准化质控血滞B.质镥激光能量调控每次測试前，用上述标准化质控血清。二、方法1.样品的收集全血采集后吸取血洧，豕于一801C保存；~80"冰箱中取出血消样品，置冰盒上融解以IO,000转/分，41C离心2分钟取上潸液.2.样品的准备毎个吸附剂基质支持物点需耍血消3W,将血痫用2倍体积U9锾冲液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，p冊.O)稀释(例如3)U血消州6fil缓冲液稀释)，将样品充分混匀.将9W上述样品加入nitil相应的结合缓冲液，使得血消的总稀释倍数达到约幼倍，将处理好的血洧样品幼(il上样到吸附剂基质上，3.样品检拥上样，在WCX基质磁珠阵列点中加入40W处理好的样品，置振荡器，400-600转/分，4"簾荡1小时，甩出样品，每孔加入200W的结合缓冲液50mMNaAC，pH4.0~5.0，室温置振荡器400~600转/分，展费5分钟，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液重复操作一次，每孔加入200WHPLC水，立刻甩出.1%三氰&酸彻底洗潘整个WCX磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质镥专用金M片(有3x3mm岡孔〉上，自然干燥金属片，加0.5pL吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制备的标准溶液)。4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。(2)实验结果用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述一组分子量为11439±15,11527土15及11683±15Da蛋白指纹(图1)可以用于区分肿瘤无转移病人、肿瘤转移病人、肿瘤复发病人及复发、转移肿瘤病人有效治疗后的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>50例肿瘤无转移病人的血清阴性20例肿瘤转移病人的血清阳性30例不同肿瘤复发病人的血清阳性20例复发、转移肿瘤病人有效治疗后的血清阴性发现分子量为11439土15，11527土L5及11683土15Da蛋白指纹的变化对于鉴别肿瘤有无转移、复发及疗效具有重要意义。特征为11683峰值〉11527峰值>11439峰值(11683峰值高于11527峰值、11527峰值高于11439峰值。)(图1)。部分肿瘤转移病人有11860i15Da蛋白指纹峰，特征为11683峰值髙于11527峰值、11527峰值高于11439峰值、11439峰值高于11860峰值(图2)。通过这个组峰的鉴别，本实验中50例肿瘤无转移病人的血清，20例肿瘤转移病人的血清，30例不同肿瘤复发病人的血清，20例复发、转移肿瘤病人有效治疗后的血淸被准确的检出。此结果表明，该方法的灵敏度为100%,特异性100%。实施例2血液中血清淀粉样蛋白A分子鉴定用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)将带有羧酸基团标记的磁性珠上基质与抗血清淀粉样蛋白A抗体的氨基基团结合(GunnDL，etaLPreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidcmethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972:1(4):381-389.)将样品点样在一个抗血演淀粉样蛋白A抗体基质的位点上.用结合缓冲液洗欲，在样品完全干燥前将第一份洗欲溶液加到该位点，洗潘溶液在位点上至少停留10秒，彻底浦除第一份洗涤溶液，用第二份洗潘液宽复以上步骤。用l先三银乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质镥专用金属片(有3x3im岡孔)上，自然千燥金属片，加0.5)iLSinapinicacid吸能分子(以50%乙膀，O.战三氣乙酸的制备的标准溶液)。用质请仪，用氨激光仪(337咖)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析各位点的生物标志或蛋白貭，用计算机分析数据进行数据宽叠磁示，实驗结果用抗血淸淀粉样蛋白A抗体基质与质谁仪联合应用发现被分析物是分子量与实施例1—致，则11439±15，11527土15及11683土15Da或11860土15Da化学结构可以推翻为变异的血疳淀粉样蛋白A.发现下述变异的血淸淀粉样蛋白A可以用于区分肿瘇无转移病人、肿痛转移病人、肿痛复发病人及复发、转移肿痛病人有效治疗后的血消(圉3及圉4):<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>50例肿痛无转移病人的血清阴性加例肿癍转移病人的血消阳性30例不同肿癍复发病人的血洧阳性加例复发、转移肿痛病人有效治疗后的血洧，阴性实施例3变异的血洧淀粉样蛋白A的排序鉴定将11439土15,11527土15及11683±15Da生物标志用多级质瞎(MS/MS)、源后裂解(PSD〉及蛋白质梯状排序法(proteinladders叫u節cing)进行排序，通过将分子碎成碎片.可生成蛋白质梯度(proteinladders),然后，用质请对此梯度进行分析，鉴别出11439土15,11527土15及11明3:15Da生物标志为变异的血消淀粉样蛋白A,其化学结构为(从N端至C靖排列为104个氨基酸)11胡3+15Da生物标志的化学纳构助FFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC塌。11527土15Da生物标志的化学结构N埔SFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPA饥PEKY11439土15Da生物标志的化学结构FFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEVyGRSGKDPNHFRPASLPEKYC糊。用实施例2"血液中血滴淀粉样蛋白A分子鉴定"，即抗体及质瞎联合，可省去变异的血洧淀粉样蛋白A的排序鉴定，实施例4变异的血滴淀粉样蛋白A抗体的制备血涫淀粉样蛋白A的合成及序列N埔抑FFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEA旧DARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC埔，将合成的变异的血疳淀粉样蛋白A免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞.用溶血味苗斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞，将单个细胞扩增至1X10'个以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA..以提取的mRNA为模板，合成cDNA链.以此cDNA为樓板，加入鼠抗体重链可变区(Vh)通用引物，轻链可变区(V,.)通用引物，进行聚合K链反应，获符扩增的V,，基因片段和V,.基因片段.将扩埔产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳據定和分离。用glassmilk回收扩增的Vn基因片段和V,.基闲片段.与等摩尔尝试的LimkerPrimerMix泡合，进行聚合瞎链反应,连接V，,和Vw扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScPV).此ScFV可用于制备检測所需DNA片.将此扩坩产物两槻加限制性ft切位点.纯化定量后，连接到P^"载体上，将连接产物转化感染大肠杆菌TOPIO。经蓝白斑筛选及瞎切鉴定，怖选出熏组质粒，在卵孔板形成单克隆抗体，用EI.ISA法怖选出效价磁布的单克隆抗体株，大量制备，并从培养上疳中提取所需抗体，此抗体可用于制备检湖所需试剂盒.结论将来自具有统计意义的肿痛无转移病人、肿瘤转移病人、肿痛复发病人及贫发、转移肿瘇病人有效治疗后的血疳比较，用WCX磁珠所捕获的11439±15，11527土15及11683土15Da或11860±15Da组或抗血清淀粉样蛋白A抗体吸附表面所捕获的血滴淀粉样蛋白A生物标志是一致的，抗血洧淀粉样蛋白A抗体吸附表面所捕获的新型变异血清淀粉样蛋白A或用WCX雄珠所捕获的11439土15,11527土15及11683土15Da或11860土15Da组的试剂盒可检測肿痛转移及复发、评估肿瘤病人疗效，本发明提供方法能够检測肿痛转移及复发、评估肿瘤病人疗效，其灵敏度为100%,特异性为100%。本方法用WCX基质、血清淀粉样蛋白A抗体吸附表面基质及质镥法进行鉴别检翻发现—种新型变异的血淸淀粉样蛋白A.变异的血痫淀粉样蛋白A可用于检翻肿痛转移及贫发、评估肿痛病人疗效。变异的血清淀粉样蛋白A升高者提示疗效差。通过WCX基质及被抗体吸附表面基质上捕获的变异的血消淀粉样蛋白A，用标准化质控血潸控制下的定ft性质诺分析来检測，可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标志组合的检測方法或试剂盒开发，本方法准确、方便且快捷，在本发明提及的所有文献都在本申瑭中引用参考，就如同每—篇文献被单独引用作为参考那样，此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利耍求书所限定的范闱。权利要求1.本发明涉及一种检测肿瘤转移、复发及评估疗效的试剂盒和新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被基质捕获的变异的血清淀粉样蛋白A生物标志进行精确地鉴别、检测的方法。该方法通过以下步骤实现(1)样品处理及质谱标准化质控血清制备；(2)样品上样至磁珠基质上；(3)洗涤；(4)质谱的定量控制及质谱测试；其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清及样品点样在磁珠基质上。所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用0.5～2％三氟乙酸彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加0.5μL以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的吸能分子标准溶液。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等；所述步骤(4)用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析变异的血清淀粉样蛋白A生物标志。用计算机分析数据为一组(簇)11439±15Da，11527±15Da及11683±15Da或11860±15Da峰值。特征为11683峰值强度高于11527峰值、11527峰值强度高于11439峰值、11439峰值强度高于11860峰值。定量性质谱调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至50％信号强度的最大值。2.权利要求1所述的血淸淀粉样蛋白A生物标志试剂盒和分析方法，所捕获的变异的血消淀粉样蛋白A生物标志来源于已经脱离人体的全血、血消和血浆，3.权利要求1所述的基质包含阴离子表面基质、阳离子表面基质、抗血潸淀粉样蛋白A抗体基质，基质的支持物包含陶瓷珠、磁性珠、多聚体或S印harosebeads,4.权利要求1所述的一组(簇)分子量为11439土15Da,11527土15Da及11683土15Da或11860土15Da变异的蛋白指纹的变化对于鉴别肿癍有无转移、复发及肿癍疗效的试剂盒.5.权利耍求4所述的11683土15Da蛋白指纹为血疳淀粉样蛋白A,11527±15Da蛋白指纹的化学结构为变异的血液淀粉样蛋白A(其氨基塌除去了糖氡酸).11439±15Da蛋白指纹的化学结构为变异的血消淀粉样蛋白A(其氨基埔除去了精酸及丝1酸〉，6.—种权利要求4所述的检測变异的血稱淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于，它包括:一容器以及装于容器中的权利耍求4所述的检測变异的血疳淀粉样蛋白A的抗体(组),7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征于，所述的抗体(组)为单克隆抗体(组〉或多克隆抗体(组)。全文摘要本发明涉及一种检测肿瘤转移、复发及评估疗效的试剂盒和新方法，为一种非侵入性危重蛋白的体外检测方法。本方法用抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检测发现一种新型变异的血清淀粉样蛋白A。变异的血清淀粉样蛋白A或11439±15，11527±15及11683±15Da峰值可用于肿瘤转移、复发的检测及疗效评估。变异的血清淀粉样蛋白A或11439±15，11527±15及11683±15Da峰值升高者提示肿瘤转移、复发及疗效差。本发明提供的方法能够检测不同肿瘤的转移、复发及评估其疗效，其灵敏度为100％，特异性为100％。通过一组11439±15，11527±15及11683±15Da峰值或被抗体吸附表面基质上捕获的变异的血清淀粉样蛋白A，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测，可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标志组合的检测方法或试剂盒开发。本方法准确、方便且快捷。文档编号G01N30/02GK101191789SQ20061014495公开日2008年6月4日申请日期2006年11月27日优先权日2006年11月27日发明者洋许申请人:洋许