一种肿瘤相关抗原mage-d4重组截短蛋白和制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤相关抗原重组截短蛋白，尤其是一种肿瘤相关抗原MAGE-D4 的重组截短蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤，尤其是恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，已成为男性第二位死因，女性第三 位死因。近年来，尽管人们在生物医学领域已经取得了长足的进步，但恶性肿瘤的预后结局 并没有明显的改善。为此，人们开始寻找新的治疗手段，作为对传统治疗方法的重要补充。 其中，肿瘤的免疫治疗因其在预防肿瘤复发、转移、治疗微小残留肿瘤病灶等方面具有独特 的优势而引起人们的广泛关注。其分子基础是肿瘤细胞表达的自身特异性抗原不仅可以通 过与主要组织相容性复合体(MHC分子)结合激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，从而特异性杀 伤该抗原阳性的肿瘤细胞，同时还能诱导机体产生体液免疫反应，成为肿瘤免疫治疗时早 期诊断的重要分子标记物。筛选和鉴定有价值的肿瘤抗原是发展肿瘤免疫治疗手段的重要 前提。
[0003] MAGE-D4属于黑色素瘤相关抗原（Melanoma-associate antigen, MAGE)家族 II 型 基因的新成员，于2001年由Sasaki等采用基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE)技术时发现。MAGE-D4基因定位于人染色体Xpll，全长7643bp，由13个 外显子组成，其中第2、3、12外显子在转录过程中选择性剪接可产生a、b、c 3个变异体，它 们在翻译时使用相同的起始密码子，但终止密码子却不同，因此所编码的三种产物的N端 348个氨基酸都相同，C端有差异：D4b与D4a相比缺少了 C末端的2个氨基酸，D4c则缺少 了 C端的大部分区域，具有一个独特的66个氨基酸尾部。其中D4a和D4b蛋白含有MGE 家族同源保守序列（MAGE homology domain, MHD)，位于 421aa_600aa 上。
[0004] 近年来的研宄表明，MAGE-D4在人类正常组织中的表达仅限于卵巢和脑，而在胶质 瘤、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、食管癌、肝细胞癌等许多恶性肿瘤中均呈现高 表达状态，且与肿瘤细胞的增殖、迀移和侵袭等生物学行为有关。也有研宄显示MAGE-D4表 达阳性与阴性的肿瘤病人在结局预后及对辅助化疗的反应上亦有明显的差别，这些均表明 MAGE-D4有可能成为具有潜在应用前景的肿瘤相关抗原，在肿瘤的早期诊断、个体化治疗以 及预后预测等方面起重要作用。
[0005] 目前，一些生物医药公司已经在进行生产抗-MAGE-D4的抗体，例如Sigma aldrich公司针对l-116aa制备的抗体HPA003554 ;Santa Cruz公司针对23-310aa制备的 抗体sc-393203,尽管制备这些抗体的抗原氨基酸序列避开了 MHD，但是并没有充分覆盖B 细胞抗原表位，因而由这些抗原所制备的抗体，其免疫原性可能存在不足。而针对MAGE-D4 全长的抗体，由于MHD的存在，则有可能存在着特异性不足的问题。
【发明内容】
[0006] 针对以上问题，本发明的目的之一是提供一种肿瘤相关抗原MAGE-D4的重组截短 蛋白，该重组截短蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. 1所示。该重组截短蛋白的分子量大小为 45 kD。作为可选方式，所述蛋白中还含有his标签，其氨基酸序列如SEQ N0.2所示，即在 SEQ NO. 1所示截短蛋白首尾增加相应的氨基酸序列，其中l_5aa以及410aa、411aa为外围 的非功能(不具备免疫原性）的序列，6-1 Iaa为his标签对应的序列(不具备免疫原性)，his 标签的存在有利于蛋白的纯化，该蛋白对应的基因序列如SEQ NO. 4所不。
[0007] 本发明的目的之二是提供编码上述肿瘤相关抗原MAGE-D4截短蛋白的基因，其核 苷酸序列如SEQ NO. 3所示。
[0008] 本发明的目的之三是提供一种所述SEQ NO. 3或SEQ NO. 4所示的DNA的获得方法 如下：设计合成扩增SEQ NO. 3或SEQ NO. 4所述基因的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表达阳 性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的扩增，扩增产物经琼脂糖电泳，回收1200bp 左右DNA片段。
[0009] 作为可选方式，所述如SEQ NO. 4所示基因的制备方法，具体为：设计合成扩增SEQ NO. 4的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的 扩增，上游引物：5' -GGGAATTC CATATGGCTGAGGGAAGCTTCAGT GCG-3'（下划线为 Μ/e / 酶 切位点），下游引物：5 ' -CTAG TCTAGAGGGTATCTGGGACCTCGGGGCCAT-3 '（下划线为油a / 酶 切位点），扩增产物经琼脂糖电泳，回收1200bp左右DNA片段。
[0010] 本发明的目的之四是提供一种上述肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的制备 方法，将SEQ NO. 3或SEQ NO. 4所示的DNA序列连接到原核表达质粒，构建表达载体，转化 到克隆宿主菌中并筛选得到阳性转化子，提取重组表达质粒，转化到原核表达宿主菌中，经 LB (Luria-Bertani)液体培养、IPTG (异丙基硫代半乳糖苷）诱导后，破碎菌体，分离纯化 得到MAGE-D4融合蛋白或带有His (组氨酸）标签的MAGE-D4融合蛋白即是MAGE-D4重组 截短蛋白。
[0011] 具体地，一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的方法，包括： (1) 构建重组表达质粒：PCR扩增得到SEQ NO. 3或SEQ NO. 4所示的DNA序列，连接到 pCoId II质粒，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选出阳性菌落，提取重组质粒，经PCR验 证并测序鉴定正确后，得到阳性转化子； (2) 原核表达及纯化：提取重组质粒，转化到原核表达宿主菌BL-21 (DE3)pLySS中，经 LB液体培养、IPTG诱导后，破碎菌体，分离纯化得到MAGE-D4融合蛋白或带有His标签的 MAGE-D4融合蛋白。
[0012] 更具体地，一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的方法，包括： (1) 构建重组表达质粒：设计合成扩增SEQ NO. 4的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表 达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的扩增，上游引物：5'-GGGAATTC CATATGGCTGAGGGAAGCTTCAGT GCG-3'（下划线为 M/e / 酶切位点)，下游引物：5'-CTAG TCT AGAGGGTATCTGGGACCTCGGGGCCAT-3' (下划线为油a /酶切位点），扩增产物经琼脂糖电泳， 回收1200bp左右DNA片段，与pCold II质粒连接，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选出 阳性菌落，提取重组质粒，经PCR验证并测序鉴定正确后，得到阳性转化子； (2) 原核表达：提取重组质粒，将重组质粒转化到BL-21 (DE3)pLySS菌株，得到含有表 达载体的宿主菌，将宿主菌接种到LB液体培养基，经扩大培养，加入IPTG低温诱导表达， 取出菌液离心，菌体用裂解缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心，上清液即含融合蛋 白； (3)纯化：将获得的上清液与Ni-NTA纯化树脂结合，冰上孵育2h后，用结合缓冲液充 分洗柱，再用含150mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，分管收集，即得到纯化的融合 蛋白即重组截短蛋白。
[0013] 优选的，当上述加入的IPTG的终浓度为I. lmmol/L时融合蛋白的表达量最高。
[0014] 优选的，加入IPTG后，20°C诱导培养24小时融合蛋白的表达量最高。
[0015] 本发明的目的之五是提供上述肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白在制备抗肿 瘤抗体中的应用。
[0016] 本发明采用B印iPred方法对MAGE-D4全长蛋白进行抗原表位预测时发现， 在6-42aa、317-380aa、384-398aa处存在着3个较强的B细胞抗原表位，经NCBI同源性 (conserved domain architecture retrieval tool)比较未发现该区域存在同源保守序 列，而这些表位没有完全被现有的商品化抗体(例如Sigma aldrich公司针对l_116aa制备 的抗体HPA003554 ;Santa Cruz公司针对23-310aa制备的抗体sc-393203)所覆盖，发明人 认为，这可能是影响抗-MAGE-D4多克隆抗体的效率的原因。
[0017] 因此，本发明重新设计了新的MAGE-D4的重组截短蛋白（l_398aa)，该截短蛋白截 去了 C端的MGE家族同源保守序列，排除了 MGE家族其它成员的干扰，尽可能多的覆盖了 MAGE-D4的B细胞抗原表位，并在上游引入了对人体无免疫原性的6 XHis组氨酸标签以方 便纯化。利用该截断蛋白制备的多克隆抗体，为广泛应用于WB、IP、IF、ELISA等检测打下 基础。
[0018] 本发明首次在体外表达并获得了具有活性的氨基酸序列如SEQ NO. 1所示的 MAGE-D4重组截短蛋白（l-398aa)，并且实验证实，其具有更强的免疫原性和特异性，为下 一步制备M