专利名称：一种魏氏梭菌病及其致病菌型的检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸，具体讲是一种能快速检测样品中魏氏梭菌α毒素及能鉴定魏氏梭菌病致病菌型的试纸，可应用于兽医临床、畜牧养殖、食品安全、公共卫生、水质监测及相关领域。
背景技术：
魏氏梭菌(Clostridi umWelchii)，又称产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)，广泛分布于自然界，属典型的条件致病菌，也是动物肠道正常菌群的成员之一。它能引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性坏疽以及人类食物中毒，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原菌之一，对畜牧养殖业和人类健康构成严重危害。魏氏梭菌能产生多种外毒素，其中α、β、ε和ι是主要的致死毒素。依据主要致死性毒素与其抗毒素的中和试验可将魏氏梭菌分为A、B、C、D和E 5个型。各型菌均能产生的α毒素是第一个被发现既有酶活性又有毒素特性的细菌蛋白，被认为是最基本、最重要的致病因子。
目前，魏氏梭菌检测采用的技术方法有魏氏梭菌的分离鉴定、对流免疫电泳、PCR、复合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA、IHA、SPA-ELISA以及Dot-ELISA等。其中，魏氏梭菌的分离鉴定和对流免疫电泳采用传统的生化鉴定、动物感染试验，其方法繁琐耗时、灵敏度低，与临床的快速和准确诊断要求相去甚远；而PCR、复合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA等方法的样品处理过程复杂，需要在有设备条件的实验室进行，并要求有熟练掌握分子生物学实验操作技能的实验人员，且成本较高。IHA、SPA-ELISA及Dot-EL ISA仅用于检测抗魏氏梭菌毒素抗体，不能检测毒素，在魏氏梭菌病，特别是魏氏梭菌所引起的“猝死症”中，动物机体往往来不及产生相应的抗体就已经死亡。现有免疫学诊断基于多价抗魏氏梭菌抗血清中和反应检测，这种方法耗时、灵敏度低，无法鉴定到亚型。
胶体金免疫层析技术作为一种快速临床诊断技术，其特点是单分检测，方便快捷，除商品试剂外无需任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果，且保质期长。然而到目前为止，国内外尚无基于胶体金层析法的魏氏梭菌病诊断检测试纸，包括文献报道和发明专利。本发明能同时完成魏氏梭菌病的早期诊断和致病菌的亚型鉴定，可应用于农村养殖户、基层养殖场、兽医临床等现场。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够克服现有技术的不足，方便及时地检测魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸。
本发明提供的魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸，其α、A、B、C、D及E条带的金标垫由玻璃纤维素膜组成，α、A、B、C、D及E条带的反应膜由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)。将加样膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上分别制成α、A、B、C、D及E共6条试纸条带，其中，α条带含抗魏氏梭菌α毒素单抗1和抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗2，A条带含抗A型魏氏梭菌单抗1和抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗2，B条带含抗B型魏氏梭菌单抗1和抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗2，C条带含抗C型魏氏梭菌单抗1和抗C魏氏梭菌不同表位的单抗2，D条带含抗D型魏氏梭菌单抗1和抗D魏氏梭菌不同表位的单抗2，E条带含抗E型魏氏梭菌单抗1和抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗2。各条带质控带包被抗鼠IgG。
装配时可以为α条带单独使用，也可以将α条带同A条带、B条带、C条带、D条带、E条带任意一条带或几条带组合使用。
本发明的魏氏梭菌病及其致病菌型的联检金胶试纸具有以下优点(1)在魏氏梭菌病，特别是魏氏梭菌所引起的“猝死症”中，动物机体往往来不及产生相应的抗体就已经死亡。而本发明是基于魏氏梭菌α毒素的检测，一旦魏氏梭菌产生异常就会分泌α毒素，从而能实现对魏氏梭菌病的早期诊断，对魏氏梭菌病的流行病学及临床都有重要意义；(2)在知道畜禽患病后，为了防止魏氏梭菌病进一步传染和进行流行病学研究，从而为该病的预防及临床诊断与治疗提供可靠的依据。需要知道魏氏梭菌病的致病菌型，而本发明即可满足这一要求；(3)准确灵敏，特异性好，结果受外因影响较少，免疫胶体金快速诊断方法并不因为其快速而牺牲了它的灵敏准确性。此外，由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可应用于农村养殖户、基层养殖场、兽医临床等现场，实验结果也可长期保存；(4)在实地即可应用，不需要在有设备条件的实验室内进行，对操作人员要求不高，按说明书操作即可，并可随时检测待检样品。因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境，具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性；
(5)迅速快捷，结果客观，肉眼易于判断，可在几分钟之内得出结果；成本低廉，样品不需要特殊处理，所需试剂和样本量少。
四
图1，魏氏梭菌病及其致病菌型检测试纸结构正面示意图。
1吸水纸；2金标垫；3金标线(结合的单克隆抗体1为抗魏氏梭菌α毒素的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌单抗，也可以为抗C魏氏梭菌单抗，也可以为抗D魏氏梭菌单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌单抗)；4检测带(结合的单克隆抗体2为抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗C魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗D魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗)；5反应膜；6质控带(结合抗鼠IgG)；7加样膜。
五具体实施例方式
实施例(一)抗原的提取抗原魏氏梭菌α毒素的提取经过粗提和精提两个阶段。
粗提将A型魏氏梭菌菌株接种于半固体疱肉培养基，37℃培养10h后，按0.5％接种于半固体疱肉培养基中，37℃培养6h，用EKS滤板除菌滤过，滤液为粗制α毒素。
精提粗制α毒素(培养滤液)用70％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min后，弃上清；沉淀加等量生理盐水溶液悬浮，经20％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min，上清再经60％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min，弃上清；沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，再加15％丙酮(-20℃)，于4℃搅拌2h，1000rpm离心20min，上清再加60％丙酮于4℃搅拌30min，10000rpm离心15min，弃上清；沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，然后加35％丙酮于4℃搅拌2h，10000rpm离心15min，上清再加60％丙酮于4℃静置30min，10000rpm离心15min，沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，然后用生理盐水溶液透析；透析好的样品过HW-55凝胶柱，用0.01molpH7.1的硼酸缓冲液(含0.03molCaCl2)平衡并洗脱，按每管5ml收集，再次离心，条件同上，最后将沉淀悬浮1ml的NaCI溶液中，-20℃保存备用。
抗原A、B、C、D及E型魏氏梭菌菌体蛋白的提取过程为，无菌接种环刮取冻存的魏氏棱菌菌种，划线接种于固体培养基上，37℃厌氧条件下培养过夜。挑取单个菌落，接种于100ml厌氧肉汤培养基中。37℃200rpm振荡培养18小时后。将细菌培养物转移到无菌的离心管中。4℃以12000rpm离心20分钟。取沉淀用0.25MNaCI洗涤两次，再次离心，条件同上，最后将菌体悬浮于1ml的NaCI溶液中，-20℃保存备用。
实施例(二)分泌单抗的杂交瘤细胞的获取分泌魏氏梭菌α毒素单抗的杂交瘤细胞的获取过程如下1.小鼠的免疫(1)初次免疫将0.5ml抗原魏氏梭菌α毒素(含50μg)与等量完全福氏佐剂混合充分搅拌使混合液呈乳化状态，取8～10周龄雌性BALB/c小鼠，进行腹股沟腋下四点免疫，每只0.2ml；(2)再次免疫3周后抗原魏氏梭菌α毒素浓度不变，改用福氏不完全佐剂，依步骤(1)进行免疫；(3)加强免疫间隔3周后以水剂抗原100μg/ml，每只0.2ml，对小鼠进行腹腔注射；(4)末次免疫在融合前三天，再加强免疫一次，同步骤(3)，免疫后经小鼠眼眶内取血，以间接ELISA法测定血清中相应抗体，达到预定效价1∶3200以上，复合要求的小鼠可用于融合。
2.细胞的融合饲养细胞的制备用颈椎脱臼法处死小鼠1只；将小鼠浸泡在75％乙醇内5min消毒，用10ml注射器吸取无血清的PRMI-1640基础培养液8ml；将小鼠移入超净工作台内，以仰躺于台面上，用眼科剪剪开腹部皮肤并拉开，用酒精棉球对腹膜进行消毒；将注射器内的培养液全部注入腹腔，并用棉球轻揉腹腔1～2min；收集腹腔内的细胞悬液移入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，此沉淀即为收集到的小鼠腹腔巨噬细胞；同时对腹腔内的细胞悬液进行细胞计数，总数应在4×106以上；将小鼠腹腔巨噬细胞重悬于HAT培养液，调整细胞浓度在2×105个/ml左右；最后将细胞悬液按每孔0.1ml的量加入到96孔培养板的各个孔中。
小鼠免疫脾细胞的制备用颈椎脱臼法处死经检测效价最高的小鼠，无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；将脾脏放入盛在平皿内的不锈钢筛网中，剔除脂肪和结缔组织；用2支注射器针头撕开脾包膜，使细胞释放进入含20ml PRMI-1640基础培养液的平皿内；吸出平皿内的脾细胞悬液到50ml的离心管中，1000rpm离心5min沉淀细胞，弃上清；用4℃的0.91％NH4Cl溶液5ml混悬沉淀的细胞，置细胞悬液于冰浴条件下5min，破坏从脾脏中释出的红细胞；加入PRMI-1640基础培养液15ml终止NH4Cl的作用；将脾淋巴细胞以1000rpm离心5min，弃上清，再加入10ml基础培养液重新悬浮沉淀的脾淋巴细胞，此即为待融合的脾淋巴细胞，取样进行脾淋巴细胞计数。
SP2/O骨髓瘤细胞的收集为了防止HGPRT缺陷的回复突变，将SP2/O骨髓瘤细胞以每20代的间隔用8-杂氮鸟嘌呤(8-AG，15～20ug/ml培养基)处理，连续培养7天，除去含HGPRT的骨髓瘤细胞。融合前，收集进入对数生长期的SP2/O骨髓瘤细胞6～8瓶，将SP2/O细胞悬液在室温下以1000rpm离心5min，弃上清液；用PRMI-1640基础培养液20ml将沉淀的细胞洗2次，再用5ml PRMI-1640基础培养液重新悬浮后计数细胞，备用。
融合操作将所收集的脾淋巴细胞悬液与待融合的SP2/O骨髓瘤细胞悬液按1∶1～10∶1的比例混合，室温下以1000rpm离心min，弃上清液；用无菌滤纸吸干离心管内的残余液体；用吸管在1min内逐滴缓慢加入37℃预温的50％的PEG2000 0.4ml，与沉淀的细胞混合均匀；立即将细胞悬液吸入毛细管内，静置30秒钟，再缓慢将细胞悬液吹入离心管，慢慢加入8～10mlPRMI-1640基础培养液，边加边轻轻搅动；将终止反应后的细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清液，留下细胞；最后，按每2×107个脾淋巴细胞加入10ml HAT培养液的比例，加入HAT培养液重新悬浮已沉淀的融合细胞，接种于铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，放入CO2培养箱，在37℃，5％CO2和饱和湿度下培养。
3.融合细胞的选择性培养将以HAT培养液重新悬浮的融合细胞按每孔0.1ml的量，加到前述的预先准备好的含饲养细胞的96孔培养板中；将接种了融合细胞的96孔培养板置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养；融合后一周左右用新配的HAT培养液置换孔内的1/2培养液(每孔约0.1ml)，12天左右改用HT培养液。
4.杂交瘤细胞的筛选融合3天后，逐日镜检。待培养孔中细胞集落达1/3视野以上时开始初筛。以间接ELISA法检测克隆板培养液上清，同时以稀释的正常小鼠血清(1∶500)作阴性对照。以稀释的免疫小鼠血清(1∶500)为阳性对照。首先，吸取杂交瘤培养上清2滴，加入预先包被抗原魏氏梭菌α毒素的酶标板中，用封板膜封好，37℃温育30min，洗涤板孔3次；再加入稀释好的HRP标记羊抗小鼠IgG，50μl/孔，用封板膜封好，37℃15min，洗涤板孔3次；最后，加入底物使用液100μl，用封板膜封好，37℃温育10min。终止液终止反应。在酶标仪上测OD值。以OD值高于阴性对照2倍以上的为阳性孔。
5.杂交瘤细胞的克隆培养本实验采用有限稀释法(1)在已检测过的96孔培养板内将待克隆的孔做好标记；
(2)用吸管吹打孔内的细胞使其散开，从孔内吸出0.1ml细胞悬液到1ml杂交细胞培养液中计数；(3)初次克隆时用HT培养液调整杂交瘤细胞密度到3～10个/ml。每块96孔培养板为10ml(第二次或第三次克隆可改用杂交细胞培养液)；(4)将调好预定密度的细胞悬液加到含饲养细胞的96孔培养板，每个孔加0.1ml；(5)将96孔培养板置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养(6)第4天用新培养液置换孔内1/2上清液；(7)第7天至第9天，当孔底细胞集落在1～2mm大小时，吸出杂交瘤细胞生长孔的上清液。按抗体筛选方法检测上清液中的抗体。计算杂交瘤细胞的阳性孔比率(阳性孔数/杂交细胞生长孔数×100％)；(8)将抗体阳性的孔内细胞移到24孔培养板扩大培养2～4d；(9)按步骤(1)～(7)，将扩大培养后的阳性细胞再重复克隆2～3次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％为止。孔内的细胞即为克隆化后的杂交瘤细胞；(10)将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养后，以1000rpm离心5min。收集上清液作单抗鉴定，冻存沉淀的细胞备用；本发明涉及的分泌A、B、C、D及E型魏氏梭菌单抗的杂交瘤细胞的获取过程同上。
实施例(三)单抗的制备和纯化魏氏梭菌α毒素单抗的制备和纯化过程如下1.鼠腹水的诱导和制备用杂交瘤细胞诱生的小鼠腹水中，抗体的浓度比培养上清液高1000倍以上。
(1)取BALB/c小鼠2～3只，经腹腔注入无菌石蜡油，每只小鼠0.2ml；(2)1周后，将对数期生长的杂交瘤细胞以1000rpm离心5min，弃上清液；(3)细胞计数，调节细胞密度至106个/ml；(4)将0.2ml细胞悬液注入已用无菌石蜡油处理l周的小鼠腹腔；(5)7～10天后，小鼠腹部增大。可以用粗针头(12号针头)扎入腹腔，挤压腹部使腹水流出；(6)收集腹水，以1000rpm离心5min，上清液即为含有所需单抗的腹水。每3d可收一次腹水；直至小鼠死亡。也可以直接处死小鼠作一次性收集。
(7)从腹水中离心的细胞可以接种到用无菌石蜡油处理的其它小鼠腹腔，或冻存备用。
2.单抗的纯化采用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，过程如下(1)将收集的腹水合并，置于4℃冰箱中沉淀脂肪等杂质，3000rpm离心10min，收集上清，测量体积；(2)加入等体积生理盐水，于4℃下再缓慢加入等体积33％饱和硫酸铵，边加边搅拌；(3)置于4℃冰箱中过夜；(4)第二天离心，3000rpm离心5min，弃上清，沉淀用尽量少的PBS缓冲液重悬；(5)在4℃下用PBS缓冲液透析，每天更换2次，透析3天通过离心取上清液分装贮存于-20℃。
本发明涉及的A、B、C、D及E型魏氏梭菌单抗的制备和纯化过程同上。
实施例(四)金标单抗金标魏氏梭菌α毒素单抗过程如下1.待标记魏氏梭菌α毒素单抗溶液的制备将魏氏梭菌α毒素单抗预先在0.005mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后3500rpm 4℃离心1h，去除聚合物，沉淀用0.01的PBS缓冲液(pH8.0)稀释至1mg/ml备用。
2.待标胶体金溶液的准备用0.1mol/L K2CO3将胶体金液的pH值调至8.2。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
3.金标魏氏梭菌α毒素单抗边搅拌，边向10ml浓度为1％的金胶溶液中逐滴加入2.5ml浓度为1mg/ml的魏氏梭菌α毒素单抗，10min后，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌10min。制成的溶液即为胶体标记的金魏氏梭菌α毒素单抗溶液，测量体积备用。
4.金标魏氏梭菌α毒素单抗的纯化将标记好的胶体金魏氏梭菌α毒素单抗用蔗糖透析，浓缩至原体积的1/10。再经1500rpm离心20min。取上清加至丙烯葡聚糖凝胶S-400层析柱纯化。用0.02mol/l、pH8.2 TBS(内含1％BSA，0.05％叠氮钠)洗脱，收集颜色峰值时的液体5ml，4℃保存备用。
本发明涉及的A、B、C、D及E型魏氏梭菌单抗的胶体金标记的过程同上。
实施例(五)金胶试纸α条带的制备及装配将6×3mm的玻璃纤维素膜放入含质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为1％Tween-20的PBS缓冲液中浸泡30min，37℃干燥箱干燥，再将其浸泡于金标魏氏梭菌α毒素单抗1溶液中，自然干燥；用1mol/L PBS将不同表位魏氏梭菌α毒素单抗2和抗鼠IgG分别稀释至1mol/ml，2mol/ml，在25×3mm的硝酸纤维素膜上用点膜机喷成两条线，作为检测带和质控带，37℃干燥箱干燥3h，然后选择加封阻液作用1h，用缓冲液洗膜3次，自然干燥1h，用含质量百分比浓度为1％BSA的PBS缓冲液封闭2h，以0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，自然干燥2h；将加样膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上，即可制得魏氏梭菌病金胶检测α试纸条带。
本发明涉及A、B、C、D及E条带的制备及装配同上。
用于检测魏氏梭菌的金胶试纸装配时可以为α条带单独装配，也可以将α条带同A条带、B条带、C条带、D条带、E条带任意一条带或几条带组合装配。
权利要求
1.一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，它包括塑料底板、金标垫、加样膜、吸水纸以及反应膜，其中反应膜上具有检测带(T带)和质控带(C带)，其特征在于，所述金标垫由玻璃纤维素膜构成，膜上包被胶体金标记的单克隆抗体1，反应膜由硝酸纤维膜构成，膜上检测带包被单克隆抗体2，质控带包被抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，其特征在于单克隆抗体1为抗魏氏梭菌α毒素的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌单抗，也可以为抗C魏氏梭菌单抗，也可以为抗D魏氏梭菌单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌单抗。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，其特征在于单克隆抗体2为抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗C魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗D魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗。
4.根据权利要求1至3所述的一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，其特征在于抗体1和2可以为以下6种组合，α条带含抗魏氏梭菌α毒素单抗1和抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗2，也可以为A条带含抗A型魏氏梭菌单抗1和抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗2，也可以为B条带含抗B型魏氏梭菌单抗1和抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗2，也可以为C条带含抗C型魏氏梭菌单抗1和抗C魏氏梭菌不同表位的单抗2，也可以为D条带含抗D型魏氏梭菌单抗1和抗D魏氏梭菌不同表位的单抗2，也可以是E条带含抗E型魏氏梭菌单抗1和抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗2。
5.根据权利要求1至3所述的一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，其特征在于装配时可以为α条带单独使用，也可以将α条带同A条带、B条带、C条带、D条带、E条带任意一条带或几条带组合使用。
6.根据权利要求1至5所述的一种魏氏梭菌或是魏氏梭菌及其致病菌型的联检金胶试纸，其特征在于所述的魏氏梭菌或是魏氏梭菌及其致病菌型的联检金胶试纸可以在下列疾病检测中应用人食物中毒、人及动物气性坏疽、家畜肉性肾病及猝死症、经济动物肠毒血症、猪梭菌性肠炎、鸡坏死性肠炎、兔魏氏梭菌病、羊猝狙、羔羊痢疾以及由各型魏氏梭菌的分型鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸，该试纸可应用于兽医临床、畜牧养殖、食品安全、公共卫生、水质监测及相关领域。它由塑料底板、金标垫、加样膜、吸水纸以及反应膜组成。其中，α、A、B、C、D及E条带的金标垫由玻璃纤维素膜组成，膜上结合了胶体金标记的单抗；α、A、B、C、D及E条带的反应膜由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)，各检测带包埋有相应不同表位的单抗，各质控带结合有多抗。本发明能单独或同时完成魏氏梭菌病的早期诊断和各种致病菌的分型鉴定，具有操作简单、敏感特异、携带方便等特点。
文档编号G01N33/549GK1945336SQ20061020102
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者李红玉, 晏磊, 何丽娟, 陈瑜, 张波, 支德娟 申请人:兰州大学