专利名称：吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材的指纹图谱的建立方法，尤其是吴茱萸水溶性HPLC指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。
背景技术：
我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.或石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实。8～11月果实尚未开裂时，剪下果枝，晒干或低温干燥，除去枝、叶、果梗等杂质。别名米辣子、臭辣子树、气辣子、曲药子、茶辣子等。吴茱萸为常用中药材；也是常用苗药。性味功能与主治辛、苦、热；有小毒；有散寒止痛、降逆止呕和助阳止泻之功效，常用于治疗厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等，外治口疮，高血压症。众所周知，吴茱萸药材成分复杂，主要包括以下几类生物碱、苦味素、苯并色原酮类、萜类、黄酮、香豆精、木脂素、甾类化合物、挥发油和有机酸类。研究表明，吴茱萸的多种化学成分有各种具体的药理作用。因此，对其某一种或几种活性成分进行检测，就有失全面。不能真实反映吴茱萸药效的整体性。要全面有效地控制吴茱萸及其成方制剂的质量，必须对它的物质群整体予以控制。
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物的质量控制中亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已成为国际共识。为了有效控制吴茱萸药材的质量，使其质量控制技术更加完善、科学，申请人对吴茱萸的水溶性物质进行了全面系统的指纹图谱研究，建立了吴茱萸水溶性提取物的指纹图谱测定方法
发明内容
本发明的目的在于提供一种吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。本发明通过对吴茱萸水溶性提取物HPLC指纹图谱的研究，提供了一种更好的吴茱萸质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使吴茱萸药材的质量控制技术更为完善、科学。
本发明是这样实现的吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法包括以下步骤(1)供试品溶液的制备取吴茱萸药材粉碎，过筛，称取样品，加水浸泡，回流提取8小时，冷却后加乙醇，过滤，滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备取适量对照品，加水制成对照品溶液；(3)测定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪测定；将吴茱萸供试品溶液注入高效液相色谱仪进行洗脱，以0.04％的磷酸水溶液为A相、乙腈为B相进行梯度洗脱，洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集35min的检测数据；(4)以对照品色谱峰的相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和峰面积，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。
其中，高效液相色谱测定时的色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为B相乙腈和A相0.04％的磷酸水溶液；检测波长327±1nm。
供试品溶液的制备过程为取吴茱萸药材粉碎过60目筛，称取样品粉末2克，加入25mL蒸馏水浸泡，置80℃水浴回流提取8小时，冷却后加乙醇使其含量为50％，静置，用0.45um的水溶性滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备为取水原酸对照品，加入蒸馏水制成每1ml含10ug的对照品溶液。
步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10uL。
流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为开始时，A相95.0％，B相5.0％；到第7min时，A相92.0％，B相8.0％；到第13min时，A相89.0％，B相11.0％；到第30min时，A相70％，B相30％；到第35min时，A相70％，B相30％。
按照上述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法得到的吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。
所述标准指纹图谱中的共用峰不得少于24个。
与现有技术相比，本发明具有以下优点1.研究表明，吴茱萸的多种化学成分有各种具体的药理作用。对其某一种活性成分进行检测，就有失全面。本发明以吴茱萸水溶性提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表了吴茱萸大部分药理活性，能有效地表征吴茱萸药材的质量。提供了一种全面评价吴茱萸药材的科学方法，可作为吴茱萸质量检测和质量控制的标准指标之一。
2.将吴茱萸指纹图谱作为一个整体看待，注重其整体面貌特征，既避免了只测定一、二个化学成分来判定吴茱萸整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价吴茱萸的质量提供了新的对照标准，为提高吴茱萸及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。
3.本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点。由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此，本发明选择在327±1nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全；不仅绿原酸有较大吸收，而且其他色谱峰的吸收值良好，分离效果满意，基线平稳。
4.以往为测定吴茱萸中某种化学成分的含量，往往要对样品进行较复杂的处理，而本发明选用回流提取其水溶性成分，提取方法简单，时间短，节约了检验的成本和时间。
5.本发明方法所得水溶性指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
图1是用色谱柱①ZORBAX RX-C18 PN880967-902得到的吴茱萸水溶性指纹色谱图。
图2是用色谱柱②Hypersil ODS2 PN13134350270得到的吴茱萸水溶性指纹色谱图。
图3是用色谱柱③Hypersil ODS2 PN13120520183得到的吴茱萸水溶性指纹色谱图。
图4是分别在327nm、254nm、284nm、344nm、354nm波长处进行测定的吴茱萸水溶性指纹图谱。
图5是吴茱萸水溶性成分的DAD全扫描3D图。
图6是吴茱萸药材水溶性指纹图谱的共有模式图。
图7是36批吴茱萸药材水溶性指纹图谱的叠加图。
图8是吴茱萸药材水溶性HPLC指纹图谱。
具体实施例方式
具体实施例方式吴茱萸水溶性HPLC指纹图谱的建立方法及吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱1.仪器与试药1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦DAD检测器；安捷伦色谱工作站。
1.2试药绿原酸对照品购于中国药品生物制品检定所；乙腈，色谱纯；蒸馏水；针筒式微孔滤膜过滤器，直径13mm，0.45um；吴茱萸药材2.方法与结果2.1提取条件的考察对提取过程当中的水浴温度和提取时间进行考察，按照提取方法并按(表1)的条件，平行做九个实验，以绿原酸的含量计算，结果样品⑥即80℃水浴提取8个小时为最佳提取条件，且整体谱图峰形较好。
表1提取条件考察
2.2色谱条件的选择2.2.1流动相和梯度洗脱程序的确定申请人对流动相和梯度洗脱程序条件进行了考察，确定其条件如下表2流动相梯度洗脱程序
2.2.2色谱柱的选择申请人考察了三根不同的色谱柱[①Agilent TechnologiesZORBAX RX-C18 PN880967-902(4.6×250mm，5μm)②大连依利特科学仪器有限公司Hypersil ODS2 PN13134350270(4.0×250mm，5mm)③大连依利特科学仪器有限公司Hypersil ODS2PN13120520183(4.6×250mm，5mm)]在选定的相同色谱条件下进行测定。(见附图1、图2、图3所示)由附图1、图2、图3可以看出③号柱的分离效果要好于前两个色谱柱，故采用③号柱来建立吴茱萸水溶性指纹图谱。
2.2.3检测波长的确定申请人选择了327、254、284、344nm和354nm这五个波长同时进行检测(见附图4)。
同时还利用DAD二极管阵列检测器，对水溶性部分进行全波长扫描，327nm处绿原酸有最大吸收值(见附图5)。在选择绿原酸的较大吸收的同时，其他色谱峰的吸收值良好，分离效果满意，基线平稳，故选择327nm这个检测波长来做吴茱萸水溶性的指纹图谱。
通过以上实验，确定了色谱条件如下色谱柱十八烷基键合硅胶；流动相乙腈和0.04％磷酸水溶液；流速1mL/min；检测波长327±1nm；柱温25℃。
3.水溶性指纹图谱的测定3.1.1吴茱萸水溶性指纹图谱的制备对照品溶液的制备取水原酸对照品，加入蒸馏水制成每1ml含10ug的对照品溶液。
参照物选用水原酸作为参照物。
供试品溶液的制备取吴茱萸药材粉碎过60目筛，称取样品粉末2克，加入25mL蒸馏水浸泡，置80℃水浴回流提取8小时，冷却后加乙醇使其含量为50％，静置，用0.45um的水溶性滤膜过滤，即得供试品溶液。
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10uL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，记录35分钟的色谱图，即得到所需指纹图谱。通过对照品谱峰确定了11号峰是水原酸对照品峰。以水原酸色谱峰的相对保留时间和峰面积计算相对保留时间和相对峰面积。同时，用指纹图谱软件对所得数据和图谱进行处理即得到标准指纹图谱。
3.1.2精密度实验取江西樟树的吴茱萸药材，按建立的供试品溶液制备方法制备供试品，连续进样6次，以绿原酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD为0.14％，结果表明仪器精密度良好。
3.1.3稳定性实验取铜仁江口的吴茱萸药材，按建立的供试品溶液制备方法制备供试品，分别在0、2、4、8、12、24h进样，进样量为10μL，以绿原酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD为1.36％，结果表明在24小时内，吴茱萸色谱指纹图谱的图基本稳定，没有明显变化，符合指纹图谱要求。
3.1.4重现性实验取江西樟树的吴茱萸药材6份，按建立的供试品溶液制备方法平行制备6份供试品，分别进样，以绿原酸为检测指标，计算相对峰面积的RSD为1.4％，结果表明方法的重现性良好。
3.1.5回收率实验精密称取已测定含量的江西樟树的吴茱萸药材6份，定量加入对照品绿原酸4.14mg(80％)、4.10mg(80％)、5.27mg(100％)、5.24mg(100％)、6.16mg(120％)、6.17mg(120％)置样品中，按建立的供试品溶液制备方法制备供试品，按同样的色谱条件进行HPLC检测，计算回收率，结果见表3。
表3绿原酸加样回收率实验
3.1.6吴茱萸水溶性指纹图谱共有峰的确定和相似度计算通过对全国36批不同产地的吴茱萸水溶性指纹图谱的测定，并通过指纹图谱软件对色谱图和测定数据的处理，确定共有峰24个。得到了36批药材的水溶性指纹图谱叠加图(附图7)，水溶性指纹图谱共有模式图(附图6)，水溶性指纹图谱的相似性分析结果(表4)，其中以水原酸为参照物，其峰为11号峰(附图6)。
全国不同产地吴茱萸水溶性指纹图谱相似度计算和相似性分析结果如下表4 36批吴茱萸药材水溶性指纹图谱的相似性分析结果
3.1.7共有特征峰的描述(见附图6)(1)特征峰共有24个，其中10号峰的面积最大，最高。
(2)2、3、4、5、6、11、12、17共八个峰的峰面积和峰高较大。
(3)对照品水原酸的峰高、峰面积和峰形都很好。所得吴茱萸药材的共有指纹图谱如附图6。
(4)共有特征峰的相似系数除了NO.26样品较低外，其于都较高。说明指纹图谱的相似性较高，可作为吴茱萸药材的水溶性标准指纹图谱。
4.以上实验结果表明，应用该方法对吴茱萸水溶性成分进行测定，方法简单可靠。建立的指纹图谱，峰形好，峰分离效果好，峰面积较大。可作为吴茱萸水溶性成分的标准图谱。对吴茱萸种植、生产的质量控制和吴茱萸的鉴别提供了一个很好的方法。
权利要求
1.一种吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于它包括以下步骤(1)供试品溶液的制备取吴茱萸药材粉碎，过筛，称取样品，加水浸泡，回流提取8小时，冷却后加乙醇，过滤，滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备取适量对照品，加水制成对照品溶液；(3)测定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪测定；将吴茱萸供试品溶液注入高效液相色谱仪进行洗脱，以0.04％的磷酸水溶液为A相、乙腈为B相进行梯度洗脱，洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集35min的检测数据；(4)以对照品色谱峰的相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和峰面积，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。
2.按照权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于高效液相色谱测定时的色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为B相乙腈和A相0.04％的磷酸水溶液；检测波长327±1nm。
3.按照权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于供试品溶液的制备过程为取吴茱萸药材粉碎过60目筛，称取样品粉末2克，加入25mL蒸馏水浸泡，置80℃水浴回流提取8小时，冷却后加乙醇使其含量为50％，静置，用0.45um的水溶性滤膜过滤，即得供试品溶液。
4.按照权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于对照品溶液的制备为取水原酸对照品，加入蒸馏水制成每1ml含10ug的对照品溶液。
5.按照权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10uL。
6.按照权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法，其特征在于流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为开始时，A相95.0％，B相5.0％；到第7min时，A相92.0％，B相8.0％；到第13min时，A相89.0％，B相11.0％；到第30min时，A相70％，B相30％；到第35min时，A相70％，B相30％。
7.如权利要求1所述吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法得到的吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。
8.按照权利要求7所述的吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱，其特征在于所述图谱中的共用峰不得少于24个。
全文摘要
本发明提供了一种吴茱萸水溶性指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，用高效液相色谱仪测定，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到吴茱萸水溶性成分标准指纹图谱。与现有技术相比，本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点；水溶性成分的提取方法简单，时间短；所得水溶性指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠；所建立的标准指纹图谱能有效地表征吴茱萸药材的质量，为完整、准确评价吴茱萸的质量提供了新的对照标准，为提高吴茱萸及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。
文档编号G01N30/26GK1932507SQ200610200919
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者周欣, 陈华国, 雷培海, 刘海, 周伟 申请人:贵州师范大学