多种微量试样的注入和转移方法

专利名称：多种微量试样的注入和转移方法
技术领域：
本发明涉及多种的微量液体试样同时并行地向容器的注入、和转移方 法。特别地，本发明涉及在进化工程、制药、食品、生物风险、临床检验 机构、化合物质毒性检验机构等中，在使多种微量液体试样反应时所必需 的、可以同时并行地进行试样的分取的方法。
背景技术：
将多种(例如1000种以上)、微量(例如亚钠升)试样涂布或结合
在板上来并行、同时地进行相同处理的微型板已得到实用。另一方面，人
们也开发出了将各种试样结合到各自的小珠上进行操作的方式(on-beads 法)
但是，目前的方式中，需要用于将试样涂布到板上的特别装置(微型 描绘器(Micro-plotter)或微型分注器(Micro-dispenser))，其操作既费 事又费时间。另外，如此涂布的试样在进行反应时，通常仅在一定的反应 条件下是可能的，即使转移至不同的反应条件，所有的试样也都置于相同 的反应的条件下，从而无法对超过1000种的多种试样进行不同阶段的反 应，或将这些所有试样分别置于不同的反应条件下。另一方面，也有使用 小珠，在其中结合各自的试样进行操作的方式，但目前没有将这些小珠一 个一个地分开(空间分离)来进行操作。其理由是进行单独分离的操作需 要开发特别的装置，而且即使使用这些装置，分离、配置时也很繁琐，且 尚未公开后续处理较容易的方式(即，同时并行、快速地转移试样的方 式)。此外，制作超过1000种的不同的反应条件的简便的方式也尚未想 到。
一方面，人们已知了在具有多个(multi)微孔的基板(plate)上，可 以同时进行例如PCR之类的生物化学反应(日本专利文献特开平5 — 317030号公报(专利文献O )。然后，还进行了为使微孔的容量更小，
并且能顺利进行反应的改良(WO2002/025289 (专利文献2))。但是， 使用目前的多孔板的方法或装置时，虽然其他种类的试样也同时进行反 应，但各反应的条件相同，不能对每一个孔的反应条件进行单独地控制。

发明内容
发明要解决的课题
然而，很多时候想要对于相同的试样，在反应液的组成不同的条件下 进行反应来研究其结果。但是，这种情况下，需要在各容器(孔)中单独 地调整反应液的组成，但当其数目超过1000时，这种调整是不现实的， 实际上实施几乎不可能。通常采用实验设计法来代替，按照各条件的代表 性的设定进行实验，再演绎出结果。
这是由于存在如下问题的缘故，即向超过1000的容器(孔)中填 充反应液太复杂，另外，在该情况下需要改变组成。
因此，本发明的第一目的在于提供一种即使对于超过1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形状和表面状态不允许溶液向容器 (孔)内的流入，也可以简单地填充反应液等溶液的方法。
进而，本发明的第二目的在于提供一种即使对于超过1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形状和表面状态不允许溶液向容器 (孔)内的流入，也可以简单地填充反应液等溶液，并且在该情况下也可 以容易地改变组成的方法。
特别地，本发明的目的在于提供一种即使容器(孔)的容量微小，也 可以进行上述操作的方法。 解决课题的手段
解决上述课题的本发明如下所述。 一种向由在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板的 孔内注入溶液的方法，其中，
上述孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当上述孔的开口处于 向上的状态，静置多孔板时，即使上述孔的开口被上述溶液覆盖，也不能
将溶液注入到孔内，
在上述多孔板的具有上述孔的主表面上放置溶液，施加从孔的开口朝 向底部的离心力将上述溶液注入到上述孔内。如[1]所述的方法，上述离心力为10Xg以上。如[l]所述的方法，上述孔的开口的最大内径为5mm以下。如[3]所述的方法，上述离心力为20Xg以上。如[1]所述的方法，上述孔的开口的最大内径为lmm以下。如[5]所述的方法，上述离心力为100Xg以上。如[1] [6]的任一项中所述的方法，上述孔的内部容量为lOiU以下。如[1] [6]的任一项中所述的方法，上述孔的内部容量为lul以下。如[1] [8]的任一项中所述的方法，上述多孔板具有1000个以上的孔。如[1] [9]的任一项中所述的方法，在上述主表面上放置具有多个 开口的滤膜，进而在该滤膜上放置溶液，施加从孔的开口到底部方向的离 心力，将上述溶液通过上述滤膜的开口注入到上述孔内。如[10]所述的方法，是将溶液通过上述滤膜注入到上述多个孔的 一部分孔内。 —种从由在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板 (2)的至少一部分的孔，将该孔内容纳的溶液的至少一部分转移至由在 至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板(1)的孔内的方法， 其中，
上述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当上 述孔的开口处于向下的状态，静置多孔板(2)时，上述孔内的溶液不会 从孔中流出，
将上述多孔板(1)和多孔板(2)进行固定以使得两块板具有的至少 一部分孔彼此相对，施加从上述多孔板(1)的开口朝向底部的离心力， 将上述多孔板(2)的孔内的溶液注入到上述多孔板(1)的孔内。[13]如[12]所述的方法，上述多孔板(1)具有如下的尺寸、形状和表
面状态，即当上述孔的开口处于向上的状态，静置多孔板(1)时，即 使上述孔的开口被上述溶液覆盖，也不能将溶液注入到孔内。如[12]或[13]所述的方法，将具有多个开口的滤膜放置在上述多孔 板(1)和多孔板(2)之间，施加从上述多孔板(1)的开口朝向底部的 离心力，通过上述滤膜的开口进行上述溶液的转移。如[14]所述的方法，将溶液通过上述滤膜转移到上述多个孔的一 部分孔内。如[12] [15]的任一项中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的开口尺寸和形状、以及排列是相同的。如[12] [15]的任一项中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的开口尺寸和形状、容量以及排列的至少一部分是不同 的。如[12] [17]的任一项中所述的方法，上述离心力为100Xg以上。
发明效果
根据本发明，可以进行迄今实现不了的极微量多种试样的同时并行操 作(注入、、_y7° (Mess up)、转移、多层、分割、计量等)。


图l是本发明的方法(第一方式)的说明图2是本发明的方法中使用滤膜的例的概略图3是本发明的方法(第二方式)的说明图4是本发明的方法(第二方式)的说明图5是MMV制作原理的说明图6是MMV制作方法说明图7是MMV制作方法说明图8是MMV的1个孔的说明图9是使用MMV的培养状况的说明图10是使用MMV的培养结果(上为由荧光强度测定装置得到的图 片，下为照片)；
图11是由荧光强度测定装置得到的复制品制作的情况的图(左为原
始，右为复制(replica);
图12是多种溶液的逐次转移的说明图。
具体实施例方式
本发明的第一方式是向多孔板的孔内注入溶液的方法，所述多孔板由 在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成。
本发明的方法中使用的多孔板(以下有时也称为MMV (Multi Micro Vessel)(多重并行微小容器))是由在至少一个主表面上具有多个孔的 基板构成的。多个孔可以设在主表面上，也可以仅设在任何一个主表面 上。对设在多孔板的一个主表面上的孔的数目没有特别的限定，但可以为 例如每平方英寸(2.5X2.5cm2) 1000个以上，处于1000 100,000的范围 内。孔的数目可以根据使用多孔板的目的进行适当决定。
对孔的内部容量没有特别限定，可以参考基板的大小、孔的数目、反 应(溶液的容量)等，进行适当决定。例如，孔的内部容量可以为10ul 以下，也可以为liU以下。对基板的材质没有特别限定，例如可以由塑 料、硅、凝胶等构成。
上述孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，§卩当上述孔的开口处于
向上的状态，静置多孔板时，即使孔的开口被应填充进孔的溶液所覆盖， 也不能将溶液注入到孔内。即，当孔的开口具有某种程度的大小时，如果 在设有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，则溶液会自然地流入孔内， 进行填充。但是，如果孔的开口的尺寸在一定值以下，由于表面张力，溶 液不会自然地流入孔内，需要使用微型注射器等来注入。这种现象的出现 不仅是由于孔的开口的尺寸，还由于孔的开口的形状以及孔的开口和孔内 的表面状态(特别是距开口较近部分的表面状态)。进而，根据欲注入孔 内的溶液(液体)的物理性质的不同，也会产生这种现象。本发明的方法
是针对这种多孔板将溶液注入到孔内的方法，如上所述，所述多孔板即使 在设有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不会自然地流入孔 内。
即使在设有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不会自然地 流入孔内的孔，取决于孔的尺寸、形状和表面状态，但例如当孔的开口的
最大内径为5mm以下时，溶液几乎都自然地流入孔内。当孔的开口的最 大内径为3mm以下时，溶液通常不会自然地流入孔内。当孔的开口的最 大内径为lmm以下时，溶液不会自然地流入孔内，此时本发明的方法的 效果得到最佳发挥。
对孔的开口的形状没有特别限定，但可以列举出例如圆形、方形(正 方形、长方形)、菱形、多边形(例如六边形、八边形等)等。进而，孔 的开口可以是具有突出的尖端(唇形)的形状，或者相反也可以对其进行 了倒角的形状。
对于孔的深度，可以参考孔的开口的尺寸和孔内填充溶液的容量，进 行适当决定。 一般地，孔的深度相对于孔的开口尺寸的比例越大，溶液越 难以填充到孔内，当孔的深度相对于孔的开口的尺寸的比例为1以上时， 本发明的方法特别有效，当孔的深度相对于孔的开口的尺寸的比例为2以 上时，也能产生有效的功能。孔的深度相对于孔的开口的尺寸的比例例如 可以是1 10的范围，优选为2 8的范围，更优选为2.5 5的范围。但 是，孔的深度最终要考虑到孔内填充溶液的容量和孔的开口的尺寸进行适 当决定，本发明的方法即使孔的深度相对于孔的开口的尺寸的比例超过 10，也能没有问题地发挥功能，即，可以进行溶液的填充。另外，根据本 发明，也可以适用于孔为无底的类型(即，管状)，此时，通过调节为适 当的条件(例如，离心力)，可以将溶液注入到孔(管)的中部，或者也 可以通到另一侧。
对于构成多孔板的基板的厚度，可以参考上述孔的深度、和多孔板要 求的强度、特别是孔的底部要求的强度，进行适当决定。通常，基板的厚 度与上述孔的深度为同等程度以上时较合适。孔的正面各面的4条边有时 可能未经精加工地切制而成，有时也可能具有设计成一定高度的边缘的凸
起。
在本发明的方法中，在具有上述多孔板的孔的主表面上放置溶液，然 后施加从孔的开口到底部方向的离心力，将溶液注入孔内。对于离心力， 可以考虑到孔开口的尺寸等、溶液向孔内流入的困难程度，进行适当决
定，例如可以为10Xg以上。例如，当孔的开口的最大内径为5mm以下 时，离心力优选为20Xg以上。进而，当孔的开口的最大内径为lmm以 下时，离心力优选为100Xg以上，更优选为100 2000Xg的范围。但 是，也可以根据孔的形状或容量等，施加更高的离心力。
参照图1进一步说明本发明的方法。图1是在离心管内设置MMV的 说明图。由于所使用的离心管的底部不是平面(是球面)，因此为使 MMV的设置面水平而向离心管内填充琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶的表面呈 水平状)。但是，不必一定要是琼脂糖凝胶，也可以使用其他的材料，另 外，也可以准备并使用底部为平面的离心管。在离心管内的琼脂糖凝胶的 上面载置MMV，然后加入向MMV的孔内填充的试样溶液(图的左 侧)。图中，使用大肠杆菌溶液作为试样溶液。然后，将该离心管安装到 离心分离机上，采用规定的离心力进行离心。通过离心，试样溶液被注入 进孔内(图的右侧)。
在通过离心而注入溶液时，如果能满足施加离心力、MMV设置面是 平坦的、MMV的上方浸满试样溶液等条件，也可以使用除离心管以外的 工具。例如，首先在底部为平面的容器中放置MMV，然后向其上方加入 试样溶液，通过手动旋转容器来给予离心力，也可以将溶液注入MMV的 孔内。
本发明的方法中，将具有多个开口的滤膜置于多孔板的主表面上，进 而在该滤膜上放置溶液，施加从孔的开口到底部方向的离心力，也可以将 上述溶液通过上述滤膜的开口，注入到上述孔内。使用滤膜可以仅将溶液 注入到一部分孔中。滤膜的开口的图案可以根据用途进行适当选择。滤膜 的例子如图2所示。
图2示出了滤膜1 10。黑色圆点是溶液通过部分的开口。另外，在 图的右下方表示组合使用该滤膜的多孔板。黑色圆点是孔，在纵和横向的
列中分别设计了32个孔，合计有1024个孔。
滤膜l是每隔l行，设计l行开口 (l行32个)，合计16行。 滤膜2是每隔2行，设计2行开口 (l行32个)，合计16行。 滤膜3是每隔3行，设计3行开口 (l行32个)，合计16行。 滤膜4是每隔4行，设计4行开口 (l行32个)，合计16行。 滤膜5 8是将滤膜1 4的纵向和横向(行和列)交替的滤膜。 滤膜9和IO是在一半的表面上设计16行或16列的开口 (1行或1列 32个)，合计16行或16列。
通过使用上述滤膜，且改变注入溶液的种类进行多次溶液注入，可以 控制孔内的溶液组成。如图2所示，依次使用10张滤膜，每张滤膜向 MMV内注入不同组成的溶液。具体地说，在MMV上装载滤膜1采用本 发明的离心法同时注入溶液。由此溶液进入的孔和无溶液进入的孔取决于 滤膜1的图案。依次从滤膜2到滤膜IO进行该操作。这样一来，对每1个 孔注入不同的溶液、或不注入溶液的这种选择共有10次。换句话说通过 该操作可以填充2"种组成不同的溶液。§卩，在1024孔中可以填充21()二 1024种组成不同的溶液。
如图2的右下方所示，从具有1024个孔的MMV的左上方的孔开始， 标记成孔0 孔1023。依此进行整理。通过IO张滤膜实现1024种溶液环 境时，如将每1个孔的溶液状态用10个数位(通过各滤膜的溶液注入成 为遍。10张即为10个数位)的二进制法(对于1张滤膜，有溶液进入时 为1，无溶液进入时为O)来表示，则孔O的溶液状态为
。另 外，孑L 1023为[llllllllll]。如上所述，本发明的方法中，使用滤膜可以 自由且容易地(花费的功夫少)调整填充至孔内的组成。
本发明的方法中，对于孔内填充的溶液没有特定的限定，但可以列举 出在进化工程、制药、食品、生物风险、临床检验机构、化合物质毒性检 验机构等中，进行多种的微量液体试样反应时使用的反应液或培养液。例 如，在鉴定微生物的种类时进行的营养需求试验(氨基酸、糖、维生素或 无机离子等)或某种生物种类的基因变异试验(即，考察新的营养需求性 或环境耐受性)的时候，并行处理多种条件的研究将变得容易。特别是，对于基因的种类，分别缺乏1种成分时症状轻，但同时缺乏2种以上的成 分时，有时会受到发育阻碍(可以看到渗出变异体等。存在补充代谢系时 可以看到这种现象。)。这时在探寻哪种成分的组合是其原因时运用本方 法，由于可以同时实现数量庞大的种类的组合，因此很有效。即使仅涉及 2种成分，但存在数量的问题时，也可以同样如此。例如，对于某种酶活
性，Mg+十和^111++具有替代性，假设其浓度分别在O.lmM到1M的范围 内(假设有30种条件O.lmM、 0.2mM、 0.3mM……)进行各种变化，即 使仅仅进行组合也有数量庞大(900种条件)的种类。对此大致可以一次 进行。
本发明的第二方式是如下的一种方法，即从由在至少一个主表面上
具有多个孔的基板构成的多孔板(2)的至少一部分孔，将该孔内容纳的 溶液的至少一部分转移至由在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的 多孔板(1)的孔内。
本发明的第二方式中，使用了两块多孔板，将一个多孔板(2)的孔 内的溶液转移到另一个多孔板(1)的孔内。这时，多孔板(2)的孔具有
如下的尺寸、形状和表面状态，即当孔的开口处于向下的状态，静置多
孔板(2)时，孔内的溶液不会从孔中流出。对于除此之外的方面，多孔 板(2)可以与上述第一方式中说明的多孔板相同。另外，多孔板(1)的
孔不必一定要具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当孔的开口处于向
下的状态，静置多孔板(1)时，孔内的溶液不会从孔中流出，但是，如 果是这种多孔板也可以。或者，多孔板(1)与上述第一方式中说明的多
孔板相同，可以具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当孔的开口处于 向上的状态，静置多孔板时，即使孔的开口被溶液覆盖，也不能将溶液注 入到孔内。但是，并不限定于此。对于除此之外的方面，多孔板(1)可 以与上述第一方式中说明的多孔板相同。
本发明的第二方式中，将多孔板(1)和多孔板(2)固定起来，使得
两块板具有的至少一部分的孔彼此相对，施加从多孔板(1)的开口朝向
底部的离心力，将上述多孔板(2)的孔内的溶液注入到上述多孔板(1)
的孔内。该状况如图3所示。离心力与上述第一方式中相同，可以是10X g以上。为使溶液的转移仅在孔间良好地进行，为使多孔板(1)的有孔的 主表面和多孔板(2)的有孔的主表面无间隙地密封，优选进行多孔板 (1)与多孔板(2)之间的固定。因此，优选两基板的上述主表面的平面 性和平滑性非常优异，并且有时也优选使用固定两基板的工具。
如图3所示，多孔板(1)的孔与多孔板(2)的孔的开口尺寸和形 状、以及排列例如可以相同。或者，多孔板(1)的孔与多孔板(2)的孔 的开口尺寸和形状、容量以及排列的至少一部分也可以是不同的。例如， 对于多孔板(1)的孔与多孔板(2)的孔的形状，也可以选择成多孔板
(1) 的1个开口对应于多孔板(2)的2个以上的开口 (图4的 (A))。或者，对于多孔板(1)的孔与多孔板(2)的孔的形状，也可
以选择成多孔板(1)的2个以上的开口对应于多孔板(2)的1个开口 (图4的(B))。这种情况下，可以选择各孔的开口形状，使相互的开 口适当地匹配。
进而，如图3所示，可以进行固定以使得多孔板(1)的孔与多孔板
(2) 的孔全部相对，也可以是固定使得仅一部分的孔相对(图4的 (C))。另外，多孔板(1)的孔与多孔板(2)的孔可以具有相同的开
口形状，也可以具有不同的开口形状(图4的(D))。
此外，将具有多个开口的滤膜放置在多孔板(1)和多孔板(2)之 间，施加从多孔板(1)的孔的开口朝向底部的离心力，通过上述滤膜的 开口也可以进行上述溶液的转移。这里使用的滤膜可以与上述第一方式中 说明的滤膜相同。通过滤膜，可以将溶液转移到多个孔的一部分孔内。另 外，使用的滤膜不限于1张，也可以数张重叠使用。这样一来，利用少数 几张滤膜就可以大量变换开口的图案。
实施例
下面，通过实施例进一步详细地说明本发明。 实施例1 MMV制作
多孔板(MMV)分为干型(SU—8等的塑料)和湿型(丙烯酰胺凝
胶)。本实施例中对于使用由丙烯酰胺凝胶制作的MMV的情况进行说 明。但是，使用干型的多孔板也可以同样地实施。
超高压水银灯的强光由于通过被称为组合模块的透镜阵列，光呈总体
上模糊且均匀地照射。经过反射，将与置于DMDTM中由电脑输入的数字
模式数据相同的模式投影到凝胶溶液上。由于核黄素的作用，紫外光照射 的地方产生聚合凝胶化。相反未经紫外光照射的地方则没有开始聚合而保
持液体状态，将该液体除去即形成空间(图5)。利用该原理，制作了如 图6所示形状的2种MMV (a)和(b)。
为了制作这样2种形状的MMV，在作为MMV的聚合过程的紫外光 照射时，采用了分阶段的投影方法(图7)。
MMV (a)的情况首先将紫外光全面投影到凝胶溶液上，形成作为 孔底的^:y于0夕、'(Betting)凝胶，再在该Betting凝胶上充满凝胶溶 液，投影紫外线形成孔。然后洗净并除去孔中的未凝胶化的凝胶溶液。孔 的尺寸如图8所示。
MMV (b)的情况首先用形成小孔的模具将紫外线照射到凝胶溶液 上，再在其上充满凝胶溶液并用形成大孔的模具进行照射紫外线。然后洗 净并除去孔中的未凝胶化的凝胶溶液。然后在事先制作好的Betting凝胶上 装载形成2层孔的凝胶并照射紫外线，进行粘合。
凝胶溶液的组成如下
40%双丙烯酰胺(1: 39) 10ml
20XTBE缓冲液 1.25ml
砂糖 12.5g
0.001%核黄素水溶液 > 、7 7 7 :y 7° (mess up) 合计 25ml
这里，双丙烯酰胺(1: 39)是表示N， N， 一亚甲基双丙烯酰胺和丙 烯酰胺按重量比1: 39的比例的混合物。将该溶液流入聚合凝胶上，根据 如图7所示的模具图案进行光致抗蚀剂紫外光照射。制作具有与模具图案 相同的均匀形状的孔。
实施例2
MMV作为反应器的一种应用——进行大肠杆菌培养
(1) 使用的MMV是在25平方mm内有100个孔或1024个孔的 16%聚丙烯酰胺凝胶MMV。
(2) MMV交换凝胶薄片的凝胶缓冲液。相对于1片MMV在IX SSC 300ml中轻微振荡45分钟。进行2次该操作。
(3) 去除进行缓冲液交换的MMV的孔中的缓冲液。作为该方法， 是通过经过干热灭菌的滤纸从孔中进行吸出操作。
(4) 事先将绿色荧光蛋白(GFP)产生大肠杆菌TOPO10以或1或无 的程度的浓度置于MMV各孔中，并将大肠杆菌溶液充满MMV各孔。作 为将大肠杆菌溶液充满MMV各孔的方法，采用本发明的离心法(图 1)。如果仅浸于大肠杆菌溶液中，则大肠杆菌溶液不会流入MMV的各 孔中，但施加约lOOOXg的离心力，可以将大肠杆菌溶液填充进全部孔 内。
(5) 将充满大肠杆菌溶液的MMV转移至培养皿中，并将进行缓冲 液交换的凝胶薄片覆盖在MMV上，在1XSSC气氛中密封培养皿，置于 孵卵器中在37i:下培养18小时(图9)。
(6) 用荧光强度测定装置检测培养后GFP的荧光，检测出大肠杆菌 的增殖情况。结果如图10所示。
以概率分布的大肠杆菌增殖的MMV为基础，制作图案与该图案完全 相同MMV。 [方法]
作为制作复制品的基础的MMV是上述进行大肠杆菌培养的MMV。 (1)如上述在MMV中的大肠杆菌培养中所述，在MMV中进行大 肠杆菌培养。这时通过离心法将大肠杆菌溶液充满孔时，存在有概率的有 大肠杆菌的孔和没有大肠杆菌的孔，如图10所示，适当地调整大肠杆菌 溶液浓度。
(2) 在培养大肠杆菌的MMV上叠放新的MMV (在1XSSC中进行 缓冲液交换，已吸出孔中的溶液)，使孔彼此对应，再装进离心管，通过 在1000Xg下进行离心将孔中的溶液转移到新的孔中(图3)。
(3) 在两MMV的孔中充满LB培养基，在37。C下培养18小时。
(4) 用荧光强度测定装置检测培养后GFP的荧光，检测出大肠杆菌 的增殖情况。结果如图ll所示。图的左侧是原先的MMV，右侧复制后的 MMV。两者被检测出的发生荧光的孔的图案几乎一致，可知含有大肠杆 菌的溶液的孔间转移良好。另外，上述离心中， 一部分的大肠杆菌溶液残 留在原先的MMV的孔内，其培养的结果被检测出来。
上述实施例中，使用正常形成的1024孔的MMV，进行离心注入，使 其每一个孔中有概率地存在作为期望值的1细胞大肠杆菌，继续进行37°C 下的培养，结果如图10所示，增殖成功并可见能观测到菌落的孔。这些 孔的分布为泊松分布。这显示了通过离心法成功地将大肠杆菌同时注入， 或该MMV作为培养大肠杆菌的容器发挥了功能。这种情况下，由于大肠 杆菌内含荧光性的蛋白质(绿色荧光蛋白质GFP)，因此从侧边观察可以 看见绿色光，从而表示了其荧光性。
进而，使用培养成功的MMV与同型号的1024孔MMV，顶对顶 (top-to-top)地进行重合，离心并同时转移试样(参照图3)。这里，向 试样被移空的一方的MMV离心注入新鲜的培养基，进行培养，得到(几 乎)同型的模式的复制品(参照图ll)。这表示可以进行同时并行转移。
另外，图3中的溶液的转移仅为1次，但如图12所示也可以将多种溶 液进行逐次转移，其结果是可以向孔内充填具有希望组成的溶液。进而这 时，通过使用上述滤膜，也可以进行调整，适当改变孔内的组成。
工业实用性
本发明可以在进化工程、制药、食品、生物风险、临床检验机构、化 合物质毒性检验机构等中，在使多种微量液体试样反应时所必需的、同时 并行地进行试样的分取的领域里得到应用。
权利要求
1.一种向由在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板的孔内注入溶液的方法，其中，所述孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当所述孔的开口处于向上的状态，静置多孔板时，即使所述孔的开口被所述溶液覆盖，也不能将溶液注入到孔内，在所述多孔板的具有所述孔的主表面上放置溶液，施加从孔的开口朝向底部的离心力，将所述溶液注入到所述孔内。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述离心力为10Xg以上。
3. 如权利要求l所述的方法，其中，所述孔的开口的最大内径为5mm 以下。
4. 如权利要求3所述的方法，其中，所述离心力为20Xg以上。
5. 如权利要求1所述的方法，所述孔的开口的最大内径为lmm以下。
6. 如权利要求5所述的方法，其中，所述离心力为100Xg以上。
7. 如权利要求1 6的任一项中所述的方法，其中，所述孔的内部容 量为10tU以下。
8. 如权利要求1 6的任一项中所述的方法，其中，所说孔的内部容 量为lul以下。
9. 如权利要求1 8的任一项中所述的方法，其中，所述多孔板具有 1000个以上的孔。
10. 如权利要求1 9的任一项中所述的方法，其中，在所述主表面上 放置具有多个开口的滤膜，进而在该滤膜上放置溶液，施加从孔的开口朝 向底部的离心力，将所述溶液通过所述滤膜的开口注入到所述孔内。
11. 如权利要求IO所述的方法，其中，将溶液通过上述滤膜注入到所 述多个孔的一部分孔内。
12. —种从由在至少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板 (2)的至少一部分孔，将该孔内容纳的溶液的至少一部分转移至由在至 少一个主表面上具有多个孔的基板构成的多孔板(1)的孔内的方法，其 中，所述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，S卩当所 述孔的开口处于向下的状态，静置多孔板(2)时，所述孔内的溶液不会 从孔中流出，将所述多孔板(1)和多孔板(2)固定起来使得两块板具有的至少一 部分孔彼此相对，施加从所述多孔板(1)的开口朝向底部的离心力，将 所述多孔板(2)的孔内的溶液注入到所述多孔板(1)的孔内。
13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述多孔板(1)的孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当所述孔的开口处于向上的状态，静置 多孔板(1)时，即使所述孔的开口被所述溶液覆盖，也不能将溶液注入 到孔内。
14. 如权利要求12或13所述的方法，其中，将具有多个开口的滤膜 放置在所述多孔板(1)和多孔板(2)之间，施加从所述多孔板(1)的 开口朝向底部的离心力，通过所述滤膜的开口进行所述溶液的转移。
15. 如权利要求14所述的方法，其中，将溶液通过所述滤膜转移到所 述多个孔的一部分孔内。
16. 如权利要求12 15的任一项中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的开口尺寸和形状、以及排列是相同的。
17. 如权利要求12 15的任一项中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的开口尺寸和形状、容量以及排列的至少一部分是不同的。
18. 如权利要求12 17的任一项中所述的方法，其中，所述离心力为 100Xg以上。
全文摘要
本发明提供一种向由具有多个孔的基板构成的多孔板的孔内注入溶液的方法。上述孔具有如下的尺寸、形状和表面状态，即当孔的开口处于向上的状态，静置多孔板时，即使上述孔的开口被上述溶液覆盖，也不能将溶液注入到孔内，在多孔板的具有孔的主表面上放置溶液，从孔的开口朝向底部方向施加离心力将上述溶液注入到上述孔内。本发明还提供一种从多孔板的孔向别的多孔板的孔转移溶液的方法。即使对于超过1000的容器(孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形状和表面状态不允许溶液向容器(孔)内的流入，也可以简单地填充反应液等溶液。
文档编号G01N35/10GK101375168SQ200680005428
公开日2009年2月25日 申请日期2006年2月17日 优先权日2005年2月18日
发明者内田秀和, 木下保则, 田山贵宏, 西垣功一 申请人:国立大学法人琦玉大学