专利名称：双n－奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明为一种奶牛隐性乳房炎的快速诊断试剂盒，定名为“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，专用于奶牛隐性乳房炎诊断。
二、技术背景在一个牛群中，大多数乳房炎是隐性型的，由于无临床症状，肉眼很难判断。隐性乳房炎的危害主要体现为(1)隐性乳房炎造成的泌乳母牛产奶量的损失占总生产能力的10％～15％；(2)隐性乳房炎牛易于转变为临床乳房炎；(3)隐性乳房炎牛所产乳汁中含有大量的炎性因子、病原微生物及其产生的毒素，可能危害牛奶消费者的身体健康。
目前，国内外监测隐性乳房炎的方法有(1)直接(牛奶)体细胞计数法，这是监控奶牛隐性乳房炎的可靠手段。但是，测定牛奶体细胞数，如果用仪器测定，一台体细胞测定仪的价格达40～60万元左右；用显微镜(人工)测定，则要对牛奶进行特殊处理，并对每个乳样进行观察计数，费时费力，且可靠性不高。(2)间接体细胞计数法，现在大多采用“加州乳房炎检测法”，该方法对于隐性乳房炎检测具有较好的效果，便于早期发现，但该技术的知识产权是国外的，且检测费用较高(每头奶牛每次检测材料费用0.3～0.5元人民币左右)；国内在加州乳房炎检测法的基础上衍生了一些检测方法，如兰州乳房炎检测法(LMT)、杭州乳房炎检测法(HMT)和上海乳房炎检测法(SMT)，但同样存在检测成本较大，且不适用于泌乳后期奶牛等问题，几乎在奶牛场没有应用。(3)其他检测方法，主要根据隐性乳房炎奶牛的乳汁中Na离子或Cl离子等浓度的变化，或根据乳汁酶含量的变化，而设计的乳汁pH检测、乳汁电导率检测、乳汁酶检测方法等，但这些检测方法需要采集乳样到实验室测定，且需具备特定的仪器，而不能用于现场检测。
发明内容
技术问题 本发明的目的是提供一种新型的奶牛隐性乳房炎的诊断试剂盒，此诊断试剂盒检测奶牛隐性乳房炎，符合率高，而且简便，成本低廉，测定结果不受季节、环境温度、奶牛泌乳期、饲养地区及日粮中不同食盐添加量的影响。
技术方案双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒，其特征在于，试剂A每10ml处方量含硝酸银1.2920g，去离子水10ml试剂B每10ml处方量含铬酸钾0.9990g，去离子水10ml上述双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒还可含有试剂C100ml去离子水。
上述的双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒的制备方法，包括将1.2920g硝酸银溶解于3～5ml去离子水中，并用去离子水定容至10ml，无菌密封包装于棕色试剂瓶中，并用黑色纸包裹，此即为试剂A；将0.9990g铬酸钾溶解于去离子水中，并用去离子水定容至10ml，无菌密封包装于棕色试剂瓶中，此即为试剂B；试剂A和试剂B组合成“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，于阴凉干燥处保存，试剂C为去离子水，对于没有去离子水的使用者选配，用于在测定前对试剂A进行稀释。
有益效果本发明为一种新型的奶牛隐性乳房炎的诊断试剂盒，定名为“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，专用于奶牛隐性乳房炎诊断。本试剂盒不但达到了与国外“加州隐性乳房炎检测法”有高的符合率(阳性符合率为90％以上)，而且经与体细胞计数法比较，证明其可靠性更高，能准确反应牛奶体细胞含量，且具有不受季节、温度、奶牛泌乳期、奶牛饲养地区及日粮中不同食盐添加量的影响，并同时具有快速、准确、简便、价廉等优点，每一个奶牛乳汁样本的检测试剂盒成本仅0.02元。
具体实施例方式
本发明是一种用于奶牛隐性乳房炎诊断的新型快速检测试剂盒组合。“双N”的含义是技术发明者的单位名称“南京农业大学”中的英文首字母“N”和试剂盒的主要成分“硝酸银”中的英文字母“N”的组合。
(一)试验盒研制1.牛奶中氯离子浓度与奶牛隐性乳房炎的关系实验方法分别以CMT和牛奶体细胞计数(SCC，仪器法)检测64头奶牛共230个乳区。根据两法测定的结果，将乳样分为三组I组为健康乳(即为隐性乳房炎阴性乳，表明来源于健康乳区)，其CMT检测为阴性(-)、SCC＜200×103/ml；II组为可疑乳，CMT检测为可疑(±)，200×103/ml＜SCC＜500×103/ml；III组为隐性乳房炎乳(即为隐性乳房炎阳性乳，表明来源于隐性乳房炎感染乳区)，CMT检测为阳性(+、++、+++)，SCC＞500×103/ml。
结果根据以上分组，用银量法对牛奶中氯离子浓度检测，结果如下隐性乳房炎阴性组乳汁中氯离子浓度为30～36mmol/l，可疑组为36～38mmol/l，阳性组为38～43mmol/l。氯离子浓度随着隐性乳房炎程度的增加而升高。CMT检测表明，健康乳与可疑乳氯离子浓度差异显著(P＜0.05)，隐性乳房炎乳与健康乳和可疑乳比较差异极显著(P＜0.01，见表1)；SCC检测表明，健康乳与可疑乳、隐性乳房炎比较，氯离子浓度差异极显著(P＜0.01)，隐性乳房炎乳与可疑乳氯离子浓度差异显著(P＜0.05，见表2)。
上述结果证明，乳汁中氯离子浓度是反映乳区是否发生隐性乳房炎的敏感、可靠指标。
表1 CMT检测隐性乳房炎发生程度与牛奶中Cl-浓度的关系
表2 SCC检测隐性乳房炎发生程度与牛奶中Cl-浓度的关系
2、试剂盒原理本课题组在比较了多种奶牛乳房炎检测方法后，设计了“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，其原理是随着乳房炎程度的增加，血液向乳汁中渗透氯化物增加，导致乳汁氯离子浓度逐渐增加(这种增加亦与乳汁中体细胞数成正比)。正常牛奶中氯离子含量为32～38mmol/l，而隐性乳房炎牛奶中氯离子浓度远高于正常值。根据氯离子可与硝酸银中的银离子反应生成白色的氯化银沉淀，而银离子可与铬酸根离子反应生成红色的铬酸银沉淀的化学原理，以正常牛奶中氯离子含量为32～38mmol/l为阈值，在乳样本中加入标准量的硝酸银和铬酸钾当乳汁中氯离子浓度高于其阈值时(隐性乳房炎牛)，可将硝酸银中的银离子完全中和，故银离子不会过量而与铬酸根离子反应，反应最终的溶液颜色是铬酸钾与牛奶混合的颜色(橙黄色、黄色或黄绿色)；正常乳汁中氯离子浓度低，故氯离子不能完全中和银离子，过剩的银离子与铬酸根离子反应，生成铬酸银沉淀，使最终的溶液颜色呈砖红色、浅砖红色或橙红色。
(二)试剂盒应用1.用法与用量测定前对试剂A进行稀释，方法如下取试剂A(全部10ml)，加试剂C(或自备去离子水)至100ml。测定时，备好5～10ml杀菌洁净干燥试管，在一个乳区采取2ml乳样于试管中，然后在试管中加入1ml稀释后的试剂A，摇匀后加入0.1ml试剂B，再摇匀后在5分钟内观察混合液颜色，判断结果。
结果判断标准隐性乳房炎阴性反应混合液颜色呈砖红色、浅砖红色或橙红色。
隐性乳房炎阳性反应混合液颜色呈橙黄色、黄色或黄绿色。
注意事项此诊断试剂盒不适用于泌乳初期(产犊后2周内)奶牛(因为初乳的成分与正常牛奶差别很大)。诊断试剂盒应避光保存。
2.不同季节对本试剂盒检测结果的影响实验方法于江苏境内，分别在冬季(2004年12月-2005年2月)、春季(2005年3月-2005年5月)、夏季(2005年6月-2005年8月)和秋季(2005年9月-2005年11月)采样。每季度采集40头奶牛(160个乳区)的奶样。以本试剂盒检测所有乳样，并与CMT法和和SCC法进行比较对照，计算本试剂盒测定结果与其他二法测定结果的符合率。
检测结果各季度本试剂盒与CMT法和SCC法的符合率均大于90％(92％～100％，见表3)，说明不同季节对本试剂盒检测结果无明显影响。
表3 不同季节样本诊断符合率的比较
3.不同地区奶牛场对本试剂盒检测效果的影响分别在江苏苏南(无锡)、苏中(南京)、苏北(徐州)三个奶牛场各采集30头奶牛(120个乳区)乳样，分别用本试剂盒、CMT和SCC三种方法检测。结果表明，三种方法检测结果基本一致，符合率均大于92％(见表4)，说明本试剂盒适用于不同地区(即不同的饲养管理条件)奶牛场。
表4 不同地区样本诊断符合率的比较
4.不同泌乳阶段对本试剂盒检测效果的影响实验方法将泌乳期划分为泌乳前期(14～100天，除产犊后两周)、泌乳中期(100～200天)和泌乳后期(200～300天)，分别采取30头奶牛(120个乳区)乳样，用上述三种方法检测，比较其符合率。
结果泌乳前期隐性乳房炎发病率高于泌乳后期发病率，最低发病率为泌乳盛期，用三种方法诊断结果基本一致。本试剂盒与CMT检测法和SCC法检测相比，符合率均大于90％，见表5。说明泌乳阶段不影响本试剂盒的测定结果。
表5 不同泌乳阶段样本诊断符合率的比较
5.不同温度对本试剂盒检测结果的影响实验方法将30个乳样分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 7个温度梯度的水浴锅中，用本试剂盒分别测定，比较其结果之间的重复率。
结果在5℃～35℃的温度范围内，温度对本试剂盒的测试结果无任何影响，检测结果一致，重复率为100％。
6.饲料中不同食盐添加量对牛奶中氯离子浓度及本试剂盒检测结果的影响实验方法本试验奶样采自集约化奶牛场，奶牛年龄3～7岁，胎次1～5胎，均为中产奶牛。28头试验牛分为两组，14头为对照组，14头为试验组。对照组每日饲喂牛场原有精料，试验组除饲喂原有精料外，另添加不同比例的食盐，食盐占精料的比例为0.8％～1.5％，预饲期为8天，正饲期为20天。在第0、8、21、31天采集28头牛共103个乳区的乳汁，每个乳区取20ml乳汁，进行氯离子浓度检测和SCC检测，剩余奶样用本试剂盒、CMT法、SCC法检测。
结果试验组和对照组牛奶中氯离子浓度在第0、8、21、31天分别比较，差异均不显著(p＞0.05，见表6)。试验组CMT与本试剂盒检测符合率最低为91.1％；SCC与本试剂盒检测符合率最低为89.3％；对照组CMT与本试剂盒检测符合率最低为91.1％，SCC与本试剂盒检测符合率最低为92.5％，见表7。结果证明，饲料中的不同氯离子浓度对本试剂盒的测定结果无明显影响。
表6 牛奶氯离子浓度与SCC
表7 三种测定方法符合率比较
权利要求
1.双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒，其特征在于，试剂A每10ml处方量含硝酸银1.2920g，去离子水10ml试剂B每10ml处方量含铬酸钾0.9990g，去离子水10ml
2.根据权利要求1所述双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒还可含有试剂C100ml去离子水。
3.权利要求1或2所述的双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于将1.2920g硝酸银溶解于3～5ml去离子水中，并用去离子水定容至10ml，无菌密封包装于棕色试剂瓶中，并用黑色纸包裹，此即为试剂A；将0.9990g铬酸钾溶解于去离子水中，并用去离子水定容至10ml，无菌密封包装于棕色试剂瓶中，此即为试剂B；试剂A和试剂B组合成“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，于阴凉干燥处保存，试剂C为去离子水，对于没有去离子水的使用者选配，用于在测定前对试剂A进行稀释。
全文摘要
本发明为一种新型的奶牛隐性乳房炎的诊断试剂盒，定名为“双N－奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，专用于奶牛隐性乳房炎诊断。其主要成分为硝酸银、铬酸钾。与加州乳房炎检测法(CMT)和体细胞计数法(SCC)比较，此诊断试剂盒检测奶牛隐性乳房炎，不但具有符合率高(大于90％)，而且更简便，成本更低廉，试剂盒保质期长，测定结果不受季节、环境温度、奶牛泌乳期、饲养地区及日粮中不同食盐添加量的影响。
文档编号G01N21/82GK101059444SQ20071002280
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月22日 优先权日2007年5月22日
发明者王根林, 宋维龙 申请人:南京农业大学