专利名称：一种中药材的质量标准指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明属于中药材的质量标准研究领域。涉及用于分析鉴定中药材质量指标的方法。
背景技术：
随着中药现代化发展及中药走向国际市场的需要，建立中药指纹图谱具有非常重要的意义。目前的中药指纹图谱多通过薄层色谱(TIC)和高效液相色谱(HPLC)建立，现有的色谱指纹图可以反映中药材的归属及质量，但无法确定色谱峰所对应的是什么物质，给质量控制带来困难。药材质量的优劣与药材中的化学成分组成及其含量有关，现有的色谱指纹图可以评价药材的质量，但只能从图谱的形状和各峰的相对含量来判断，而无法知道具体的化学成分，难以调控有效成分的含量大小，以保持稳定的质量。
发明内容
本发明的目的是为克服目前中药材质量分析和控制方法中所存在的缺陷，提出一种中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，该方法用现代的GC-MS方法建立的中药指纹图谱的质量标准，能直观准确地鉴别药材的真伪，评价药材质量，使定性定量控制中药加工过程成为可能。
本发明所提出的中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，包括下述步骤(1)提取待测中药材中所含的挥发油成分；(2)用气相色谱-质谱法对提取的挥发油进行分析测定，获取GC-MS总离子流色谱图；(3)分析GC-MS总离子流色谱图中每个色谱峰对应的化学成分的化学结构，并用面积归一法测定其相对含量；(4)综合考虑所测中药材在GC-MS总离子流色谱图中测定的含量不少于0.1％的成分以及文献中公开的该药材已知的有效成分，确定不多于15个的有限个该种中药材的主要有效成分作为其特征成分；(5)在所选择的特征成分中，每种成分选取一个特征离子，并获取该特征离子的EIC(Extract ions chromatogram)质量色谱图，从而得到该中药材各特征成分的多个特征离子的EIC质量色谱图；(6)将所获取的该中药材各特征成分的多个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)指纹图，即成为所述中药材的质量标准指纹图谱。
步骤(3)采用GC-MS气相色谱-质谱联用仪对提取的挥发油进行分析测定，由GC-MS气相色谱-质谱联用仪生成提取的挥发油的GC-MS总离子流色谱图。
在步骤(4)中所述的文献中公开的该药材已知的有效成分，是指已在现有文献公开的已经明确疗效的化学成分。现有的文献资料中已有许多关于中草药有效成分的研究报道，不同品种的草药的成分可以从《中药大辞典》、《常用中药成分与药理手册》、《中药现代化研究与应用手册》或相关科技的杂志中查阅到。如查当归有效成分查《常用中药成分与药理手册》(黄泰康主编，中国医药出版社，1994，824-854)，当归的有效成分蒿本内酯、丁烯基苯酞内酯等。如查草果有效成分查《常用中药成分与药理手册》(黄泰康主编，中国医药出版社，1994，1376-1377)，草果有效成分1，8-桉叶素(1，8-cineole)、α-蒎烯(α-pinene)、β-蒎烯(β-pinene)等。
在步骤4中，每种中药材确定的主要有效成分一般为8～12个，以兼顾有效性和可操作性。
上述步骤(5)和步骤(6)可通过发明人自编的多离子重建色谱的软件程序完成，该计算机程序包括下述步骤向GC-MS气相色谱-质谱联用仪的输入界面输入由步骤(5)选取的所述多个特征离子的质荷比的步骤；依次将输入的每个特征离子的提取离子流图从TIC图中得到，然后放置到寄存器R1中进行加和的步骤；将R1中的数据赋值给寄存器X，最后将X当中的数据用画图的命令显示在质谱数据分析软件的窗口1当中的步骤；如需要对显示的结果进行积分，则继续执行将寄存器X当中的数据进行积分，然后使用列表命令将结果显示在屏幕上的程序。
本发明所提出的中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，通过对中药材中的有效成份的提取和GC-MS分析，在对所获得的GC-MS总离子流(TIC)图中各色谱峰进行结构鉴定，确定有效的特征成份的基础上，构建提取多离子重建色谱(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)图，即中药材的质量标准指纹图谱。从而形成一种新的中药质量评价方法，该方法利于定量分析，量化评价指标，以建立质量标准。
本发明可达到的有益技术效果如下(1)所建立的提取多离子重建色谱(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)图，即中药材的质量标准指纹图谱，可反映该种中药材所含的主要物质群，用于鉴别药材的真伪，同时为定量控制各成分的含量打下基础；(2)所建立的提取多离子重建色谱(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)图，即中药材的质量标准指纹图谱，可更直观地反映出药材的质量，又便于定量分析，适于定量评价和控制药材的质量；(3)用所建立的提取多离子重建色谱(Extractmulti-ions chromatogram，EMIC)图，即中药材的质量标准指纹图谱，可通过自动积分，用面积归一法得到其相对含量，同时便于采用外标法测定其绝对含量。
(4)用所建立的提取多离子重建色谱(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)图，即中药材的质量标准指纹图谱，对中药材的质量进行评价的方法，可推广于中药深加工过程中的质量控制，量化控制中药产品的有效成分的含量，以得到质量恒定的产品。可通过在药材生产加工过程中测定各批次药材的含量，根据不同批次的含量差异，通过勾兑，调整特征成分的含量在标准范围内，达到定量控制主要成分的含量的目的，以保证药材质量的恒定，为中药深加工、质量控制提供科学依据。
图1是中药材“白豆蔻”挥发油的GC-MS TIC图谱；图2是中药材“白豆蔻”挥发油的GC-MS/EMIC指纹图谱；图3是中药材“广防己”挥发油的GC-MS TIC图谱；图4是中药材“广防己”挥发油的GC-MS/EMIC指纹图谱；图5是中药材“当归”挥发油的GC-MS TIC图谱；图6是中药材“当归”挥发油的GC-MS/EMIC指纹图谱。
具体实施例方式
实施例一中药材白豆蔻的质量标准指纹图谱的建立白豆蔻为姜科植物白豆蔻(Amomun kravank Pierre ex Gagnep)或爪哇白豆蔻(A.compactum Soland ex Maton)的干燥果实，又名多骨，壳蔻，白蔻，圆豆蔻，扣米，豆蔻等。白豆蔻生于气候温暖、潮湿、富含腐殖质的林下。分布于泰国、越南、柬埔寨等国，我国广东、云南有栽培。白豆蔻性温，味辛，归肺、脾、胃经。功能化湿行气，温中止吐，开胃消食。主治湿阻所滞，脾胃不和，脘腹胀满，不思饮食，湿温初起，胸闷不饥，胃寒呕吐，食积不消。
已知的白豆蔻的化学成分有1，8-桉叶素(1，8-cineole)、β-蒎烯(β-pinene)、α-蒎烯(α-pinene)、丁香烯(caryopellene)、龙脑乙酸酯(bornyl acetate)、α-松油醇(α-terpineol)、芳樟醇(linalool)等。
白豆蔻的质量标准指纹图谱建立的步骤如下(1)提取白豆蔻的挥发油(可采用水蒸汽蒸馏法、超临界CO2流体萃取法或溶剂提取法提取)。
(2)用气相色谱-质谱法对提取的挥发油进行分析测定，获取GC-MS总离子流色谱图(GC-MS TIC)，方法如下仪器采用美国Agilent公司产的Agilent 6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪；进行GC-MS分析
1.1 GC条件色谱柱HP-1(15m×0.2mm×0.33μm)弹性石英毛细管柱，柱温60℃恒温1min，程序升温6℃/min至250℃，保持15min。载气He，柱前压40kPa，分流比30∶1，进样量1μL。
1.2 MS条件EI离子源，电子能量70eV，扫描范围29～450u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度280℃，标准质谱图库Wiley275.L。
1.3分离与鉴定将提取的白豆蔻挥发油经气相色谱石英毛细管柱分离，质谱仪记录质谱图，得到GC-MSTIC图谱(如图1所示)。
(3)各色谱峰相应的质谱图经计算机谱库检索及人工解析确定其化学结构，并用面积归一化法测定其相对含量，测定的白豆蔻挥发油化学组成及其相对含量如下表(表1)表1 白豆蔻挥发油化学组成及其相对含量Table 1 The chemical components and their relative contents of the essential oil from Amomun kravakPierre ex Gagnep
(4)综合考虑所测中药材在GC-MS总离子流色谱图中测定的含量不少于0.1％的成分以及文献中公开的该药材已知的有效成分，确定该中药材的10个主要有效成分作为其特征成分，这10个白豆蔻挥发油特征成分的特征离子及其相对含量如下表(表2)表2 白豆蔻挥发油特征成分的特征离子及其相对含量Table 2 The chemical components and theirrelative contents of the essential oil from Amomun kravak Pierre exGagnep
(5)在所选择的10个特征成分中，每种成分选取一个特征离子，共10个离子作提取离子的EIC质量色谱图(Extractions chromatogram，EIC)；(6)将所获取的白豆蔻挥发油各特征成分的10个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱(EMIC)指纹图，即成为中药材白豆蔻的质量标准指纹图谱(如图2所示)。
上述步骤(5)和(6)通过自编的多离子重建色谱的软件程序完成，该计算机程序包括下述步骤向GC-MS气相色谱-质谱联用仪的输入界面输入所述10个特征离子的质荷比的步骤；依次将输入的每个特征离子的提取离子流图从TIC图中得到，然后放置到寄存器R1中进行加和的步骤；将R1中的数据赋值给寄存器X，最后将X当中的数据用画图的命令显示在质谱数据分析软件的窗口1当中的步骤；如需要对显示的结果进行积分，则继续执行将寄存器X当中的数据进行积分，然后使用列表命令将结果显示在屏幕上的程序。
实施例二中药材“广防己”的质量标准指纹图谱的建立广防己为马兜铃科植物广防己(Aristolochia fangchi Y.C.Wu ex L.D.Chow et S.M..Hwang)的干燥根，又名木防己、防己、大沙根、水防己、百解头、藤防己、墨蛇胆等。生于山坡密林或灌丛中，分布于广东、广西、云南等地。主产于广东、广西等地，以广东高要产质量好。广防己性寒，味苦、辛。归膀胱、肺经。功能祛风止痛，清热利水。用于治疗湿热身痛，风湿痹痛，下肢水肿，小便不利，脚气肿痛。
已知的广防己的化学成分有马兜铃酸(aristolochic acid)I、马兜铃内酰胺(aristololactam)、尿囊素(allantoin)、木兰花碱(magnoflorine)和β-谷甾醇(β-sitosterol)等。
“广防己”的质量标准指纹图谱建立的步骤如下(1)提取“广防己”的挥发油(可采用水蒸汽蒸馏法、超临界CO2流体萃取法或溶剂提取法提取)。
(2)用气相色谱-质谱法对提取的挥发油进行分析测定，获取GC-MS总离子流色谱图(GC-MS TIC)，方法如下仪器采用美国惠普公司HP6890GC/5973MS型气相色谱-质谱联用仪；进行GC-MS分析1.2 GC条件色谱柱SE-30(15m×0.2mm×0.33μm)弹性石英毛细管柱，柱温60℃， 恒温1min，程序升温6℃/min至250℃，保持15min。载气He，柱前压40kPa，分流比20∶1，进样量1μL。
1.2 MS条件EI离子源，电子能量70eV，扫描范围29～450u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC-MS接口温度280℃，标准质谱图库Wiley275.L。
1.3分离与鉴定将提取的“广防己”挥发油经气相色谱石英毛细管柱分离，质谱仪记录质谱图，得到GC-MS TIC图谱(如图3所示)。
(3)各色谱峰相应的质谱图经计算机谱库检索及人工解析确定其化学结构，并用面积归一化法测定其相对含量，测定的“广防己”挥发油化学组成及其相对含量如下表(表3)表3 广防己挥发油化学组成及其相对含量Table 1.The components of the volatile oil in Aristolochia fangchi Y.C.WuexL.D.Chou.et S.M.Hwang
(4)综合考虑所测中药材在GC-MS总离子流色谱图中测定的含量不少于0.1％的成分以及文献中公开的该药材已知的有效成分，确定该中药材的10个主要有效成分作为其特征成分，这10个“防广己”挥发油特征成分的特征离子及其相对含量如下表(表4)表4 广防己的特征成分及相对含量Table2.The components of the volatile oil in Aristolochia fangchi Y.C.WuexL.D.Chou.et S.M.Hwang
(5)在所选择的10个特征成分中，每种成分选取一个特征离子，共10个离子作提取离子的EIC质量色谱图(Extract ions chromatogram，EIC)；(6)将所获取的“防广己”挥发油各特征成分的10个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱指纹图(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)，即成为中药材“防广己”的质量标准指纹图谱(如图4所示)。
上述步骤(5)和(6)可通过如实施例一所述自编的多离子重建色谱的软件程序完成。
实施例三中药材当归的质量标准指纹图谱的建立中药材“当归”为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根，又名干归、马尾当归、秦归、马尾归、云归、西当归、岷当归等。主产于甘肃、云南；四川、陕西、湖北、贵州等地亦产。其中以甘肃岷县产量多，质量佳。
当归性温，味甘、辛、苦，归肝、心、脾经。功能补血，活血，调经止痛，润燥滑肠。主要用于治疗血虚诸证，月经不调，经闭，痛经，崩漏，虚寒腹痛，痿痹，肌肤麻木，肠燥便难，赤痢缓重，痈疽疮疡，跌扑损伤等。
已知当归的化学成分有蒿本内酯(ligustilide)、α-蒎烯(α-pinene)、罗勒烯(ocimine)、β-红没药烯(β-bisabolene)、洋川芎内酯(senkyunolide)、正丁基苯酞(n-butylphthalide)、亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide)等。
当归的质量标准指纹图谱建立的步骤如下(1)提取当归的挥发油(可采用水蒸汽蒸馏法、超临界CO2流体萃取法或溶剂浸提法提取)。
(2)用气相色谱-质谱法对提取的挥发油进行分析测定，获取GC-MS总离子流色谱图(GC-MS TIC)，方法如下仪器采用美国惠普公司产的HP6890GC/5739MS型气相色谱-质谱联用仪；进行GC-MS分析1.3 GC条件色谱柱SE-30(15m×0.2mm×0.33μm)弹性石英毛细管柱，柱温60℃，恒温lmin，程序升温6℃/min至250℃，保持15min。载气He，柱前压40kPa，分流比20∶1，进样量1μL。
1.2 MS条件EI离子源，电子能量70eV，扫描范围m/z 29～450amu，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC/MS接口温度280℃，标准质谱图库Wiley275.L。
1.3分离与鉴定将提取的当归挥发油经气相色谱石英毛细管柱分离，质谱仪记录质谱图，得到GC-MS TIC图谱(如图5所示)。
(3)各色谱峰相应的质谱图经计算机谱库检索及人工解析确定其化学结构，并用面积归一化法测定其相对含量，测定的当归挥发油化学组成及其相对含量如下表(表5)表5 当归挥发油化学组成及其相对含量Table 1 Chemical components and theirrelative intensity of the essential oil from Angelicasinensis(Oliv.)Diels
(4)综合考虑所测中药材在GC-MS总离子流色谱图中测定的含量不少于0.1％的成分以及文献中公开的该药材已知的有效成分，确定该中药材的11个主要有效成分作为其特征成分，这11个“当归”挥发油特征成分的特征离子及其相对含量如下表(表6)表6 当归挥发油的特征成分及其相对含量Table 2 The characteristic components and their relative percentage of the essential oil from Angelica sinensis(Oliv.)Diels
(5)在所选择的11个特征成分中，每种成分选取一个特征离子，共11个离子作提取离子的EIC质量色谱图(Extract ions chromatogram，EIC)；(6)将所获取的当归挥发油各特征成分的11个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱指纹图(Extract multi-ions chromatogram，EMIC)，即成为中药材当归的质量标准指纹图谱(如图6所示)。
上述步骤(5)和(6)通过自编的多离子重建色谱的软件程序完成，该计算机程序包括下述步骤向GC-MS气相色谱-质谱联用仪的输入界面输入所述11个特征离子的质荷比的步骤；依次将输入的每个特征离子的提取离子流图从TIC图中得到，然后放置到寄存器R1中进行加和的步骤；将R1中的数据赋值给寄存器X，最后将X当中的数据用画图的命令显示在质谱数据分析软件的窗口1当中的步骤；如需要对显示的结果进行积分，则继续执行将寄存器X当中的数据进行积分，然后使用列表命令将结果显示在屏幕上的程序。
权利要求
1.一种中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，包括下述步骤(1)提取待测中药材中所含的挥发油成分；(2)通过GC-MS气相色谱-质谱联用仪用气相色谱-质谱法对提取的挥发油进行分析测定，获取GC-MS总离子流色谱图；(3)分析GC-MS总离子流色谱图中每个色谱峰对应的化学成分的化学结构，并用面积归一法测定其相对含量；(4)综合考虑所测中药材在GC-MS总离子流色谱图中测定的含量不少于0.1％的成分以及文献中公开的该药材已知的有效成分，确定不多于15个的有限个该种中药材的主要有效成分作为其特征成分；(5)在所选择的特征成分中，每种成分选取一个特征离子，并获取该特征离子的EIC质量色谱图，从而得到该中药材各特征成分的多个特征离子的EIC质量色谱图；(6)将所获取的该中药材各特征成分的多个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱(EMIC)指纹图，即成为所述中药材的质量标准指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，其特征在于在步骤4中，每种中药材确定的主要有效成分为8～12个。
3.根据权利要求1所述的中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(5)和步骤(6)通过自编的多离子重建色谱的软件程序完成，该计算机程序包括下述步骤向GC-MS气相色谱-质谱联用仪的输入界面输入由步骤(5)选取的所述多个特征离子的质荷比的步骤；依次将输入的每个特征离子的提取离子流图从TIC图中得到，然后放置到寄存器R1中进行加和的步骤；将R1中的数据赋值给寄存器X，最后将X当中的数据用画图的命令显示在质谱数据分析软件的窗口1当中的步骤；如需要对显示的结果进行积分，则继续执行将寄存器X当中的数据进行积分，然后使用列表命令将结果显示在屏幕上的程序。
全文摘要
本发明提出一种中药材的质量标准指纹图谱的建立方法，该方法通过对中药材提取的挥发油进行气相色谱－质谱分析，获取其总离子流色谱图(GC－MS TIC)，再对GC－MS TIC图中各色谱峰进行结构分析，弄清各峰的化学成分，再依据该色谱图相对含量较高的成分和文献中公开的该药材已知的有效成分，确定该种中药材的主要有效成分作为其特征成分，每种成分选取一个特征离子，获取该特征离子的EIC质量色谱图，再将所获取的该中药材各特征成分的多个特征离子的EIC质量色谱建立在一张色谱图上，得到提取多离子重建色谱(EMIC)指纹图，即成为所述中药材的质量标准指纹图谱。在本发明的基础上可建立一种对中药材进行定量分析的评价指标和质量标准。
文档编号G01N33/15GK101071130SQ20071002857
公开日2007年11月14日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者吴惠勤, 黄晓兰, 林晓珊, 黄芳, 黄晓芬, 葛发欢, 朱志鑫 申请人:中国广州分析测试中心