专利名称：：一种蜂胶药材的鉴别方法及蜂胶药材产区的初步分类方法
技术领域：
：本发明涉及蜂胶药材的鉴别方法及蜂胶药材产区的初步分类方法，特别涉及一种用模式化的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱来鉴别蜂胶药材方法。
背景技术：
：蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物芽苞和树干处采集的树胶，混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等形成的一种具有芳香味的胶状固形物。蜂胶化学成分与蜂种和蜜蜂生活周围地区的植被有关，已知的蜂胶化学成分有上百种，如果用一、二个蜂胶的活性成分来说明蜂胶及其成方制剂的内在质量，具有一定的片面性，应当对它的物质群整体予以控制。所以，除了"微观分析"夕卜，还应用某种"宏观分析"方法，从整体上有效的表征中药质量。蜂胶是一种富含黄酮类物质纯天然蜂产品，杨树等植物分泌的树胶是蜂胶的原料，蜜蜂采集树胶后经制作形成了蜂胶。蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多种医疗保健功能，是一种具有广阔市场的保健品原料。2003年国内蜂胶年产量已达到300吨，2005年版中国药典已将蜂胶作为中药材加以收载。但社会上以次充好、以假当真的个案屡见不鲜，不但无法确定其产地，甚至出现了以树胶冒充蜂胶的现象。而目前对蜂胶的质量控制，主要是以白杨素、高良姜素等含量为指标(中国药典2005年版一部249页)。然而，由于蜂胶源于树胶，其成分也近似于树胶，因此，现行的药典方法及行业标准等均无法区分树胶与蜂胶，使得蜂胶质量控制难以实施，己显著影响了人们生活质量和蜂胶的出口创汇。因此需要应用模式指纹图谱技术等率先建立蜂胶质控平台，确保蜂胶质量稳定可控。
发明内容本发明的目的是通过建立一种区分蜂胶产区的模式指纹图谱应用技术，可很好地区分树胶与蜂胶，并初步辨别蜂胶的产地，明确其在医药卫生及食品化工方面的应用范围，从而显著提高蜂胶质控水平，确保其应用价值和经济效益。本发明的一种蜂胶药材的鉴别方法，包括如下步骤(1)、建立蜂胶的指纹图谱(a)供试品溶液的制备分别取多批蜂胶药材粉末，精密称定，置索氏提取器中，用丙酮索氏提取至提取液无色，提取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置容量瓶中，甲醇定容至刻度，为供试品溶液；(b)对照品溶液的制备分别精密称定芦丁、槲皮素、白杨素、高良姜素对照品适量，用流动相稀释，制成对照品溶液；(C)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为A:甲醇，B:酸水；采用梯度洗脱方式；流速1.0mL/min;检测波长283nm或256nm或365nm或360nm;柱温20-30。C。(d)测定分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法进行试验，以对照品为参照物，测定并记录色谱图，得到蜂胶HPLC指纹图谱(见附图l-图2)。(2)、以上述相同的方法测定杨树胶等假蜂胶的指纹图谱(见附图3)。(3)、所述蜂胶指纹图谱共有29个共有峰，与杨树胶的指纹图谱对比，从峰高及其大小排序的差别比较可以看出19号共有峰和21号共有峰的峰高及其大小排序等参数反映出杨树胶和蜂胶的差别，因此，19号共有峰(RT:66.61min)和21号共有峰(RT二78.37min)共同形成了树胶和蜂胶相互区别的特征峰。(4)、以上述相同的方法测定待测样品的指纹图谱。(5)、将待测蜂胶样品指纹图谱与蜂胶的指纹图谱对比，筛选符合蜂胶标准指纹图谱的蜂胶药材。上述步骤的第一步中，所述蜂胶供试品溶液的具体制备过程为分别取多种蜂胶药材粉末约lg，精密称定，置索氏提取器中，用丙酮100ml，索氏提取至提取液无色，提取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置100ml量瓶中，甲醇定容至刻度，为供试品溶液。所述色谱条件为色谱柱采用十八烷基硅垸键合硅胶为填料，流动相为A:甲醇，B:0.4%的磷酸水；采用梯度洗脱方式Omin—10min—20min—30min—35min—50min—60min—120min，甲醇35%—35%—45%—45%—50%—50%—55%—55%,0.4%的磷酸水65%—65%—55%—55%—50%—50%—45%—45%;流速l.OmL/min;检测波长283nm;柱温25°C。上述步骤第一步中所述对照品溶液每ml中含芦丁0.268mg、槲皮素O.1096mg、白杨素O.0296mg、高良姜素0.Q206mg。上述步骤第一步中所述蜂胶为26批我国不同产地所产的蜂胶。上述步骤第五步中(a)共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱不存在明显差别，也不存在独有峰，并有明显25号共有峰(白杨素RT=88.76min)的，重点鉴别图谱中的19号和21号共有峰，19号共有峰峰高值达不到第十大峰，21号共有峰峰高值达不到第三大峰为真蜂胶；而19号共有峰峰高值达到第四大峰，同时21号共有峰峰高值达到第一大峰者为杨树胶。(b)、共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱存在明显差别者，属于其他类树胶或其他假蜂胶。所述29个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3%，其中芦丁(11号共有峰)的平均相对保留时间RT为29.5min，相对标准偏差RSD为0.23%;槲皮素(16号共有峰)的平均相对保留时间RT为46.3min，相对标准偏差RSD为0.95%;白杨素(25号共有峰)的平均相对保留时间RT为88.8min，相对标准偏差RSD为1.6%，高良姜素(27号共有峰)的平均相对保留时间RT为98.0min，相对标准偏差RSD为2.0%。一种蜂胶药材产区的初步分类方法，包括如下步骤采用国家药监局推荐使用的MATLAB软件，对蜂胶HPLC指纹图谱进行分析比较，结果，26批蜂胶样品(毛胶)的相似度在61%-94%之间，其相似度的差异较大(见附图7)，因此，对26批蜂胶样品(毛胶)的HPLC指纹图谱采用主成分分析和相似度相结合方式分类，初步将26批蜂胶样品(毛胶)分为5类，每类的相似度均高于90%(见附图8-图12)。根据表1至表3的数据比较进行分析归纳，蜂胶和树胶HPLC指纹图谱的区别，体现在峰高这个参数上。以峰高为参数分析，将蜂胶划分为5类第1类是6号共有峰(RT=17.62min)为第1大峰，28号共有峰(RT二IOO.02min)为第2大峰；第2类是20号共有峰(RT=75.84min)为第2或1大峰，24号共有峰(RT=84.7min)为第19大峰，同时25号共有峰(白杨素RT=88.76min)达不到第3大峰；第3类是20号共有峰(RT二75.84min)为第1大峰，11号共有峰(RT=29.50min)达不到第11大峰，23号共有峰(RT=81.llmin)为第2大峰；第4类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1大峰，25号共有峰(白杨素RT=88.76min)为第3大峰；第5类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1或2大峰，25号共有峰(RT=88.76min)为第2、第1或4大峰。表l蜂胶共有峰保留时间表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2蜂胶共有峰高表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3蜂胶共有峰高大小排序表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注表1一表2中l表示有峰，但由于小没被积分到；表3中空白格表示有峰，但由于小没被积分到。表4峰高和相似度相结合的分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4中数字l，2,3，表示峰从强到弱。l表示最强峰，2表示次强峰，……本发明的原理是根据蜂胶中的黄酮类成分是其主要的活性成份之一，建立起蜂胶黄酮类成分的HPLC指纹图谱，来源于不同产地的蜂群采集的树胶不同，造成其色谱的整体面貌特征上的差异，可通过模式化来建立蜂胶类别。同时虽然蜂胶源于树胶，但经过蜜蜂的咀嚼，掺入其上颚腺分泌物和蜂蜡后，也可造成两者指纹图谱的差异，通过模式化来区分。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。药典用于测定白杨素和高良姜素的检测波长为256nm(中国药典2005年版一部249页)，文献中用于测定良姜素和高良姜素的检测波长为360nm(宋爱清等，中国养蜂，2001，52(3):10);用于测定槲皮素和山奈酚的检测波长为365nm(杜海燕等，中草药，2002，23(11):997);用于测定白杨素的检测波长为268mn(焦庆连等，中成药，2005，27(8):961)，但指纹图谱不是为测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。与文献和药典的检测波长相比，用283nm进行检测，出峰较多，反映的信息较完全，故采用283nm为检测波长。以下结合附图详细说明本发明图1对照品图谱。图2蜂胶HPLC指纹图谱图3假胶(树胶)指纹图谱图4同一供试品平行制备5份供试品溶液的重复性试验相似度评价叠加图图5精密度试验相似度评价叠加图图6稳定性试验相似度评价叠加726批蜂胶样品(毛胶)HPLC指纹图谱相似度评价叠加8第一类(赣l类)蜂胶样品相似度评价叠加图(图中1、2依次为江西样品2、江西样品3。)图9第二类(其他类)蜂胶样品相似度评价叠加图(图中1为云南样品，2为江西样品8)图IO第三类(赣2类)蜂胶样品相似度评价叠加图(图中1、2、3、4、5依次为江西样品1、江西样品4、江西样品5、江西样品6、江西样品7。)图11第四类(北方类)蜂胶样品相似度评价叠加图(图中1为山东样品1，2为内蒙古样品，3为山西样品，4为辽宁样品，5为吉林样品，6为山东样品2，7为青海样品，8为河北样品，9为东北样品。)图12第五类(鄂豫类)蜂胶样品相似度评价叠加图(图中1为河南样品1，2为河南样品2，3为甘肃样品，4为荆州样品，5为荆门样品，6为安徽样品，7为河南样品3，8为宜昌样品。)具体实施方式本发明的优选实施例如下1、仪器、试药与材料U仪器与材料德国DionexP680A型高效液相色谱仪(PM-100检测器、STH585柱温箱、P680HPLC泵、ASI-100自动进样器)，chromeleon色普工作站；8953Dietikon型电子分析天平(瑞士，精度0.lmg);AS2060B型超声仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)等。1.2试药芦丁对照品(080-9705)、槲皮素对照品(081-9003)、白杨素(111701-200501)、高良姜素(111699-200501)均有中国药品生物制品鉴定所提供，蜂胶(毛胶，由广州市宝生圆有限公司提供，经广州市蜂产品研究所卢占列鉴定，为蜂胶)。流动相所用甲醇为色谱醇，其他试剂如甲醇，磷酸等均为分析纯。2、方法(1)建立蜂胶的指纹图谱(a)、供试品溶液的制备分别取26批蜂胶药材-IO'C冷冻数天后用粉碎机粉碎取粉末约lg，精密称定，置索氏提取器中，用丙酮100ml,索氏提取至提取液无色，提取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置100ml量瓶中，甲醇定容至刻度，摇勾，即得为供试品溶液。(b)、对照品溶液的制备分别精密称定芦丁、槲皮素、白杨素、高良姜素对照品适量，用流动相稀释，制成对照品溶液，所述对照品溶液每ml中含丁0.268mg、槲皮素0.1096mg、白杨素0.0296mg、高良姜素0.0206mg。(C)、色谱条件为色谱柱采用十八垸基硅烷键合硅胶为填料，流动相为A:甲醇，B:0.4%的磷酸水;采用梯度洗脱方式Omin—lOmin—20min—30min—35min—50min—60min—120min，甲醇35%—35%—45%—45%—50%—50%—55%—55%,0.4%的磷酸水65%—65%—55%—55%—50%—50%—45%—45%;流速1.0mL/min;检测波长283nm;柱温25°C。(d)测定分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各IOUI，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法进行试验，以对照品为参照物，测定并记录色谱图，得到26批蜂胶HPLC指纹图谱。(2)、以上述相同的方法测定杨树胶等假蜂胶的指纹图谱。(3)、所述蜂胶指纹图谱共有29个共有峰，与杨树胶等假蜂胶的指纹图谱对比，从峰高及其大小排序的差别比较可以看出19号共有峰和21号共有峰的峰高及其大小排序等参数反映出杨树胶和蜂胶的差别，因此，19号共有峰(RT=66.61min)和21号共有峰(RT=78.37min)共同形成了树胶和蜂胶相互区别的特征峰。所述29个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3%，其中芦丁(11号共有峰)的平均相对保留时间RT为29.5min，相对标准偏差RSD为0.23%;槲皮素(16号共有峰)的平均相对保留时间RT为46.3min，相对标准偏差RSD为0.95%;白杨素(25号共有峰)的平均相对保留时间RT为88.8min，相对标准偏差RSD为1.6%，高良姜素(27号共有峰)的平均相对保留时间RT为98.0min，相对标准偏差RSD为2.0%。26批蜂胶药材保留时间统计结果见表(4)、以上述相同的方法测定待测样品的指纹图谱。(5)、将待测蜂胶样品指纹图谱与蜂胶的指纹图谱对比，筛选符合蜂胶标准指纹图谱的蜂胶药材，具体筛选过程如下(a)、共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱不存在明显差别，也不存在独有峰，并有明显25号共有峰(白杨素RT=88.76min)的，重点鉴别图谱中的19号和21号共有峰，19号共有峰峰高值达不到第十大峰，21号共有峰峰高值达不到第三大峰为真蜂胶；而19号共有峰峰高值达到第四大峰，同时21号共有峰峰高值达到第一大峰者为杨树胶。(b)、共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱存在明显差别者，属于其他类树胶或其他假蜂胶。3、指纹图谱重现性实验取同一份供试品(河南蜂胶药材)5份，按照供试品溶液的制备方法，平行制备5份供试品溶液，同法进行检测，5份供试品溶液测得的色谱指纹图谱直观观察，表明指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为0.9894、0.9956、0.9951、0.9969、0.9977，均大于0.95，并考察保留时间和峰面积的一致性，芦丁、槲皮素保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.89()(表5、图4)。表5重复性试验结果(n:=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>峰面积37.64038.94238.44237.54237.45638.00±0.651.724、指纹图谱精密度实验取同一份供试品(河南蜂胶药材)溶液，连续进样5次，用相似度计算，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为0.9937、0.9952、0.9973、0.9969、0.9959，满足相似度不小于0.950，并考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性，芦丁、槲皮素、白杨素、高良姜素保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.7%。(表6、图5)表6精密度试验结果(n=5)12345X±SD.RSD(%)芦出峰时间28.88828.45628.16228.16128.35228.404±0.2991.05丁峰面积32.66332.62632.70332.26132.31932.514±0.2080.64槲出峰时间45.53544.77244.39644.37344.80444.776±0.4691.05皮峰面积41.91542.03542.11841.56541.55641.838±0.2630.63素白出峰时间85.43584.14883.75083.87184.63184.367±0.6870.81杨素峰面积297.47297.22297.27293.56294.20295.949±1.9020.64高良出峰时间93.21791.62691.18191.38992.28991.940±0.8260.90姜峰面积39.06140.21340.40939.77638.99739.691±0.6471.63素5、指纹图谱稳定性实验取同一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、10h、14h不同时间点进行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为0.9922、0.9932、0.9886、0.9959、0.9951，满足相似度不小于0.950，并考察保留时间和峰面积的一致性，芦丁、槲皮素、白杨素、高良姜素保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.6%，表明在此时间内供试品溶液的成分是稳定的(表7、图6)。表7稳定性试验结果(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>以上实验显示，该测定方法稳定可靠。一种蜂胶药材产区的初步分类方法，包括如下步骤采用国家药监局推荐使用的MATLAB软件，对蜂胶HPLC指纹图谱进行分析比较，结果，26批蜂胶样品(毛胶)的相似度在61%-94%之间，其相似度的差异较大(见附图7)，因此，对26批蜂胶样品(毛胶)的HPLC指纹图谱采用主成分分析和相似度相结合方式分类，初步将26批蜂胶样品(毛胶)分为5类，每类的相似度均高于90%(见附图8-图12)。根据表1至表3的数据比较进行分析归纳，蜂胶和树胶HPLC指纹图谱的区别，体现在峰高这个参数上。以峰高为参数分析，将蜂胶划分为5类:第1类是6号共有峰(RT47.62min)为第1大峰，28号共有峰(RT=100.02min)为第2大峰；第2类是20号共有峰(RT:75.84min)为第2或1大峰，24号共有峰(RT二84.7min)为第19大峰，同时25号共有峰(白杨素RT=88.76min)达不到第3大峰；第3类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1大峰，11号共有峰(RT:29.50min)达不到第11大峰，23号共有峰(RT=81.llmin)为第2大峰；第4类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1大峰，25号共有峰(白杨素RT^8.76min)为第3大峰；第5类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1或2大峰，25号共有峰(RT二88.76min)为第2、第1或4大峰。权利要求1、一种蜂胶药材的鉴别方法，包括如下步骤(1)、建立蜂胶的指纹图谱(a)供试品溶液的制备分别取多批蜂胶药材粉末，精密称定，置索氏提取器中，用丙酮索氏提取至提取液无色，提取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置容量瓶中，甲醇定容至刻度，为供试品溶液；(b)对照品溶液的制备分别精密称定芦丁、槲皮素、白杨素、高良姜素对照品适量，用流动相稀释，制成对照品溶液；(c)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为A甲醇，B酸水；采用梯度洗脱方式；流速1.0mL/min；检测波长283nm或256nm或365nm或360nm；柱温20-30℃。(d)测定分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法进行试验，以对照品为参照物，测定并记录色谱图，得到蜂胶HPLC指纹图谱。(2)、以上述相同的方法测定杨树胶等假蜂胶的指纹图谱。(3)、所述蜂胶指纹图谱共有29个共有峰，与杨树胶等假蜂胶的指纹图谱对比，从峰高及其大小排序的差别比较可以看出19号共有峰和21号共有峰的峰高及其大小排序等参数反映出杨树胶和蜂胶的差别，因此，19号共有峰(RT＝66.61min)和21号共有峰(RT＝78.37min)共同形成了树胶和蜂胶相互区别的特征峰。(4)、以上述相同的方法测定待测样品的指纹图谱。(5)、将待测蜂胶样品指纹图谱与蜂胶的指纹图谱对比，筛选符合蜂胶标准指纹图谱的蜂胶药材。2、根据权利要求1所述的蜂胶药材的鉴别方法，其特征在于所述蜂胶供试品溶液的具体制备过程为分别取多批蜂胶药材粉末约lg，精密称定，置索氏提取器中，用丙酮100ml，索氏提取至提取液无色，提取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，置100ml量瓶中，甲醇定容至刻度，为供试品溶液。3、根据权利要求1所述的蜂胶药材的鉴别方法，其特征在于所述色谱条件为色谱柱采用十八烷基硅垸键合硅胶为填料，流动相为A:甲醇，B:0.4%的磷酸水；采用梯度洗脱方式Omin—10min—20min—30min—35min—50min—60min—120min，甲醇35%—35%—45%—45%—50%—50%—55%—55%，0.4%的磷酸水65%—65%—55%—55%—50%—50%—45%—45%;流速1.OmL/min;检测波长283nm;柱温25°C。4、根据权利要求1或2所述的蜂胶药材的鉴别方法，其特征在于(a)共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱不存在明显差别，也不存在独有峰，并有明显25号共有峰(白杨素ia^88.76min)的，重点鉴别图谱中的19号和21号共有峰，19号共有峰峰高值达不到第十大峰，21号共有峰峰高值达不到第三大峰为真蜂胶；而19号共有峰峰高值达到第四大峰，同时21号共有峰峰高值达到第一大峰者为杨树胶。(b)、共有峰保留时间与蜂胶指纹图谱存在明显差别者，属于其他类树胶或其他假蜂胶。5、根据权利要求1或2所述的蜂胶药材鉴别方法，其特征在于所述29个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3%，其中芦丁(11号共有峰)的平均相对保留时间RT为29.5min，相对标准偏差RSD为0.23%;槲皮素(16号共有峰)的平均相对保留时间RT为46.3min，相对标准偏差RSD为0.95%;白杨素(25号共有峰)的平均相对保留时间RT为88.8min，相对标准偏差RSD为1.6%，高良姜素(27号共有峰)的平均相对保留时间RT为98.0min，相对标准偏差RSD为2.0%。6、一种蜂胶药材产区的初步分类方法，包括如下步骤采用国家药监局推荐使用的MATLAB软件，对蜂胶HPLC指纹图谱进行分析比较，结果，26批蜂胶样品(毛胶)的相似度在61%-94%之间，其相似度的差异较大，因此，对26批蜂胶样品(毛胶)的HPLC指纹图谱采用主成分分析和相似度相结合方式分类，初步将26批蜂胶样品(毛胶)分为5类，每类的相似度均高于90%。以峰高为参数分析，将蜂胶划分为5类第1类是6号共有峰(RT:17.62min)为第1大峰，28号共有峰(RT=100.02min)为第2大峰；第2类是20号共有峰(RT=75.84min)为第2或1大峰，24号共有峰(RT=84.7min)为第19大峰，同时25号共有峰(白杨素RT=88.76min)达不到第3大峰;第3类是20号共有峰(RT二75.84min)为第1大峰，11号共有峰(RT=29.50min)达不到第11大峰，23号共有峰(RT=81.11min)为第2大峰；第4类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1大峰，25号共有峰(白杨素RT=88.76min)为第3大峰；第5类是20号共有峰(RT=75.84min)为第1或2大峰，25号共有峰(RT=88.76min)为第2、第1或4大峰。全文摘要本发明涉及一种蜂胶药材的鉴别方法及蜂胶药材产区的初步分类方法，首先制备供试品溶液，再配制对照品溶液，测定法是分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法进行试验，以对照品为参照物，测定并记录色谱图，建立蜂胶HPLC指纹图谱。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握蜂胶的真伪，可将其作为蜂胶质量控制及其真伪鉴别的指标之一。同时对不同产地的蜂胶进行了初步分类。文档编号G01N30/00GK101327224SQ200710028678公开日2008年12月24日申请日期2007年6月19日优先权日2007年6月19日发明者卢占列,励林,潘建国,王小平,郑尧隆申请人:广州市宝生园有限公司;广州中医药大学