专利名称：检测痕量H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的酶催化四丁基溴化铵共振散射光谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及H202的检测方法，特别是一种检测痕量H202的酶催化四丁基 溴化铵共振散射光谱法。
背景技术：
H202俗名双氧水,是一种具有强氧化性、腐蚀性的无色重液体,可作为消毒剂、脱氯剂、漂白剂、氧化剂，并供制火箭燃料、有机或无机过氧化物、泡沫塑 料和其他多孔物质等，被广泛应用于医药、国防、工业、农业、化工等领域中。 由于它是许多过氧化酶催化反应的产物，在食物科学、药物科学和环境科学等领域，建立一种灵敏快速简便检测H202的方法尤为重要。目前，测定&02的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、荧光法、化学发光法和毛细管电泳 等。在这些方法中，有的是灵敏度不高，有的是试剂不易获得，有的仪器复杂。
发明内容
本发明的目的是要为克服现有技术的不足，而公开一种试剂易得，灵敏度高，检测快速的检测痕量H202的酶催化——四丁基溴化铵共振散射光谱法。本发明的目的通过如下技术方案来实现本发明利用四丁基溴化铵(TBAB)缔合微粒共振散射光谱法检测H202， 主要在酸性条件下，利用HRP可以催化氏02并与过量的r反应生成V， 13—与 四丁基溴化铵(TBAB)等形成缔合物微粒(TBAB-I3) n，该缔合物微粒存在共 振散射效应。压02浓度在一定范围内与TBAB体系的共振散射光谱强度呈线性关系。据此建立了一种灵敏度高、选择性好、简便快速测定痕量H202的共振散射光谱新方法，其主要反应如下H202 -OH (1) OH +r -K)HT+ I2 (2)i2+ r -(3)n TBAB + + nlf~~ (TBAB-I3)n ( 4)具体检测方法包括如下步骤1.制备已知11202浓度的测试体系；在具塞刻度试管中加入HAc-NaAc缓
冲液，再在上述试管的溶液中分别加入KI、 HRP、分别加入已知浓度的H202， 摇匀，将摇匀后的溶液置于热水浴锅中，然后再加入TBAB，用二次蒸馏水稀释定容，摇匀，放置作为已知11202浓度的测试体系；2. 用步骤l的方法，但不加&02，制备试剂空白对照体系；3. 用荧光光度计同歩扫描得到体系的共振散射光谱，在468nm处测定各体系的共振散射强度I柳nm和试剂空白I。，计算Al柳r^I柳nm- I()值；4. 依照已知浓度的测试体系的AI与11202浓度的对应关系作工作曲线；5. 依照步骤1的方法制备检测体系，其中加入的&02为未知浓度的被测 物，求得被测物的AI;6. 再根据步骤4的曲线，计算出被测物中的H202浓度。上述步骤1所加入的HAc-NaAc缓冲液的pH值为3.6 5.6，体积为0.1 0.6 mL，加入的KI体积为0.1-0.3mL，浓度为0.4mol/L;加入的HRP体积为 0.08-0.2mL，浓度为0.2yg/mL;所加入的H202为一定量的已知浓度或试剂空 白，或含有未知H202浓度的被测物，水浴温度20 4(TC，放置时间10 50min， 加入的TBAB体积0.2~0.4ml，浓度0.2mol/L。本发明的优点在于 (O设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；(2) 试剂易得，成本低廉；(3) 底物碘化钾无毒；(4) 灵敏度高，检出限为43.7nmol/L;(5) 快速，有较好的应用价值。
图l为本发明实施例TBAB体系的共振散射光谱图， 其中曲线a.pH4.6-0.02M KI-8 X l(r3ng/ mL HRP -OM H202- 0.024M TBAB;b. pH4.6- 0.02M KI-8X 10 g/ mLHRP -8.06X 1(T7M H202- O据M TBAB;c. pH4.6- 0.02M KI-8 X 10-3吗/ mL HRP -2.16 X 1(T6M H202- 0.024M TBAB;d. pH4.6- 0.02M KI- 8 X 10 g/ mL HRP -4.32 X 10-6M H202- O据M TBAB;e. pH4.6- 0.02M KI- 8 X 10-W mL HRP-8.06 X 10-6M H202- 0.024M TBAB 。4
图2为本发明实施例TBAB体系紫外可见吸收光谱图其中曲线a,pH4.6-0.02M KI-8 X 10-3吗/ mL HRP -OM H202- 0.024M TBAB;b. pH4.6誦0.02M KI-8 X 10-3吗/ mL HRP -8.06 X 10-7M H202- 0.024M TBAB;c. pH4.6- 0.02M KI-8 X 10-3吗/ mL HRP -2.16X10-6M H202- 0.024M TBAB;d. pH4.6- 0.02M KI- 8 X 10.3吗/ mL HRP -4.32 X 10.6M H202- 0.024M TBAB;e. pH4.6- 0.02M KI- 8 X 10.3吗/ mL HRP-8.06 X 10-6M H202- 0.024M TBAB。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明内容作进一步的阐述，所述实施例描述了 在弱酸性的HAC-NaAC缓冲液中，当有H202存在时，HRP催化H202产 生 OH， OH氧化I—生成I2，过量的I—与I2结合形成I3—，而TBA+与13—结合形 成(TBA-l3)n缔合微粒，产生共振散射。据此建立间接测定过氧化氢的共振散射 光谱分析方法。其主要反应如前所述一种四丁基溴化铵共振散射光谱法检测痕量H202的方法，包括如下步骤1、 在5支5 mL具塞刻度试管中，分别加入pH值为4.6，体积为0.3ml的 HAc-NaAc缓冲液，0.2mL 0.04mol/L的KI，然后再分别加入0.8~0.02mL 0.2|ig/ mL的HRP，再分别加入Omol/L、 8.06X 10-7mol/L、 2.16X 10-6mol/L、 4.32X l(T6mol/L、 8.06X10—6mol/L的&02，摇匀，放入40。C水浴锅中，放置30分钟， 然后分别再加入0.3mL 0.2 mol/LTBAB，用二次蒸馏水稀释定容至2.5mL，摇匀， 放置5分钟，得到已知H202浓度的被测体系和试剂空白体系-，2、 将上述各溶液用Cary Eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)分别同步 扫描得到体系的共振散射光谱(见图l)，在468nm处测定各体系的共振散射强度1468nm禾口试齐U空白10，计算Al468nm二l468nm 一 Io值；3、 依照已知被测浓度的Al468^与H202的浓度作工作曲线；4、 用步骤l的方法制备检测体系，其中加入的是含未知浓度11202被测物，按步骤2的方法，求得被测物的AI为5.32;5、 再根据步骤3的工作曲线，计算出被测物所含H202的浓度为1.27X10—7 mol/L o实验表明，在未加入H202之前，I- H202-TBAB体系的同步散射光谱较弱(见 图l)，当有H202存在时，体系的同步散射有所增强，随着浓度的增加，共振散 射强度也逐渐增大，并且，H2O2的浓度在0.864 86.4X10-7mol/L范围内，H202 的浓度与共振散射强度呈良好的线性关系，线性方程为AI468nm=2.88 X 10—7c+1.66。在320nm、 468nm、 550nm出现同步散射峰，在468nm处的共振散 射强度较大，所以本发明选取468nm进行测定。
权利要求
1.检测痕量H2O2的酶催化四丁基溴化铵共振散射光谱法，其特征是测定方法包括步骤如下(1)制备已知H2O2浓度的测试体系，在具塞刻度试管中加入HAc-NaAc缓冲液，再分别加入KI、HRP和已知不同浓度的H2O2，摇匀，将摇匀后的溶液置于热水浴锅中，然后再加入TBAB，用二次蒸馏水稀释定容，得到已知H2O2浓度的测试体系；(2)用步骤(1)的方法，制备试剂空白对照体系；(3)用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，在468nm波长处测定各体系的共振散射强度I468nm和试剂空白I0，计算ΔI468nm＝I468nm-I0值；(4)依照已知浓度的测试体系的ΔI与H2O2浓度的对应关系作工作曲线；(5)依照步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的H2O2为未知浓度的被测物，按步骤(3)的方法求得被测物的ΔI；(6)再根据步骤(4)的工作曲线，计算出被测物的H2O2浓度。
2. 如权利要求1所述的检测痕量H202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是步骤(1)所述的HAc-NaAc缓冲液的pH值为3.6 5.6，体积 为0.1 0.6mL。
3. 如权利要求1所述的检测痕量H202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是步骤(1)所述的加入的KI体积为0.1-0.3mL，浓度为0.2mol/L。
4. 如权利要求1所述的检测痕量11202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是步骤(1)所述的HRP体积为0.08-0.2mL，浓度为0.2pg/mL。
5. 如权利要求1所述的检测痕量11202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是步骤(1)所述的水浴温度20-40°C，放置时间10-50min。
6. 如权利要求1所述的检测痕量11202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是步骤(1)所述的TBAB体积0.2-0.4ml，浓度0.2mol/L。
7. 如权利要求1所述的检测痕量H202的酶催化四丁基溴化铵共振散射光 谱法，其特征是检出H202的浓度范围为0.864 86.4Xl(T7mol/mL。
全文摘要
本发明公开了检测痕量H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的酶催化四丁基溴化铵共振散射光谱法。主要特征是在酸性条件下，利用辣根过氧化物酶(HRP)可以催化H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>并与过量的I<sup>-</sup>反应生成I<sub>3</sub><sup>-</sup>，I<sub>3</sub><sup>-</sup>与四丁基溴化铵(TBA)等形成缔合物微粒(TBA-I<sub>3</sub>)<sub>n</sub>，该缔合物微粒存在共振散射效应，H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>浓度在一定范围内与TBA体系的共振散射强度呈良好的线性关系，据此而建立的灵敏度高，选择性好，简便快速的检测痕量H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>方法。本发明的优点在于设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；试剂易得，成本低廉；底物碘化钾无毒；灵敏度高，检出限为43.7nmol/l；快速，反应只需要35分钟，有较好的应用价值。
文档编号G01N33/541GK101158682SQ20071005060
公开日2008年4月9日 申请日期2007年11月19日 优先权日2007年11月19日
发明者蒋治良, 纪 马 申请人:广西师范大学