专利名称：检测b因子的免疫共振散射光谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及B因子的检测方法，具体地说是检测B因子的免疫共振散射光谱法。
背景技术：
-B因子(BF)，又称C3激活剂前体(C3PA)，是补体旁路活化途径中的一个重 要成分。属P2球蛋白，分子量10万D，仅有一条多肽链，富含甘氨酸，对热 不稳定，5(TC， 30分钟即被灭活。B因子在D作用下裂解成抗原性不一的a与 b两个片段。B因子必须与C3b等和Mgh存在下结合成C3b.B后，才受D作用释放出Ba，形成C3"Bb，该复合物具有C3转化酶活性，作用于Q生成更多C3b，在有P因子条件下形成(Qb)nBb P，即为替代途径中的Cs转化酶。B因子以及其它补体成分的代谢率很高，正常人血浆内的补体每天约有1/2 更新。合成率与血浆中补体水平明显相关，血浆补体值反映了合成和分解之间 的平衡。在炎症时合成率增加，使补体值增高，而当某些疾病补体利用增加时， 可使补体降低至正常范围以下。临床表明患肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肝病、B因子降低，妊娠高血压 综合症、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进症患者的B因子水平高于正常水平。因此， 人体血浆中B因子的测定对于了解旁路系统功能、肾小球肾炎的变化及分类、 肝病、恶性肿瘤等皆有较大的价值。目前B因子的检测方法有免疫化学法(包括单向琼脂扩散法和火箭电泳法) 和溶血法，双抗体夹心ELISA。其中，经典的免疫沉淀法(单向扩散、火箭电泳 等)可以检测B丙子的含量，但单向扩散法灵敏度不高，精确性、重现性较差、 流程太长；火箭电泳法操作复杂；溶血法则常用于测定B因子的活性；双抗体 夹心ELISA法避免了对特异件抗体的标记，但增加了操作步骤，并且需要使用 抗第2种动物的酶标抗体，试剂成本较高，所用的酶底物常为苯胺类、苯酚类 还原性染料，稳定性较差，见光或空气极易被氧化，更为不足的是苯胺类底物 具有致癌作用，而且测定过程包括包被、孵育、洗涤、免疫反应、显色等步骤， 耗时很长，至少需要24小时，操作比较繁琐。
近年来，还有人采用免疫透射比浊法测定B因子，虽简便快速，但灵敏度不高。此外，还有研究者用表面等离子体共振的B因子传感器测定B因子，虽 检测下限低，但操作复杂；还有采用压电免疫传感器测定B因子，该传感器灵 敏度高，选择性和重现性均好，但操作流程长而且复杂。本发明免疫共振散射 光谱法检测B因子尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是要为克服现有技术的不足，而公开一种简便、快速、且灵 敏度高的免疫共振散射光谱体外检测B因子的方法。本发明方法的原理是免疫复合物的共振散射效应当血清中的B因子与特异性羊抗人B因子抗体相结合后，形成不溶性免疫复合物，此复合物具有共振 散射效果，在PEG的作用下，该复合物进一步聚集，散射强度明显增强。共振 散射强度大小反映了血清中B因子含量，B因子含量可由校准血清所作的B因 子浓度——共振散射校正值曲线算出。本发明检测B因子的免疫共振散射光谱法包括以下步骤1. 制备已知B因子浓度的测试体系，在具塞刻度试管中依次加入一定pH 值的Na2HP04- NaH2P04缓冲溶液(PBS)、 一定量的羊抗人B因子溶液， 一定 已知浓度的B因子溶液，摇匀，再加入一定量的PEG6000溶液，加入二次蒸馏 水定容，充分摇匀，具塞试管置于35 37'C水浴反应5 20分钟；2. 依据步骤l的方法，制备试剂空白对照体系；3. 将上述体系所得溶液分别倒入石英比色皿中，置于荧光分光光度计上在入ex—人em二O条件下，同步扫描获得体系的共振散射光谱，同时测定390 420nm波长处的同步共振散射强度I，以不加B因子抗原作为试剂空白，测定 390 420nm波长处的共振散射强度，即空白值U;4. 根据测定结果，计算共振散射校正值AI (AI二I一Ib)，以加入的B因子 抗原浓度c为横坐标，AI为纵坐标，绘制工作曲线；5. 依照步骤l的方法制备检测体系，其中加入的是未知B因子抗原浓度的 被测物，按步骤3、 4的方法，求被测物的AI;6. 根据工作曲线，即可计算出某检测样品中B因子抗原在一定线性范围内
的浓度。步骤1所述的具塞试管为5mL的具塞试管，依次加入的Na2HP04-NaH2P04 缓冲溶液，其pH值为7.0 7.4，体积为0.30 0.80mL，加入的羊抗人B因子(稀 释比为l: 20 1: 30)溶液为50pL~300|iL，加入的己知的B因子抗原浓度为 0.04 14.0 pg/mL，加入的PEG6000浓度为15~30 %，体积为0.30~1.00 mL，加 入二次蒸馏水定容至3ml;所述的水浴温度为35 37 °C，水浴反应时间为5 20min;步骤3所述的同步共振散射强度的最佳测定波长为400 nm;步骤4所述的测定B因子的线性范围为0.04 14.0 pg/mL。本发明与现有的方法相比，本方法将免疫反应与共振散射光谱技术相结合， 方法灵敏度高，检测限低，可达到pg/mL水平，用于检测低浓度的B因子所需 样品用量少，操作简便，测定耗时短，并且所用试剂无毒安全、成本低廉。
图1为本发明实施例1的B因子免疫复合体系的共振散射光谱图；图2为本发明实施例1的B因子的工作曲线；图3为本发明实施例2的B因子免疫复合体系的共振散射光谱图；图4为本发明实施例2的B因子免疫复合体系的紫外可见吸收光谱图；图5为B因子、B因子及羊抗人B因子与B因子生成的免疫复合微粒体系的共振散射图。具体实施例下面结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述下列所述实施例描述了免疫复合物的共振散射效应当血清中的B因子与特异性羊抗人B因子抗体相结合后，形成不溶性免疫复合物，此复合物具有共 振散射效果，在PEG的作用下，该复合物进一步聚集，散射强度明显增强。共 振散射强度大小反映了血清中B因子含量，B因子含量可由校准血清所作的B 因子浓度一共振散射校正值曲线算出。实施例1:1.制备已知B因子浓度的测试体系，在5mL的具塞比色管中依次分别加入 pH7.2的Na2HP04-NaH2P04缓冲溶液(PBS) 0.40mL、羊抗人B因子溶液(稀 释比l: 20，上海北加试剂有限公司)200)iL， 12pg/mL的B因子抗原(上海北 加试剂有限公司)20， 140， 260， 380， 500， 620， 740|uL，摇匀后再加入15% 的PEG6000溶液0.40mL，加入二次蒸馏水定容至3.0 mL，摇匀，具塞试管置于
37'C水浴反应5分钟，取出流水冷却；2. 依照步骤l的方法，但不加B因子抗原，制备试剂空白对照体系；3. 将上述体系所得溶液分别倒入石英比色皿中，置于Cary Eclipse荧光分 光光度计(美国Varian公司)上在A ex—人em=0条件下，同步扫描获得体系的共 振散射光谱(如图l所示)，同时测定400nm波长处的共振散射强度I，以不加 B因子抗原作为试剂空白，测得的共振散射强度为空白值Ib;4. 根据以上测定结果，分别计算共振散射校正值AI (Al=I—Ib)，以加入 的B因子抗原浓度c为横坐标，AI为纵坐标，绘制即得工作曲线A》31.84 c +5.05， (n=8， R=0.9901)(如图2所示);5. 按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是12pg/mL B因子抗原 标准品400jLiL，平均测定三次，测得的AI为56， 58， 58;6. 根据工作曲线，求出步骤5的测定体系的B因子抗原浓度平均值为1.64 pg/mL，与实际加入的B因子抗原浓度一致，相对标准偏差为2.45%。图1中，曲线1至6的B因子浓度依次为0， 0.08，0.56， 1.04， 2.00，2.96|ig/mL， 表明羊抗人B因子与B因子生成的免疫复合微粒在390 420nm处的散射信号 随着B因子浓度的增加呈线性增加。
实施例2:1. 在5mL的具塞比色管中分别依次加入pH7.2的Na2HP04-NaH2P04缓冲 溶液0.40mL、羊抗人B因子溶液(稀释比l:20，上海北加试剂有限公司)200^iL， 12吗/mL的B因子抗原(上海北加试剂有限公司)50， 100， 200， 400， 800pL， 摇匀，再加入15。/。的PEG6000溶液0.50mL，加入二次蒸馏水定容至3.0 mL;2. 步骤1的具塞试管置于37t:水浴，反应5分钟后，取出流水冷却；3. 将步骤2所得溶液倒入石英比色皿中，置于Cary Eclipse荧光分光光度 计(美国Varian公司)上在入ex—入加二O条件下，同步扫描获得体系的共振散射 光谱，同时测定400nm波长处的共振散射强度I;4. 以不加B因子抗原作为试剂空白，测得的共振散射强度为空白值Ib;5. 根据以上测定结果，计算共振散射校正值AI (Al二I一Ib)，以加入的B 因子抗原浓度c为横坐标，AI为纵坐标，绘制即得工作曲线A^ 26.58c + 4.15
(n=6， R=0.9950);6.按步骤1的方法制备检测体系，其中加入的是12jig/mLB因子抗原标准 品500nL，平均测定3次，测得AI为56、 58、 58，根据工作曲线，求得样品B 因子浓度平均值为1.9 吗/mL。图3、图4中，曲线1至6的B因子浓度依次为0， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2jxg /mL。图4表明B因子免疫复合体系，其在278 nm处有强吸收峰，且强度随着 体系B因子浓度的增加，免疫复合体系的吸光度增大。图5中，曲线l-6分别为h pH 7.2 Na2HP04-NaH2P04+0.20 mL羊抗人B因子(1:20); 2: pH 7.2 Na2HP04- NaH2P04 + 0.20 mL羊抗人B因子(1:20) + 2.5% PEG6000;3: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.56 P g/mL B因子； 4: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.56 U g/mL B因子+ 2.5% PEG6000; 5: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.20 mL羊抗人B因子(l :20) + 0.56 P g/mL B 因子；6: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.20 mL羊抗人B因子(l :20) + 0.56 u g/mL B 因子+2.5%PEG6000。该图表明，羊抗人B因子、B因子及羊抗人B因子与B因子生成的免疫复 合微粒的散射信号较弱，在PEG存在时，共振散射强度羊抗人B因子、B因子 及羊抗人B因子与B因子生成的免疫复合纳米的散射信号增强不大，但羊抗人 B因子与B因子生成的免疫复合纳米的散射信号明显增强，在400nm附近存在 强共振散射峰，表明B因子与特异性羊抗人B因子抗体相结合后，形成不溶性 免疫复合物，此复合物具有共振散射效果，在PEG的存在作用下，该复合物进 一步聚集，散射强度明显增强。
权利要求
1.一种检测B因子的免疫共振散射光谱法，其特征是该方法包括如下步骤(1)制备已知B因子浓度的测试体系在具塞刻度试管中依次加入一定pH值的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液、一定量的羊抗人B因子溶液，一定已知浓度的B因子溶液，摇匀，再加入一定量的PEG6000溶液，加入二次蒸馏水定容后，在温水中水浴反应；(2)依据步骤1的方法制备空白对照体系；(3)将(1)、(2)所得溶液分别移至石英比色皿中，置于荧光分光光度计上，同步扫描获得体系的共振散射光谱，在390-420nm波长处测定同步共振散射强度I和空白值I0；(4)根据测定结果计算出共振散射校正值ΔI，以加入的B因子抗原浓度为横坐标，ΔI为纵坐标，绘制工作曲线；(5)依照步骤1的方法制备检测体系，其中加入的是未知B因子抗原浓度的被测物，按步骤(3)、(4)的方法，求被测物的ΔI；(6)根据工作曲线，计算出被测物中B因子抗原在一定线性范围内的浓度。
2. 如权利要求1所述的检测B因子的免疫共振散射光谱法，其特征是步 骤(1)所述的Na2HP04- NaH2P04缓冲溶液的pH值为7.0-7.4，体积为 0.30-0.80mL，加入的羊抗人B因子，溶液稀释比为1: 20-1: 30，体积50 juL 300 pL，加入的B因子抗原浓度为0.04 14.0吗/mL，加入的PEG6000浓度为15 30 %，体积为0.30 1.00mL，所述的定容体积为3ml。
3. 如权利要求1所述的检测B因子的免疫共振散射光谱法，其特征是步 骤(2)所述的水浴温度35 37'C，水浴反应时间为5 20分钟。
4. 如权利要求1所述的检测B因子的免疫共振散射光谱法，其特征是步 骤(2)所述的同步共振散射强度的最佳测定波长为400nm。
5. 如权利要求1所述的检测B因子的免疫共振散射光谱法，其特征是测 定B因子抗原浓度的线性范围为0.04~14.0 pg/mL。
全文摘要
本发明公开了用检测B因子的免疫共振散射光谱法，本发明利用免疫复合物的共振散射效应来检测，当血清中的B因子与特异性羊抗人B因子抗体结合后，形成不溶性的复合物，此复合物具有共振散射效果，在PEG的作用下，该复合物聚集，散射强度明显增强。B因子含量即可由校准血清所作的B因子浓度——共振散射校正值曲线算出。本发明的优点在于与现有的方法相比，本方法将免疫反应与共振散射光谱技术相结合，方法灵敏度高，检测限低，可达到μg/ml水平，用于检测低浓度的B因子所需样品用量少，操作简便，测定耗时短，并且所用试剂无毒安全，成本低廉。
文档编号G01N33/68GK101158689SQ20071005060
公开日2008年4月9日 申请日期2007年11月19日 优先权日2007年11月19日
发明者李纪顺, 蒋治良 申请人:广西师范大学