专利名称：一种奶牛亚临床酮病诊断试纸的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医临床检验学领域，所检测物质为奶牛乳汁中的D-(-)-3-羟基丁酸及其盐，适用于集约化奶牛养殖场奶牛亚临床酮病的监测。
背景技术：
酮体是脂肪酸代谢过程中的产物，酮体的生产量的大小反映了脂 肪氧化代谢的强度。正常情况下，血液中酮体浓度相对恒定，这是因 为肝中产生的酮体可在肝外组织迅速利用，尤其是肾脏和心肌具有较 强的使乙酰乙酸氧化的酶系，其次是大脑。肌肉组织也是利用酮体的 重要组织。对于不能利用脂肪酸的脑组织来说，利用酮体作为能源具 有重要意义。但在某些生理或病理情况下，如因饥饿将糖原耗尽后， 食物中糖供给不足时，或因患病而缺乏氧化糖的能力时，脂肪动员加 速，肝脏中酮体生成增加，超过了肝外组织氧化的能力。又因糖代谢 减少，丙酮酸缺乏，可与乙酰辅酶A縮合成柠檬酸的草酰乙酸减少， 更减少酮体的去路使酮体积聚于血内成为酮血症。血内酮体过多，由 尿排出，又形成酮尿。酮体为酸性物质，若超过血液的缓冲能力时， 就可引起酮症酸中毒。奶牛养殖业已成为我国畜牧业的支柱产业。酮病是奶牛主要的群 发性高发性疾病之一，我国奶牛酮病发病率为15-30%，且呈逐年上
升趋势。大量研究表明，奶牛酮病与围产期奶牛的许多疾病有关，如 胎衣不下、子宫内膜炎、皱胃变位、生产瘫痪等。按是否出现临床症 状可将酮病分为临床酮病和亚临床酮病。临床酮病具有典型的临床症 状，如食欲骤减、呼出气体有酮味、产奶量下降或出现神经症状等，不难做出诊断。亚临床酮病无明显的临床症状，发病率10-20倍于临 床酮病，且容易引发临床酮病，给奶牛养殖业造成的经济损失尤为巨 大。奶牛亚临床酮病的诊断主要依靠检测体内酮体含量，其中乙酰乙 酸占20%; D-(-)-3-羟丁酸占78。/。；丙酮占2%。酮体的三种成分中^ 酰乙酸含量较低，易挥发，且奶牛酮病后期乙酰乙酸的含量反而降低， 与酮病的发生和发展并不是正相关；丙酮含量最低，性状不是很稳定； D-(-)-3-羟丁酸占含量最高且与疾病的发生发展成正相关；故丙酮和 乙酰乙酸都不适合于作为奶牛亚临床酮病的早期诊断指标，以 D-(-)-3-羟丁酸作为奶牛亚临床酮病的早期诊断指标最为合理。只有 实施有效的早期诊断，从而进行合理的防治，方能减少由此病所导致 的巨大损失。目前，奶牛酮体的定量检测方法有水杨醛比色法、改良式水杨醛 比色法、高效液相色谱法、D-(-)-3-羟丁酸酶法分析试剂盒、气相色 谱法，存在的主要缺点为需要昂贵的仪器和标准化的实验室、操作繁 琐、检测成本高、花费时间长；定性检测方法有酮粉法，存在的主要 缺点为操作过程复杂、敏感性和特异性较低。因此，这些方法均不适 合集约化奶牛养殖场用于对奶牛的亚临床酮病的监测
发明内容
本发明提供一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，以解决对奶牛的亚临 床酮病的检测过程存在的操作繁琐、检测成本高、花费时间长、敏感 性和特异性较低的问题。本发明采取的技术方案是包括支持垫和固定于其上的测试垫， 其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂脱氢酶D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 50mg 画mg;辅酶:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg 500mg; 黄递酶，35U/mg~45U/mg， 500 1000mg; 显色剂NBT， 100mg 200mg; TrisBase，分子量121.14, 1.21g; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383， 4 6g; 蒸馏水100ml。本发明的技术方案中测试垫还包括氯化钠，300mg 600mg。 本发明试纸的制备方法是按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取 薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37"C恒温 干燥箱内悬挂干燥45分钟。本发明试纸的制备方法还包括将滤纸裁剪成3x3cm的纸片， 粘贴于3x6cm聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密 闭保存。本发明的反应原理D-(-)-羟丁酸脱氢酶D-(-)-3-hydroxybutyrate+ NAD+ -acetoacetate + NADH + fT黄递酶NADH + NBT- NAD十+fo醒zan依据上述反应原理，制作干燥试纸条。D-(-)-3-羟丁酸或其盐在 D一(+3-羟丁酸脱氢酶的催化下与NAD反应生成乙酰乙酸和NADH， 最适PH为8.5，生成的NADH在黄递酶的催化下与NBT作用生成 蓝黑色的不溶于水的甲月替(formazan)，依据生成的显色物质的颜 色强度制作标准比色卡，半定量的测定D-(-)-3-羟丁酸或其盐的含量。 NBT是一种染色强度较高的染料，目前已大量的应用于免疫组 织化学、细胞活性测定等，对光不敏感，故将其作为制作干燥试纸条 的显色剂。D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶是专一性催化D-(-)-3-羟丁酸的酶。 黄递酶起传递氢离子的作用，比较其它同类的酶，该酶性质稳定，对 光敏感性较低，符合试纸条制作要求。D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶和黄递 酶目前均可以大量表达纯化，容易买到。海藻糖是由特殊双糖分子构 成的非还原性糖，特性非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶 劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效的保护酶蛋白的分子 结构不被破坏，从而维持酶蛋白的活性，可有效保证试纸的检测和保 存稳定性，否则难以商品化推广应用。奶牛乳汁中的乳酸脱氢酶可竞 争性地与试纸所含NAD发生反应，加入草酸可去除这一干扰因素，
提高检测结果的准确性。配制的不同浓度的D-(-)-3-羟丁酸标准溶液，滴加数滴于制作好 的试纸条上，依据反应后试纸条产生不同的颜色，制作试纸条标准比 色卡。在实际使用时，将与被检乳样反应后的试纸条与标准比色卡对 照，从而得出检测结果。所用的试纸可用普通的滤纸，也可用其它适 合的吸湿膜等。试纸条的支垫部分可用聚乙烯薄板，也可用其它适合 的硬质材料，但所用材料要无吸湿性。本发明使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的奶 牛亚临床酮病诊断试纸，试纸用于对奶牛乳汁中D-(-)-3-羟丁酸和 D-(-)-3-羟丁酸盐的检测。
附图是本发明的结构示意图。
具体实施方式
试剂D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，厂家Asahi kasei pharma corporation,日本；显色剂为NBT，分子式QoHsolSbOs . 2C1，分子量为817.60 817.65,别名硝基四氮唑蓝、硝基蓝四氮唑、四唑氮蓝、氮蓝四唑、 硝基蓝四唑、四唑硝基蓝、硝基氯化四氮唑蓝、氯化硝基四氮唑蓝； 厂家sigma;TrisBase， 分子量121.14， 厂家sigma;黄递酶，35U/mg~45U/mg，厂家Asahi kasei pharma corporation,
日本；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，厂家sigma; 草酸，分子量126， 126mg，北京化工厂；海藻糖，分子量383 383.3， 4 6g，厂家北京舒伯伟化工仪器有限责任公司；蒸馏水100ml。 实施例1试纸的制作包括支持垫2和固定于其上的测试垫1，该试纸的测试垫包括如下试剂D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 50mg; 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300 mg; 显色剂为NBT， 100 mg; 黄递酶，35U/mg， 500 mg; TrisBase，分子量121.14， 1.21g; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383.3， 4g; 蒸馏水100ml。按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取 薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37GC恒 温干燥箱内悬挂干燥45分钟，然后将滤纸裁剪成3"cM的纸片，粘 贴于3x6cM聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭 保存。
实施例2试纸的制作D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 75mg;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，400mg;显色剂为NBT, 150 mg;黄递酶，38U/mg， 750mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;蒸馏水100ml。制作方法同实施例1。 实施例3试纸的制作D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 100mg;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，500mg;显色剂为NBT， 200mg;黄递酶，45U/mg， 1000mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 6g;蒸馏水100ml。制作方法同实施例1。 实施例4试纸的制作D陽(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 55 mg;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，350 mg; 显色剂为NBT， 110 mg; 黄递酶，38U/mg， 550mg; TrisBase，分子量121.14， 1.21g; 氯化钠，300 mg; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383.3， 5g; 蒸馏水100ml。按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取 薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37GC恒 温千燥箱内悬挂干燥45分钟，然后将滤纸裁剪成3x3cM的纸片，粘 贴于3x6cM聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭 保存。实施例5试纸的制作D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 80 mg;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，400 mg;显色剂为NBT， 150 mg;黄递酶，40U/mg， 800mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;氯化钠，450 mg;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;
蒸馏水lOOml。制作方法同实施例4。 实施例6试纸的制作D- (-) -3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg， 90mg;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，450mg;显色剂为NBT， 180mg;黄递酶，42U/mg， 900mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;氯化钠，600 mg;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;蒸馏水100ml。制作方法同实施例4。 实施例7标准比色卡的制作酉己制浓度为50,ol/L、腦jimmol/L、 200|i mol/L、 500,ol/L、 lOOOpmol/L的D- (-) -3-羟丁酸标准溶液，与D- (-) -3-羟丁酸诊断 试纸反应后用数码相机拍照，制成标准比色卡。上述浓度由紫色到蓝紫色，再到蓝黑色，颜色逐渐加深。根据相 关研究报导，奶牛乳汁中的D- (-) -3-羟丁酸含量大于200p mol/L时， 可初步认定其患有亚临床酮病，而奶牛乳汁中的D- (-) -3-羟丁酸含 量为50pmol/L、 100pmmol/L对应的结果为正常奶牛，含量为 100|immol/L 200|a mol/L为疑似病牛，500pmol/L以上的为严重病牛。
实施例8试纸条评价1 、灵敏度测试配制Opmol/L、 50nmol/L、 100|imol/L、 150|imol/L、 200pmol/L、 300pmol/L 、 400jimol/L 、 500pmol/L 、 600pmol/L 、 700pmol/L 、 800pmol/L、 900nmol/L、 1000|amol/L的D-(-)-3-羟丁酸溶液，用试纸 检测其浓度，分析测试结果，浓度为50pmol/L、 100Hmmol/L、 200p mol/L、 500pmol/L、 1000pmol/L的D-(-)-3-羟丁酸溶液的测试结果与 标准比色卡所示的颜色相同，浓度为150)amol/L的溶液的测试结果显 示其位于10(Vmmol/L、 200pmol/L溶液之间，浓度为300pmol/L、 400pmol/L的溶液的测试结果显示其位于200n mol/L、 500pmol/L的 溶液之间，浓度为600|imol/L、 700|amol/L、 800pmol/L、 900|amol/L 的溶液的测试结果显示其位于500pmol/L、 1000|imol/L的溶液之间、 且颜色随着浓度的升高而逐渐加深。该测试结果显示，该试纸的灵敏 度能够满足要求，检测出奶牛是否得了亚临床酮病。符合设计要求。2 、特异性测试取D-(-)-3-羟丁酸、乙酰乙酸、3 —羟基戊酸、丙酮、3 —氧代戊 酸和己酸测定，分别配制成不同浓度的溶液，使用试纸测试，检测结 果所制作的试纸与乙酰乙酸、3 —羟基戊酸、丙酮、3—氧代戊酸和己 酸均不发生反应，特异性较高。 3、 稳定性测试将试纸分别置于4'C 、常温、37。C条件下密封保存，每隔15天 取出，观察外观性状,并测试标准D-(-)-3-羟丁酸溶液，测试结果表明
试纸的有效期可达到15个月，完全符合国家相关产品认证标准。4、临床应用性研究根据我们的试验需要，选择饲养管理较差的牛群，随机取200头 泌乳奶牛的乳样，先使用酶催化动力学方法测定D-(-)-3-羟丁酸含量, 再用试纸条检测其乳中D-(-)-3-羟丁酸含量，测试结果表明该试纸检 测的敏感性可达到88%，完全可以推广应用到实际生产应用中，具 有经济价值和现实意义。
权利要求
1.一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，包括支持垫和固定于其上的测试垫，其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂脱氢酶D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg～100mg；辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；黄递酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；显色剂NBT，100mg～200mg；Tris Base，分子量121.14，1.21g；草酸，分子量126，126mg；海藻糖，分子量383，4～6g；蒸馏水100ml。
2、 根据权利要求1所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸，其特征在 于测试垫还包括氯化钠，300mg 600mg。
3、 一种如权利要求1或2所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸的制 作方法，其特征在于按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸 调pH值至8.5，取薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后 取出，于37"C恒温干燥箱内悬挂干燥45分钟。
4、 如权利要求3所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸的制作方法， 其特征在于还包括将滤纸裁剪成3x3cm的纸片，粘贴于3x6cm聚 乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭保存。
全文摘要
本发明涉及一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，属于兽医临床检验学领域。包括支持垫和固定于其上的测试垫，其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg～100mg；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；黄递酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；NBT，100mg～200mg；Tris Base，分子量121.14，1.21g；草酸，分子量126，126mg；海藻糖，分子量383，4～6g；蒸馏水100ml。本发明使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的奶牛亚临床酮病诊断试纸，试纸用于对奶牛乳汁中D-(-)-3-羟丁酸和D-(-)-3-羟丁酸盐的检测。
文档编号G01N21/78GK101118237SQ20071005603
公开日2008年2月6日 申请日期2007年9月5日 优先权日2007年9月5日
发明者刘国文, 周昌芳, 宋文学, 才 张, 张乃生, 张加力, 张志刚, 李小兵, 哲 王, 逄晓阳 申请人:吉林大学