专利名称：一种乳粉蛋白氮含量分析方法
技术领域：
本发明属于蛋白质检测技术，尤其是利用乳粉蛋白质测定软件自动绘制标准曲线进行图像分析和双缩脲反应后溶液的显色相结合而完成的一种乳粉蛋白氮含量分析方法。
背景技术：
目前可行的蛋白质测定的方法有多种。既有利用其物理性质，如折射率、比重、紫外线吸收等性质来推知；也有利用化学方法，如定氮、双缩脲反应、福林-酚试剂反应、染料结合反应的方法来计算。
通过测定总氮量，再由总氮量折算蛋白质的含量是目前最为基本的和最为常用的检测方法。其中凯氏定氮法被认为是测定总有机氮的最准确和最简便的方法之一，其原理为将被测样品与硫酸和催化剂一起加热消化时，蛋白质分解为氨后与硫酸结合生成硫酸铵，在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用盐酸标准溶液滴定。根据酸的消耗量乘以换算系数即为蛋白质含量。从该方法的原理可知，由于在消化时，样品中部分或全部的非蛋白氮同样会转化成铵盐，使得测定结果较真实值偏高。因此，凯氏定氮法的测定值为样品中粗蛋白的含量。
正常情况下，乳粉中的非蛋白氮含量在总氮中所占比例是基本稳定的，因此，凯氏定氮法的测定结果基本能反映样品蛋白质含量的水平。该方法可用于所有的动植物食品的分析，具有应用范围广、灵敏度高、回收率较好等显著特点，为国内外普遍应用。我国乳粉标准GB10765-1997《婴儿配方奶粉I》、GB10766-1997《婴儿配方乳粉II、III》、GB10767-1997《婴儿配方粉及婴幼儿补充粉通用技术条件》中所规定的蛋白质的测定方法要求采用GB/T5413.1-1997《婴儿配方食品和乳粉蛋白质的测定方法》，所用的方法也是凯氏定氮法。不过一旦样品中添加了大量非蛋白氮，该方法会显现出一定的局限性，而且这种方法不仅步骤繁琐、耗时，更无法在流通环节方便、有效地应用。
此外，双缩脲和酚试剂法等也是常用的方法。双缩脲法是一种常见的蛋白质含量的测定方法，其原理为蛋白质的肽键在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。利用双缩脲法测定蛋白质的含量，操作快速简便、需用仪器设备少、对测定的环境要求低，但此类方法多是对样品进行特定化学反应处理后，通过测定澄清后的样品溶液的吸光度值来计算蛋白质含量的。样品溶液的澄清度直接影响到溶液吸光度值的测定，从而影响到蛋白质含量的测定。因此，对于某些样品(如乳制品)，由于必须经过繁琐而费时的样品前处理以保证样品溶液的高度澄清，而严重限制了该类方法的适用范围。
三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚集沉淀。
本申请的乳粉的蛋白氮含量分析方法是在对乳粉中的蛋白氮含量进行测定时，毋需经过繁琐费时的前处理，且具有高度的自动化程度，本申请内容未见他人文章发表。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，该方法是基于计算机根据色度学原理，结合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关的方法，再用计算机软件自动分析获得样品色度值，然后计算蛋白氮含量；具体步骤如下步骤1配制显色反应所用的双缩脲试剂配制显色反应所用的双缩脲试剂的具体过程为(1)配制1～10mol/L的碱性溶液；按m/v浓度配制15～35％的酒石酸钾钠溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸馏水中按体积比，碱性溶液∶酒石酸钾钠溶液∶硫酸铜溶液和双缩脲试剂总量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配制双缩脲试剂，先分别加入步骤(1)中碱性溶液、酒石酸钾钠溶液和硫酸铜溶液，混合，后添加蒸馏水，使配制成的双缩脲试剂总量为碱性溶液体积的100倍定容，其中，酒石酸钾钠为稳定剂，用于使双缩脲试剂性状稳定；步骤2分别称取已知蛋白氮含量的乳粉的6个标样和1-6个待测样；步骤3制备标样与待测样品的显色液，具体过程为将所称取的样品放入离心管中，加入水和三氯乙酸，使三氯乙酸最终浓度为5％~50％，放置使蛋白充分沉淀，离心后弃去上清液，向离心管中加入四氯化碳和双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置使之稳定显色，移取适量的显色液体至离心管中离心，其中四氯化碳∶双缩脲试剂＝1∶15~40；步骤4采集图像离心后的标样和试样各取等量澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像。
步骤5读取蛋白氮含量，利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息；点击“检测”菜单中的“参数设置”，根据提示输入标样的标号和标样的蛋白质含量；根据标样的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白质测定软件自动绘制标准曲线和采集到的待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品蛋白氮的含量。初始参数确定后点击“结果”，比较后确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出；所述碱性溶液为氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。
所述配制双缩脲试剂在蒸馏水中按体积比，碱性溶液∶酒石酸钾钠溶液∶硫酸铜溶液和双缩脲试剂总量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL的比例配制双缩脲试剂本发明的有益效果是改良了测定中标准曲线的制备，使本发明在测定精度、测定时间、测定成本与操作步骤上得以进一步的优化；利用普通的办公用计算机与扫描仪代替了实验室专用的精密仪器—分光光度计，省去了双缩脲法中人工绘制标准曲线和计算蛋白质含量的步骤，尤其适合乳粉大批量的检测，自动化程度高，测量精度高，操作快速简便，需要的仪器设备少，成本低，对测定的环境条件要求低，无污染。适用于乳粉蛋白氮的快速定量测定。较传统方法具有明显的优势。
图1为利用乳粉蛋白氮测定软件自动绘制标准曲线。
具体实施例方式
本发明的目的是提供一种乳粉蛋白氮含量分析方法，该方法是根据色度学原理，结合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关的方法，用计算机软件自动分析获得样品色度值，然后计算蛋白氮含量。
以下通过具体的实例对本发明进行详细的说明。
实施例1(1)分别配制10M的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，25％(m/v)的酒石酸钾溶液和4％(m/v)的五水硫酸铜溶液。
(2)配制双缩脲试剂。在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸馏水，再加入上述浓度的10mL氢氧化钾溶液或氢氧化纳溶液和25％的酒石酸钾钠溶液20mL，剧烈搅拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液约30mL，然后添加蒸馏水至1000mL定容，即配制成双缩脲试剂。此试剂可长期使用，但应密封贮存，若有沉淀出现，则应重新配制。
(3)按m/v浓度配制10％三氯乙酸溶液。
(4)制备标准样品和待测样品的显色液，具体过程为各称取6种已知蛋白氮含量的乳粉作为标样，并与待测样品分别称取0.1g，置于50mL离心管中。向50mL离心管中加入5mL水和5mL 10％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液。再向离心管中加入1mL四氯化碳和20mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液约15mL液体至离心管中，离心20min(10000r/min)，得到标样与待测样品的澄清液。
(5)采集图像各取离心后的标样和待测试样4mL澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像，并将样品图片信息保存在计算机中
(6)读取蛋白氮含量利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息。点击“检测”菜单中的“参数设置”，根据提示输入标样的标号和标样的蛋白氮含量；根据标样的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白氮测定软件自动绘制标准曲线(如图1所示的斜线)和采集待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品的蛋白氮含量(如表1所示及如图1上所示的1#、2#、3#)。初始参数确定后点击“结果”，比较后确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出。
表1样品蛋白氮含量测定结果
实施例2(1)分别配制5M的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，15％(m/v)的酒石酸钾溶液和2％(m/v)的CuSO4·5H2O溶液(2)配制双缩脲试剂在500mL容量瓶中，先加入400mL蒸馏水，再加入上述浓度的5mL氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液和上述酒石酸钾钠溶液10mL，剧烈搅拌下逐滴加入上述CuSO4·5H2O溶液15mL，然后添加蒸馏水至500mL定容，即配制成双缩脲试剂。此试剂可长期使用，但应密封贮存，若有沉淀出现，则应重新配制。
(3)按m/v浓度配制10％三氯乙酸溶液。
(4)制备标准样品和待测样品的显色液，具体过程为各称取6种已知蛋白氮含量的乳粉作为标样，并与待测样品分别称取0.05g，置于50mL离心管中。向50mL离心管中加入3mL水和3mL 10％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液。再向离心管中加入0.5mL四氯化碳和10mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液约8～9mL液体至离心管中，离心20min(10000r/min)，得到标样与待测样品的澄清液。
其余同实施例1实施例3(1)分别配制10M的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，25％(m/v)的酒石酸钾溶液和4％(m/v)的无水硫酸铜溶液。
(2)配制双缩脲试剂。在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸馏水，再加入上述浓度的10mL氢氧化钾溶液或氢氧化纳溶液和25％的酒石酸钾钠溶液20mL，剧烈搅拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液约30mL，然后添加蒸馏水至1000mL定容，即配制成双缩脲试剂。此试剂可长期使用，但应密封贮存，若有沉淀出现，则应重新配制。
(3)按m/v浓度配制40％三氯乙酸溶液。
(4)制备标准样品和待测样品的显色液，具体过程为各称取6种已知蛋白氮含量的乳粉作为标样，并与待测样品分别称取0.2g，置于50mL离心管中。向50mL离心管中加入5mL水和5mL 40％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液。再向离心管中加入1mL四氯化碳和40mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液25~35mL液体至离心管中，离心25min(10000r/min)，得到标样与待测样品的澄清液。
其余同实施例1最后应该说明的是以上实例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照了上述实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或者局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，该方法是根据色度学原理，结合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关的方法，用计算机软件自动分析获得样品色度值，然后计算蛋白氮含量，具体步骤如下步骤1配制显色反应所用的双缩脲试剂(1)配制1～10mol/L的碱性溶液；按m/v浓度配制15～35％的酒石酸钾钠溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸馏水中按体积比，碱性溶液∶酒石酸钾钠溶液∶硫酸铜溶液和双缩脲试剂总量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配制双缩脲试剂，先分别加入步骤(1)中碱性溶液、酒石酸钾钠溶液和硫酸铜溶液，混合，后添加蒸馏水，使配制成的双缩脲试剂总量为碱性溶液体积的100倍定容，其中，酒石酸钾钠为稳定剂，用于使双缩脲试剂性状稳定；步骤2分别称取已知蛋白质含量的乳粉标样和待测样；步骤3制备标样与待测样品的显色液将所称取的样品放入离心管中，加入水和三氯乙酸，使三氯乙酸最终浓度为5％～50％，放置使蛋白充分沉淀，离心后弃去上清液，向离心管中加入四氯化碳和双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置使之稳定显色，移取适量的显色液体至离心管中离心；步骤4采集图像离心后的标样和试样各取等量澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像；步骤5读取蛋白氮含量，利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息；点击“检测”菜单中的“参数设置”，根据提示输入标样的标号和标样的蛋白质含量；根据标样的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白质测定软件自动绘制标准曲线和采集待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品蛋白氮的含量，初始参数确定后点击“结果”，比较后确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出。
2.根据权利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述四氯化碳∶双缩脲试剂＝1∶15～40(v/v)。
3.根据权利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述碱性溶液为氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述配制双缩脲试剂的常用比例是按碱性溶液∶酒石酸钾钠溶液∶硫酸铜溶液和双缩脲试剂总量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL。
5.一种乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸馏水，再加入10M的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液上述浓度的10mL，25％的酒石酸钾钠溶液20mL，剧烈搅拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液约30mL，然后添加蒸馏水至1000mL定容，即配制成双缩脲试剂；各称取6种待测样品0.1g，分别置于50mL离心管中，向50mL离心管中加入5mL水和5mL10％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液。再向离心管中加入1mL四氯化碳和20mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液15mL液体至离心管中，离心20min(10000r/min)，得到待测样品的澄清液，然后各取离心后的待测试样4mL澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像，并将样品图片信息保存在计算机中，利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息，点击“检测”菜单中的“参数设置”，采集待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品的蛋白氮含量，与标准曲线比较后，确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出。
6.一种乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在500mL容量瓶中，先加入400mL蒸馏水，再加入5M的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液5mL，和15％(m/v)的酒石酸钾溶液10mL，剧烈搅拌下逐滴加入2％(m/v)CuSO4·5H2O溶液15mL，然后添加蒸馏水至500mL定容，即配制成双缩脲试剂；称取6种待测样品各0.05g，分别置于50mL离心管中，向50mL离心管中加入3mL水和3mL 10％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液，再向离心管中加入0.5mL四氯化碳和10mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液8～9mL液体至离心管中，离心20min(10000r/min)，得到待测样品的澄清液；然后各取离心后的待测试样4mL澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像，并将样品图片信息保存在计算机中，利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息，点击“检测”菜单中的“参数设置”，采集待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品的蛋白氮含量，与标准曲线比较后，确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出。
7.一种乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸馏水，再加入10M的度的10mL氢氧化钾溶液或氢氧化纳溶液和25％的酒石酸钾钠溶液20mL，剧烈搅拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液约30mL，然后添加蒸馏水至1000mL定容，即配制成双缩脲试剂，称取6种待测样品各0.2g，分别置于50mL离心管中，向50mL离心管中加入5mL水和5mL40％三氯乙酸溶液，静置10min，离心10min(10000r/min)，弃去上清液，再向离心管中加入1mL四氯化碳和40mL双缩脲试剂，振荡使沉淀充分溶解，避免结块，静置3分钟，分别取各样品的显色液25～35mL液体至离心管中，离心25min(10000r/min)，得到待测样品的澄清液；然后各取离心后的待测试样4mL澄清液体至比色池中，将比色池置于扫描仪上，启动扫描仪采集图像，并将样品图片信息保存在计算机中，利用计算机系统读取图像采集器采集到的原始图像信息，点击“检测”菜单中的“参数设置”，采集待测样品的色度值，采用回归方程计算待测样品的蛋白氮含量，与标准曲线比较后，确定检测样品的蛋白氮含量，并根据需要打印输出。
全文摘要
本发明公开了属于蛋白质检测技术的一种乳粉蛋白氮含量分析方法。是根据色度学原理结合三氯乙酸可使蛋白质沉淀以及双缩脲试剂与蛋白质形成紫色络合物，即不同蛋白质含量的样品经三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，其色度值与蛋白质含量高低呈线性相关，用计算机软件自动分析获得与通过分光光度计测定吸光度值比较，然后计算蛋白质含量。使本发明利用普通的办公用计算机与扫描仪代替了实验室专用的精密仪器一分光光度计，在测定精度、时间、成本与操作步骤上省去了人工绘制标准曲线的步骤，操作快速简便，需要的仪器设备少，成本低，对测定的环境条件要求低，无污染尤其适合乳粉大批量的检测。
文档编号G01N21/17GK101059447SQ20071009962
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者侯彩云, 陈婧, 祝晓芳, 牛巍, 孙建平, 石文贞, 傅泽田, 张健 申请人:中国农业大学