专利名称：：一种实验动物短途运输应激评价和干预方法
技术领域：
：本发明属实验动物领域，涉及实验动物短途运输，具体涉及一种实验动物短途运输应激评价和干预方法。技术背景实验大鼠和小鼠是生命科学研究和生物医药产品检定中用量最多、用途最广泛的实验动物，约占实验动物使用总数量的80%。据报道，美国、欧洲、日本每年实验大鼠和小鼠的使用量约2500万只，仅在英国，2000年实验大鼠和小鼠的使用量就达2141，935只。随着生命科学的飞速发展及生物医药支柱产业的迅猛扩张，我国每年实验大鼠和小鼠的使用量目前已达IOOO万只以上。在国外，由于社会分工和市场化的日渐成熟，常用实验动物往往是由少数几家大型企业集中规模化生产，然后依据客户需求，运输至使用单位以供实验运用。绝大多数使用单位一般自己不生产实验动物，完全依赖市场外购。例如，英国以BK公司为主，美国以CharlesRiver公司为主，实行市场化供应。考虑到运输应激对动物健康的影响，一些发达国家就如何运输实验动物作出了相应规定或者提出指导性意见，其内容主要涉及交通工具、笼具材料、运输空间、长途运输中食物和水的供应以及兽医观察等，且对象主要为犬、猴等大型实验动物，对于用途最广、用量最大的实验大鼠和小鼠的常见短途运输问题并无建立在实验评估科学依据下的具体技术规范。在我国，由于实行了实验动物生产许可证和使用许可证制度，常用实验动物生产和使用分离已成大势所趋，运输成为衔接生产(上游)和应用(下游)的必要环节。但是，我国实验动物国家标准仅覆盖了实验动物在生产和使用期间的环境及营养控制，对于实验动物的运输过程尚无具体技术规范。在此状况下，实验动物生产供应机构普遍采用专用运输车和运输包装箱运送实验动物，以满足运输期间实验动物对温度、湿度和空间等基本要素的需求。事实上，经历运输的动物不可避免地受到诸多生理性和心理性激源的复合刺激，由此引发的相应应激反应不同程度地威胁到动物的身心健康。目前，国内外均缺乏运输应激对实验大鼠和小鼠影响的系统全面科学评价，对于在运输过程中及到达目的地后如何减轻或消除运输应激，亦无相应的有效技术措施。短途运输是实验动物最常见的运输形式，在我国，每年约有iooo多万只实验大鼠和小鼠经历短途运输过程，其中绝大多数是由占实验动物专业机构95%以上的使用单位向就近的生产单位购买以供实验使用，约65%的短途运输时间为1.5小时左右，随后依次为1小时和0.5小时。由于短途运输应激的影响，动物的生理状况和功能指标发生变异，抵达目的地后需要有相当的健康适应期(periodofacclimatizationfollowingtransportation)用于休养调整，待恢复后才能应用于实验，否则不仅会对动物实验产生背景性干扰，影响科学研究的真实性和可靠性以及生物医药产品检定的安全性和有效性，也会损害实验动物的福利和健康。由于缺乏相应的科学依据和技术规范，使用单位对健康适应期限的设定各不相同，有调査显示，约有67%的使用单位把实验大鼠和小鼠的健康适应期定为1天，25%的使用单位定为1周。
发明内容本发明的目的是提供一种实验动物短途运输应激评价和干预方法。本发明能提供评价啮齿类实验动物短途运输应激反应的技术指标体系和经历短途运输后实验动物的健康适应期以及缓解短途运输应激专用营养补充剂。本发明所述的啮齿类实验动物优选实验大鼠和小鼠。本发明的目的通过下述技术方案实现本发明通过观察短途运输应激对实验大鼠和小鼠的影响，建立短途运输应激评价的技术指标体系，确定实验大鼠和小鼠经历短途运输应激后的健康适应期，提供减轻短途运输应激不良反应的干预措施。本发明方法通过下述步骤提供了评价的技术指标体系和健康适应期以及缓解短途运输应激专用营养补充剂-1)使实验动物分别经历不同运输时间，分别为0.5hr、lhr或1.5hr。2)使实验动物经历1.5hr运输时间到达实验室后分别恢复不同时间，分别为24hr、48hr、72hr或96hr;或，运输时进行干预，优选营养补充剂进行干预，到达实验室后分别恢复不同时间，分别为24hr、48hr、72hr或96hr;3)测定所述实验动物的生长代谢、神经内分泌和免疫功能主要指标，与未经历运输的对照组比较，观察分析短途运输应激对实验动物的影响；或与未接受干预的运输对照组比较，观察分析营养补充剂对缓解实验动物短途运输应激的作用；4)遴选评价的技术指标，建立评价技术指标体系，提出健康适应期以及确定营4养补充剂的干预效果。结果表明，本发明方法提供了由能量代谢标志物GLU、免疫功能执行者WBC、HPA轴终末效应激素CORT、神经内分泌-免疫网络双向调控因子P-EP和免疫功能调节关键细胞因子IL-2共同构成的实验动物短途运输应激评价技术指标体系，以及通过尾静脉微量微创采血即刻测定外周血GLU含量和WBC总数的快速评价方法；实验大鼠和小鼠在经历1.5hr以内短途运输后的健康适应期均应至少为72hr;所制成的缓解短途运输应激专用营养补充剂为凝胶状营养补充剂，其能够有效减轻短途运输应激对动物代谢和免疫功能造成的不良影响，同样经历1.5hr运输，运输期间获得营养干预的动物比未获得营养干预的动物提前三分之一的时间恢复到正常状态，说明该营养补充剂具有一定的抗短途运输应激作用。本发明方法可为实验大鼠和小鼠短途运输科学化和标准化提供实验依据，避免短途运输应激对实验动物健康和福利的损害及对动物实验的背景性干扰，消除实验动物生产和使用分离所造成的制约瓶颈，实现实验动物质量保证的无缝对接，解决生产和使用衔接中的实际问题，以确保事关国计民生的生物医药科学研究和产品检定的科学性及有效性。具体实施方式实施例l制订评价的技术指标，建立技术指标评价体系1、动物及日常饲养管理清洁级封闭群雄性Wistar大鼠80只，体重250士15g，由复旦大学实验动物科学部提供[生产许可证号SCXK(沪)2007—0002]。实验在复旦大学实验动物科学部屏障环境设施内进行[使用许可证号SYXK(沪)2007_0002]。动物饲养于SS4型大鼠专用饲养笼内(尺寸为485mmx350mmx200mm)，每笼5只。饲料釆用经121°C20min高温高压蒸汽灭菌的全价颗粒饲料，饲料标准参照《实验动物小鼠大鼠配合饲料》国家标准GB14924.3-2001，用前筛除碎屑。饮水采用经121°C30min高温高压蒸汽灭菌后自然冷却至室温的自来水，使用500ml专用聚丙烯PP塑料饮水瓶装。垫料釆用经121°C45min高温高压蒸汽灭菌的刨花，用前筛除粉尘。饲育环境控制按照实验动物环境国家标准GB14925-2001执行，其中，照明采用人工控制10/14明暗光制(照明时间为8:0018:00)。2、主要仪器、设备OmnitestEZ血糖仪B.Braun公司；OPTICON2荧光定量PCR仪MJ公司；Bio-TekElx800USA酶标仪(美国)；OLYMPUS显微镜(日本)；上海精科MP502B型电子秤，量程0500g，精确度0.01g;3、主要试剂大鼠皮质酮(CORT)、p-内啡肽(P-EP)测定试剂盒(血清型)，ADL公司产品；大鼠免疫球蛋白g(IgG)、白介素l(il-1)、白介素2(il-2)、y干扰素(IFN-y)测定试剂盒(血清型)，RapidBio公司产品；Trizol试剂、01igodT18，invitrogen公司产品；M-MLV5xReactionBuffer,RecombinantRnasin，M-MLV，Promega公司产品；dNTPmix，FQ-PCRPremixKit(荧光染料)，Transhold公司产品；OmnitestEZ血糖仪专用试纸，B.Braun公司产品；白细胞稀释液按常规方法配制；DEPC(AR)，EDTA-Na2(AR)，氢氧化钠(AR)，无水乙醇(AR)，三氯甲烷(AR),异丙醇(AR)，冰乙酸(AR)均为国药集团化学试剂有限公司产品；4方法1)实验设经历不同运输时间、运输后不同恢复时间及不经历运输的空白对照3个组别经历不同运输时间组别(T):共3组，每组10只，编组和处理如下丁0.5组经历运输0.5hr后即刻采样，!Yo组经历运输1.0hr后即刻采样，TYs组经历运输1.5hr后即刻采样，运输后不同恢复时间组别(R):共4组，每组10只，编组和处理如下R24组经历运输1.5hr后，恢复适应24hr再行采样，R48组经历运输1.5hr后，恢复适应48hr再行采样，R72组经历运输1.5hr后，恢复适应72hr再行采样，R96组经历运输1.5hr后，恢复适应96hr再行采样，空白对照组别(C):共10只，常规饲养，不经历运输。2)动物运输和处理使用恒温实验动物专用运输车为短途运输工具，采用实验大鼠运输专用包装箱为运输容器(尺寸为510mmx320mmxl卯mm),每箱装运lO只大鼠，箱内预先放置经12rC45min高温高压蒸汽灭菌并筛除粉尘的刨花，松散状态下刨花厚度约40mm。经历不同运输时间组别为To.5、T,.o、T,.5的动物，于连续运输0.5hr、lhr、1.5hr时即刻逐组采样测定；运输后不同恢复时间组别为R24、R48、R72、R96的动物，经历1.5hr的连续运输后返回实验室，更换洁净笼盒，重新放置垫料、饲料和饮水，常规饲养，于返回后24hr、48hr、72hr、96hr逐组采样测定。各组采样均于11:15-12:30进行，每只大鼠的采样流程为尾静脉微量采血—眼睚动静脉丛采血—肝脏组织块采集，对每只大鼠的采样处理于3min内完成。3)体重测定经历不同运输时间(To.s组、Tu)组、Tl5組)的动物于运输前、后各测定一次体重，以运输途中减轻的体重和运输前体重之比(Rbwlost)表示运输过程对体重的影响。对照组(C)的体重测定和TY5组同时进行。对经历运输1.5h后恢复96hr的动物(R96组)于运输结束后即刻(Ohr)、24hr、48hr、72hr、96hr5个时间点分别测定体重，同时同步测定对照组(C)体重，计算两组在实验期间每24hr的体重增长率。4)血糖(GLU)测定动物清醒安静状态下，从右侧尾静脉距尾尖1/3处微创法采血5^U,以测定试纸吸取血液至充满测定池后，静置15s,记录测定值。5)外周血白细胞(WBC)计数血糖测定采样后，同部位再次采取20pl血样，将血样溶于白细胞稀释液并振荡混匀，经40倍稀释后，于3hr内置低倍镜下直接计4个大方格内白细胞总数(N)，按下列公式求得外周白细胞数4个大方格内白细胞总数(N)，白细胞数(WBC)=-x稀释倍数xl0746)激素和细胞因子测定取眼眶动静脉血2ml，室温静置30min，4'C3000转/分离心15min,分离血清，冰上分装，置-3(TC保存，于30天内测定血清中大鼠皮质酮(CORT)、(3-内啡肽(p-EP)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)和Y干扰素(IFN-Y)的含量，测定采用ELISA法，按试剂盒说明书操作。7)应激分子转录水平测定按常规方法采集肝脏标本，投入液氮速冻后转-70'C保存，Trizol法提取肝脏总RNA，RT-PCR两步法合成cDNA，采用荧光染料法行real-timePCR，2^"法对Hsp72表达相对定量。8)统计学处理结果以均值±标准差表达，采用STATA软件统计，两组均数比较采用t检验，检验水准01=0.05，a-O.Ol。结果显示实验期间T0.5组、T1.0组和T1.5组的RBWLOST均极显著高于C组(PO.Ol)。表l是不同运输时间对体重的影响。表1__组别运输时间"BW々BW2/gABW/gRbwlost/hrT0.50.5254.56±8.51247.70±7.686.86±1.580.0269±0.0059"T101.0255.14±11.32246.93±11.148.20±1.210.0322土0,0047"TL51.5255.22±13.26244.25±13.0210.98±1.940.0430±0.0074"_^_-—254.30±9.21252.20±9.212.10±0.730.0083±0.0029其中①BW,运输前体重；BW2运输后体重；ABW=BW广BW2;Rbwlost=ABW/BW1;②与C组比较，"P〈0.01;n=10。在运输后024hr、24~48hr、48~72hr3个恢复时段内，R96组的体重增长率均高于C组且差异极显著(P<0.01)，运输后7296hr，R96组的体重增长率和对照组差异不显著(P>0.05)。表2是运输后不同恢复时段体重增长率的变化。表2组别测量时段0~24hr24~48hr48~72hr72~96hrR960.0584土0.016"0.0307±0.0082"0.0348土0.0012"0.0193±0.0063C0.0206±0.00670.0190±0.00590.0232±0.00700.0194±0.0064其中与C组比较，尸O.01;n=108GLU测定显示，与空白对照组(C组)比较，T0.5组显著升高(P<0.05)，T1.0组和R24组均极显著升高(PO.Ol),而T1.5组极显著降低(P<0.01),R48、R72和R963组的GLU水平与C组差异不显著(P>0.05)。WBC测定显示，与空白对照组(C组)比较，T0.5组、T1.0组和T1.5组均极显著减少(PO.Ol)，R24组和R48组均显著减少(P<0.05)，R72组和R96组的WBC与C组差异不显著(P>0.05)。表3是GLU和WBC的测定结果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中和C组比较，><0.05,"O.01;n=10CORT测定显示，与空白对照组(C组)比较，T0.5组和T1.0组血清CORT含量升高，T1.5组血清CORT含量降低，差异均极显著(P〈0.Q1)，R24、R48、R72、R964组和C组的差异均不显著(P>0.05)。e-EP测定显示，与空白对照组(C组)比较，T0.5组、T1.0组和T1.5组的血清e-EP含量均降低且差异极显著(PO.Ol)，R24组血清P-EP的含量降低且差异显著(P<0.05)，R48、R72以及R963组和C组的差异均不显著(P>0.05)。表4是血清中CORT和e-EP的含量。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>R721.572188.50±34.9815.23±1.83R961.596192.70±38.6214.78±1.76C_==z:__187.43±27.91_14.02±1.79其中和C组比较，'尸<0.05，*><0.01;n=10与空白对照组(C组)比较，R24组和R48组血清中IgG、IL-2和IFN-Y含量，以及R24组血清中IL-1含量均极显著降低(P<0.01)，R48组血清中IL-1含量显著降低(P<0.05),不同运输时间的3组(T0.5组、Tl.O组、T1.5组)和运输后分别恢复72hr、96hr的R72组、R96组与C组的差异均不显著(P〉0.05)。表5是血清中4种免疫因子的含量。表5^尿运输时间/hr处理恢复时间/hrIgG/mg'L.1IL國2/ng,1/1IFN-Y/ng'L'1IL-l/ng.L"To.50.50643.29±863.81±631.06±99.45330.89±54.5112.67140.281.00650.96±910.98±641.34±58.19345.78±48.74124.78146.55T151.50652.75±847.53±625.73±348.73±75.14118.04162.44120.92R241.524464.67±67.10646.78±456.69±244.33±85.1175.90**38.02**R481.548530.34±68.44699.75±471.69±270.55±47.33*94.58**78.2广R721.572617.31±63.63916.72±607.15±83.06320.21±53.44185.55R961.596619.68±61.28883.20±626.39±70.37331.23±41.78紙卯C----____633.59±83.09850.36±96.57638.08±321.39±41.45_103.25_其中和C组比较，><0.05，"PO.01;n=10与空白对照组(C组)比较，不同运输时间的各组(T0.5、Tl.O、T1.5)以及R24组和R48组的hsp72mRNA表达量均极显著上升(P<0.01)，而R72和R962组的表达量和对照组差异不显著(P>0.05)。10表6是肝脏hsp72mRNA的表达情况。表6处理组别-:-hsp72mRNA运输时间/hr恢复时间/hrT0.50.500.0338±0.0114**Ti.o1.000.0876±0.0266"丁L51.500.3036±0.聽**R241.5240.0330士0.0137"R481.5480.0074±0.0019"R721.5720.0059±0.0015R961.5960.0056±0.0015C——0.0052±0細2注和C组比较，"PO.01;n=10实验证实，短途运输应激对实验大鼠的生长代谢、神经内分泌和免疫功能均有不利影响，经历常规短途运输(1.5hr以内)的实验大鼠，到达目的地后的健康适应期至少应为72hr;外周血中白细胞总数(WBC)、血糖(GLU)、皮质酮(CORT)、e-内啡肽(P-EP)、免疫球蛋白G(IgG)、白介素2(IL-2)、Y干扰素(IFN-Y)及白介素l(IL-1)的含量可作为评价短途运输应激的指标，本发明优选外周血中白细胞总数(WBC)、血糖(GLU)、皮质酮(CORT)、P-内啡肽(P-EP)、白介素2(IL-2)建立实验动物短途运输应激评价技术指标体系。实施例2验证评价的技术指标体系，评价实验小鼠的短途运输应激1、动物及日常饲养管理清洁级雄性近交系BALB/c小鼠80只，体重20士2g;清洁级雄性封闭群ICR小鼠80只，体重20±2g，均由中国科学院上海实验动物中心提供[生产许可证号SCXK(沪)2007—0005]，实验在复旦大学实验动物科学部屏障环境设施内进行[使用许可证号SYXK(沪)2007—0002]。动物饲养于M1型小鼠专用饲养笼内(尺寸为2卯mmX178mmX160mm),每笼饲养4只。饲料采用经121°C20min高温高压蒸汽灭菌的全价颗粒饲料，饲料标准参照《实验动物小鼠大鼠配合饲料》国家标准GB14924.3-2001，用前筛除碎屑。饮水采用经121°C30min高温高压蒸汽灭菌后自然冷却至室温的自来水，使用200ml专用聚丙烯PP塑料饮水瓶装。垫料采用经121°C45min高温高压蒸汽灭菌的刨花，用前筛除粉尘。词育环境控制按照实验动物环境国家标准GB14925-2001执行，其中，照明采用人工控制10/14明暗光制(照明时间为8:00-18:00)。2、主要仪器、设备Bio-TekElx800USA酶标仪(美国)。OmnitestEZ血糖仪(德国)。OLYMPUS显微镜(日本)。3、主要试剂小鼠皮质酮(CORT)、e-内啡肽(e-EP)测定试剂盒(血清型)，ADL公司产品；小鼠白介素2(IL-2)测定试剂盒(血清型)，RapidBio公司产品；OmnitestEZ血糖仪专用试纸，B.Braun公司产品；白细胞稀释液按常规方法配制；4方法1)每个品系(品种)均设5组，每组16只，编组和处理如下TRO组经历1.5hr运输后即刻采样，TR24组经历1.5hr运输后，恢复适应24hr再行采样，TR48组经历1.5hr运输后，恢复适应48hr再行采样，TR72组经历1.5hr运输后，恢复适应72hr再行采样，C组不经历运输，常规饲养，作为空白对照组。2)运输及采样处理使用恒温实验动物专用运输车为短途运输工具，采用实验小鼠运输专用包装箱为运输容器(尺寸为510mmX320mmX190mm)，箱内预先放置经121'C45min高温高压蒸汽灭菌并筛除粉尘的刨花作垫料，松散状态下刨花厚度约30mm。动物按品系(品种)分开装运，每箱32只。连续运输1.5hr后，即刻对2个品系(品种)的TRO组采样测定，其余小鼠送入实验室按组常规饲养，并于运输后24hr、48hr、72hr逐组采样测定。空白对照C组常规饲养，采样处理与各实验组相同。各组采样均于11:3(M2:30进行，对每只小鼠采样处理控制在3min内完成。3)血糖(GLU)测定和外周血白细胞(WBC)计数同实施例14)激素和细胞因子测定12取眼眶动静脉血1.2ml左右，室温静置30min，4'C3000转/分离心15min，分离血清，冰上分装，置-3(TC保存，于30天内测定血清中小鼠皮质酮(CORT)、P-内啡肽(e-EP)、白细胞介素-2(IL-2)含量，测定均采用ELISA法，按试剂盒说明书操作。5)统计学处理结果以均值土标准差表示，采用STATA软件进行统计，两组均数比较采用t检验，检验水准a=0.05，a=0.01。结果显示，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO组、TR24组GLU均比各自的对照组(C组)极显著降低(PO.Ol),TR48组和TR72组与各自对照组(C组)比较差异不显著(P>0.05)。表7是运输应激小鼠GLU的变化。组别运输后恢复时间/hr—aLU/mmd'L-1BALB/cICR其中和C组比较，PO.01;n=16与各自对照组(C组)比较，BALB/c小鼠的TRO组、TR24组、TR48组，以及ICR小鼠的TRO组WBC均极显著减少(P<0.01)，ICR小鼠的TR24组WBC显著减少(P<0.05)。BALB/c小鼠的TR72组、ICR小鼠的TR48组和TR72组与各自对照组(C组)比较差异均不显著(P〉0.05)。表8是运输应激小鼠WBC的变化。表8_组别运输后恢复时间/hr——~~WBC/109'L-1-BALB/cICR其中和C组比较，户<0.05,PO.01;n=16与各自对照组(C组)比较，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO组、TR24组血清IL-2含量均极显著减少(PO.Ol)，ICR小鼠的TR48组血清IL-2含量显著减少(P<0.05)。137.41±0.668.21土0.6(T9.01±0.759.01±0.429.15士0.466.29±0.728.34±0.55*9.33±0.959.34±0.679.26±0.6603.68±0.775.63±1.082412.78土4.05"10.85±2.15*4814.80±2.51"11.89±2.297216.78±2.8511.62±2.11——17.93±2.4212.59±1.42D482!c247i力4g2TTTTwM82wRcBALB/c小鼠的TR48组、TR72组以及ICR小鼠的TR72组与各自对照组(C组)比较差异均不显著(P>0.05)。表9是运输应激小鼠血清IL-2含量的变化。表9其中和C组比较，><0.05，><0.01;n=16与各自对照组(C组)比较，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TR0组血清CORT含量均极显著减少(PO.Ol)，TR24、TR48、TR72各组与各自对照组(C组)比较则无显著差异(P>0.05)。表10是运输应激小鼠血清CORT含量的变化。表10_组别运输后恢复时间/hr—CX)RT/nmol'L-lBALB/cICR其中和C组比较，'P<0.05，P〈0.01;n-16与各自对照组(C组)比较，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO组、TR24组血清e-EP含量均极显著减少(PO.Ol)，TR48、TR722组与各自对照组(C组)比较则无显著差异(P>0.05)。表ll是运输应激小鼠血清e-EP含量。表11注和C组比较，尸<0.01;11=16运输后恢复时间/hr<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验证实，短途运输应激对不同遗传背景实验小鼠的代谢、神经内分泌和免疫功能均会产生不利影响，其中免疫功能所受的影响较大，运用本方法建立的实验动物短途运输应激评价技术指标体系能够客观评价这些影响。经历常规短途运输(1.5hr以内)的实验小鼠，到达目的地后的健康适应期至少应为72hr。实施例3制备缓解短途运输应激的凝胶状专用营养补充剂1、动物及日常饲养管理清洁级雄性近交系BALB/c小鼠72只，体重20土2g，由中国科学院上海实验动物中心提供[生产许可证号SCXK(沪)2007—0005]，实验在复旦大学实验动物科学部屏障环境设施内进行[使用许可证号SYXK(沪)2007—0002]。日常饲养管理同实施例2。2、主要仪器、设备和试剂同实施例23、凝胶状营养补充剂每支长约8cm,直径1.5cm，圆柱状，重量约12g士lg，具体配方如下氨基酸L-色氨酸(1.25%);L-精氨酸(3%);牛磺酸(5%)。均为分析纯试剂，日本进口分装，由上海伯奥生物科技有限公司提供。维生素Bl(13mg/100g);B2(12mg/100g);B6(12mg膽g);B12(0.022mg/100g);C(1800mg/100g)。上海信谊药业有限公司产品。葡萄糖(AR):4%，国药集团化学试剂有限公司产品。琼脂(AR):5%，国药集团化学试剂有限公司产品。生理盐水81.75%,四川科伦药业股份有限公司产品4、方法1)实验设营养干预、运输对照和空白对照3个组别，具体如下运输同步营养干预的分组共4组，每组8只，编组和处理如下TIO组经历运输及同步营养干预1.5hr后即刻采样，TI24组经历运输及同步营养干预1.5hr后，恢复适应24hr再行采样，TI48组经历运输及同步营养干预1.5hr后，恢复适应48hr再行采样，TI72组经历运输及同步营养干预1.5hr后，恢复适应72hr再行采样，运输对照动物的分组共4组，每组8只，编组和处理如下15TR0组经历运输1.5hr后即刻采样，TR24组经历运输1.5hr后，恢复适应24hr再行采样，TR48组经历运输1.5hr后，恢复适应48hr再行采样，TR72组经历运输1.5hr后，恢复适应72hr再行采样，空白对照组(C组)共8只小鼠，常规饲养，不经历运输。2)运输处理及采样使用恒温实验动物专用运输车为短途运输工具，采用实验小鼠运输专用包装箱为运输容器(尺寸为510mmX320mmX190mm)，箱内放置经高温高压灭菌的刨花作垫料。营养干预和运输对照的小鼠各装l箱，每箱均为32只。营养干预组别的包装箱内放置4支营养补充剂，悬空固定，自由取食，运输结束后即刻取出剩余部分。运输对照组别的包装箱按常规短途运输布置。连续运输1.5hr后，即刻从营养干预组别的运输箱中随机抽取8只小鼠采样测定指标，作为TIO组，其余小鼠随机编入TI24、TI48、TI72各个实验组。与此同时，即刻从运输对照组别的运输箱中随机抽取8只小鼠采样测定指标，作为TRO组，其余小鼠随机编入TR24、TR48、TR72各个实验组。于运输结束后24hr、48hr、72hr，分别对TI24和TR24、TI48和TR48、TI72和TR72逐组配对采样测定。空白对照C组饲养管理及采样处理与各实验组相同。各组采样均于11:3012:30进行，对每只小鼠采样处理控制在3min内完成。3)血糖(GLU)测定、外周血白细胞(WBC)计数、激素和细胞因子测定以及统计学处理同实施例2结果显示，TIO组的GLU比空白对照组(C组)极显著降低(P<0.01)，TI24、TI48、TI723组的GLU和C组比较差异不显著(P>0.05)。TIO组和TI24组的WBC比空白对照组(C组)极显著减少(P<0.01)，TI48组以及TI72组的WBC和C组比较差异不显著(P>0.05)。表12是营养干预小鼠GLU和WBC的变化。恢复适应时间/hrGLU/mmol丄-WBC/10y'L-TI0TI24TI48TI72C02448727.04±0.688.46±0.668.69±0.478.96±0.658.84±0.443.66±0.8213.48±2.24"15.46±1.7117.71±2.9917.08±1.84其中和C组比较，"P<0.01;n=8TR0组和TR24组的GLU比空白对照组(C组)极显著降低(PO.Ol)，TR48组、TR72组的GLU和C组比较差异不显著(P>0.05)。TR0组、TR24组的WBC均比空白对照组(C组)极显著减少(PO.Ol)，TR48组的WBC比C组显著减少(P<0.05)，TR72组的WBC和C组比较差异不显著(P>0.05)。表13是运输对照小鼠GLU和WBC的变化。表13_<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注和C组比较，*户<0.05，"P<0.01;n=8与空白对照组(C组)比较，TIO组血清CORT、P-EP含量极显著减少(PO.Ol)，血清IL-2含量显著减少(P<0.05)。TI24、TI48、TI723组的血清CORT、e-EP、IL-2含量和C组的差异均不显著(P>0.05)。表14是营养干预小鼠血清CORT、e-EP、IL-2含量的变化。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中和C组比较，PO.05,P<0.01;n=8与空白对照组(C组)比较，TR0组血清CORT、e-EP、IL-2含量，以及TR24组血清e-EP含量均极显著减少(PO.Ol)，TR24组血清IL-2含量显著减少(P0.05)。TR24组的血清CORT含量，以及TR48组和TR72组血清CORT、e-EP、IL-2的含量均和C组无显著差异(P〉0.05)。表15运输对照小鼠血清CORT、e-EP、IL-2含量的变化。表15注和C组比较，'PO.05，'P<0.01;n=8实验证实，凝胶状营养补充剂能够减轻短途运输应激对动物代谢和免疫功能的不利影响，促使其较快恢复至正常水平，具有较好的抗短途运输应激作用。恢复适应时间/hrCORT/画l.L-1卩-EP/ng.L"IL-2/ng.L"<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1、一种实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是包括下述步骤1)使实验动物分别经历不同运输时间；2)使实验动物经历1.5hr运输时间到达实验室后分别恢复不同时间；或，运输时进行干预，到达实验室后分别恢复不同时间；3)测定所述实验动物的生长代谢、神经内分泌和免疫功能指标，与未经历运输的对照组比较，观察分析短途运输应激对实验动物的影响；或与未接受干预的运输对照组比较，观察分析所述干预对缓解实验动物短途运输应激的作用；4)遴选评价的技术指标，建立评价技术指标体系，提出健康适应期及确定干预效果。2、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的实验动物是实验大鼠或小鼠。3、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的步骤l)的运输时间是0.5hr、lhr或1.5hr。4、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的步骤2)的恢复的不同时间是24hr、48hr、72hr或96hr。5、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的步骤2)的干预是营养补充剂的干预。6、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的步骤4)所述的技术指标体系包括能量代谢标志物GLU、免疫功能执行者WBC、HPA轴终末效应激素CORT、神经内分泌-免疫网络双向调控因子p-EP和免疫功能调节关键细胞因子IL-2。7、按权利要求1所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的步骤4)所述的健康适应期为实验动物在经历1.5hr以内短途运输后的健康适应期至少为72hr。8、按权利要求5所述的实验动物短途运输应激评价和干预方法，其特征是所述的营养补充剂为凝胶状营养补充剂。全文摘要本发明属实验动物领域，涉及一种实验动物短途运输应激评价和干预方法。本发明通过观察短途运输应激对实验动物的影响，建立了短途运输应激评价的包括能量代谢标志物GLU、免疫功能执行者WBC、HPA轴终末效应激素CORT等的技术指标体系，确定了短途运输应激后的健康适应期至少为72hr，并提供了减轻短途运输应激不良反应的营养补充剂干预措施。本发明能为实验动物短途运输科学化和标准化提供实验依据，避免短途运输应激对实验动物健康和福利的损害及其背景性干扰，解决生产和使用衔接中的实际问题，保证生物医药科学研究和产品检定的科学性及有效性。文档编号G01N33/48GK101324553SQ200810040250公开日2008年12月17日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者斐杨,樱胡申请人:复旦大学