专利名称：基于微粒子的化学发光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学发光检测试剂盒，尤其是基于微粒子的化学发光检测试剂 盒，属于生物医学检测领域。
背景技术：
化学发光检测试剂盒是利用两种检测物(抗体、抗原或其它对特定待测物 有亲和作用的分子)来测定样本中的某种物质。其中一种检测物包被在固体表 面(以下简称固相)，另一种检测物标记酶或化学发光物质(以下简称标记物)。 反应过程中，待测物与标记物结合到固相上。洗涤去除过量的游离标记物，加 入发光液，通过反应将化学能转化成光能而发光。测定发光强度，就可以计算 出待测物浓度。
目前市场上主流的化学发光检测试剂盒普遍为化学发光酶免疫检测试剂
盒，包括抗体或抗原或Protein A包被的载体，标记抗体，待测物的标准品、 由缓冲体系和表面活性剂组成的洗涤液、发光液，其特征是采用96孔聚苯乙烯 酶标板作为固相载体、辣根过氧化物酶作为标记物。发光液中，含有发光剂及 氧化剂。发光剂为鲁米诺或鲁米诺衍生物，氧化剂通常为过氧化氢、过氧化氢 脲等无机氧化剂。反应过程中，待测物与酶标检测物结合到酶标板上，酶标板 上结合的酶数量与待测物含量成比例。洗涤去除过量的游离酶标记物，加入发 光液。残留的酶催化发光液中的鲁米诺与过氧化氢发生氧化还原反应，反应产 生的化学能转化为光能，残留的酶越多，发光强度就越大。通过检测光强度就 可以计算出样品中待测物的含量。这种方法的缺点是1)以酶标板作为固相载 体时，由于载体表面的检测物与样品中的待测物无法充分接触，导致反应效率 较低，反应时间较长，通常在60分钟以上，有些甚至达到3小时以上。2)由于 酶的生物活性会随着环境条件(温度、pH等)发生变化，导致同样数量的酶在 不同条件下产生的光量有明显的区别，无法得到稳定的结果。3)辣根过氧化物 酶的分子量为40000，碱性磷酸酶为68000，标记后可能会影响检测物的活性并 产生空间位阻。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种高效率、高稳定性的 基于微粒子的化学发光检测试剂盒。
本发明的基于微粒子的化学发光检测试剂盒，包括抗体或抗原或Protein A包被的载体，标记抗体，待测物的标准品、由缓冲体系和表面活性剂组成的洗
涤液以及发光液，其特征在于所说的抗体或抗原或Protein A包被的载体是含有 -COOH、 -NH2、 -OH或-CHO等基团的微粒子，抗体或抗原或Protein A以化学 交联的方式包被在微粒子表面。所说的标记抗体是以化学交联的方式在吖啶酯 或吖啶酯衍生物上连接的抗体。发光液包括A液和B液两种其中A液为过氧 化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度在0.1% 3%之间，硝酸的摩 尔浓度在0.01 0.5M之间；B液为氢氧化钠与Triton X-100水溶液，B液中氢 氧化钠的摩尔浓度在0.05 1.5M之间，TritonX-100的体积浓度在0.1% 2%之 间。
优选A液中过氧化氢的质量浓度为0.5%，硝酸的摩尔浓度为0.1M; 优选B液中氢氧化钠的摩尔浓度为0.35M, Triton X-100的体积百分比浓度 为0.5%。
上述的微粒子是直径在0.01um 100um的磁珠或乳胶。优选微粒子直径在 0.1um 10um之间。过小的微粒不容易在反应或洗涤后从液体中分离，而过大 的微粒在反应过程中容易沉降。在反应及洗涤过程中，通过振荡等机械作用或 变化的磁场等方式使微粒保持悬浮状态。而在固液分离时则利用磁场吸附或离 心等方式使微粒沉降。
上述的化学交联的交联剂是戊二醛、氯甲酸乙酯、乙基丁烯二酸酐或环已 基碳二亚胺。
所说的吖啶酯或吖啶酯衍生物的分子结构式如式1，<formula>formula see original document page 4</formula>式中R为吖啶酯衍生物的不同基团。
吖啶酯是一个三环的有机物，当它在碱性介质中氧化时，化学键发生断裂，经过一个二氧酮的中间体，产生一个电激发的10-甲基吖啶酮，当它由激发态回 复到基态时在430nm处释放出光子，化学发光反应过程如下
以吖啶酯或吖咬酯衍生物作为标记物，具有许多优点1.发光强度稳定。 发光时无需酶的催化，发光强度完全取决于吖啶酯的数量，不受外接环境的影 响。2.反应速度快(见附图)，加入发光液后1 2秒钟发光强度即达到峰值， 并在5 10秒钟内完成发光计数。3.吖啶酯属于小分子化合物，分离量仅为480， 体或抗原或Protein A在标记吖啶酯后不会对待测物的结合产生影响。
本发明的试剂盒用于检测待测物质的反应过程中，微粒子始终悬浮于反应 溶液中，溶液中的待测物可以与微粒子表面的抗体或抗原或Protein A (蛋白A) 充分接触，大大提高了待测物被抗体或抗原或Protein A捕获的机会，从而提高 了检测反应的速度，縮短反应时间。
本发明涉及的可以用于检测的样本包括各种生物组织及提取物、体液或分 泌物，如肌肉、血清、全血、尿液、乳汁等；待测物包括各种生物大分子，如 蛋白、核酸、多糖、多肽等，或各种小分子物质，如抗生素、氨基酸、药物及 其代谢产物等。
本发明涉及的发光液由两个独立的溶液(A液和B液)组成，发光时首先 加入发光液A，其中过氧化氢是氧化吖啶酯的氧化剂；硝酸提供一个酸性的环 境，利于过氧化氢的稳定保存。发光液B中含有氢氧化钠，提供碱性的环境促 使吖啶酯氧化发光反应的充分进行。
本发明涉及的洗涤液主要由缓冲体系和表面活性剂组成。其中的缓冲体系 可以选择PBS、 Tris-HCl等，表面活性剂通常使用Tween-20， Tween-80、 TritonX-100等，有助于清除磁珠表面附着的游离标记物，降低读数本底，提高 信噪比。
本发明的有益效果在于
l)采用微粒子作为固相载体，增加抗体或抗原或Protein A与待测物的接触 机会，縮短反应时间。2)采用吖啶酯或吖啶酯衍生物作为标记物，可迅速完成发光并得到稳定的光 信号。发光强度不受外界环境影响。
图1是吖啶酯瞬时发光示意图。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明。
实施例1.基于微粒子的癌胚抗原(CEA)化学发光检测试剂盒
基于微粒子的癌胚抗原(CEA)化学发光检测试剂盒包括抗CEA单克隆 抗体的磁珠，吖啶酯标记的抗CEA抗体，CEA的标准品、洗涤液、发光液。其 中发光液包括A液和B液，A液为过氧化氢和硝酸水溶液，过氧化氢的质量浓 度为0.5%，硝酸的摩尔浓度为0.1M; B液为氢氧化钠与TritonX-100水溶液， 氢氧化钠的摩尔浓度为0.35M, TritonX-100的体积百分比为0.5%。
其中，抗CEA单克隆抗体的磁珠是将抗CEA单克隆抗体用环已基碳二亚 胺交联剂连接到含有-COOH基团、粒径为2.3um的磁珠构成。
吖啶酯标记的抗CEA抗体是用环己基碳二亚胺交联剂在吖啶酯上连接的抗 CEA抗体。
洗涤液为含有质量浓度0.36% Tris,质量浓度0.1 % NaCl，质量浓度0.6% Tween-20的水溶液。
使用时，取聚丙烯反应管，分别加入50ul已知浓度的CEA标准品以及待测 病人血清样本，然后加入150ul包被有抗CEA单克隆抗体的磁珠，以及100ul 吖啶酯标记的抗CEA单克隆抗体溶液混合。37'C反应15分钟。将反应管置于 磁分离架上，待磁珠充分吸附后弃去上清。加入400ul洗涤液，让磁珠悬浮与洗 涤液充分接触。将反应管置于磁分离架上，待磁珠充分吸附后弃去上清。再重 复洗涤2次，弃上清。加入150ul发光液A及150ul发光液B并立即读取发光 信号。利用标准品的浓度及发光信号即可计算出样本中CEA的含量。
实施例2.基于微粒子的三碘甲状腺原氨酸(T3)化学发光检测试剂盒
基于微粒子的三碘甲状腺原氨酸(T3)化学发光检测试剂盒包括抗T3单 克隆抗体的磁珠，吖啶酯标记的T3抗原，T3标准品、洗涤液、发光液。其中 发光液包括A液和B液，A液为过氧化氢和硝酸水溶液，过氧化氢的质量浓度 为0.5%，硝酸的摩尔浓度为0.1M; B液为氢氧化钠与TritonX-100水溶液，氢 氧化钠的摩尔浓度为0.35M, TritonX-100的体积百分比为0.5%。其中，抗T3单克隆抗体的磁珠是将抗T3单克隆抗体用环已基碳二亚胺交 联剂连接到含有-COOH基团、粒径为2.3um的磁珠构成。
吖啶酯标记的T3抗原是用环已基碳二亚胺交联剂将T3抗原分子连接到吖 啶酯上的T3抗原。
洗涤液为含有质量浓度0.36。％ Tris，质量浓度0.1。％ NaCl，质量浓度0.6 % Tween-20的水溶液。
使用时，取聚丙烯反应管，分别加入50ul已知浓度的T3标准品以及待测病 人血清样本，然后加入100ul包被有抗T3单克隆抗体的磁珠，以及100ul吖啶 酯标记的T3溶液，混合。37-C反应15分钟。将反应管置于磁分离架上，待磁 珠充分吸附后弃去上清。加入400ul洗涤液，让磁珠悬浮与洗涤液充分接触。将 反应管置于磁分离架上，待磁珠充分吸附后弃去上清。再重复洗涤2次，弃上 清。加入150ul发光液A及150ul发光液B并立即读取发光信号。利用T3标准 品的浓度及发光信号即可计算出样本中T3的含量。
权利要求
1. 基于微粒子的化学发光检测试剂盒，包括抗体或抗原或Protein A包被的载体，标记抗体，待测物的标准品、由缓冲体系和表面活性剂组成的洗涤液以及发光液，其特征在于所说的抗体或抗原或Protein A包被的载体是含有-COOH、-NH2、-OH或-CHO基团的微粒子，抗体或抗原或Protein A以化学交联的方式包被在微粒子表面。所说的标记抗体是以化学交联的方式在吖啶酯或吖啶酯衍生物上连接的抗体。发光液包括A液和B液两种其中A液为过氧化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度在0.1％～3％之间，硝酸的摩尔浓度在0.01～0.5M之间；B液为氢氧化钠与Triton X-100水溶液，B液中氢氧化钠的摩尔浓度在0.05～1.5M之间，Triton X-100的体积浓度在0.1％～2％之间。
2. 根据权利要求1所述的基于微粒子的化学发光检测试剂盒，其特征在于所 说的微粒子是直径在0.01um 100um的磁珠或乳胶。
3. 根据权利要求1所述的基于微粒子的化学发光检测试剂盒，其特征在于所 说的化学交联的交联剂是戊二醛、氯甲酸乙酯、乙基丁烯二酸酐或环己基碳二 亚胺。
4. 根据权利要求1所述的基于微粒子的化学发光检测试剂盒，其特征在于发 光液的A液中过氧化氢的质量浓度为0.5%，硝酸的摩尔浓度为0.1M; B液中 氢氧化钠的摩尔浓度为0.35M， TritonX-lOO的体积百分比浓度为0.5%。
全文摘要
本发明的基于微粒子的化学发光检测试剂盒，包括抗体或抗原或Protein A包被的载体，标记抗体，待测物的标准品、洗涤液、发光液，其中抗体或抗原或Protein A包被的载体是含有-COOH、-NH<sub>2</sub>、-OH或-CHO基团的微粒子，抗体或抗原或Protein A以化学交联的方式包被在微粒子表面。标记抗体是以化学交联的方式在吖啶酯或吖啶酯衍生物上连接的抗体。发光液包括过氧化氢和硝酸水溶液以及氢氧化钠与Triton X-100水溶液两种。由于微粒子可以悬浮于样本溶液中，有利于增加微粒子表面抗体或抗原或Protein A与待测物充分接触，缩短反应时间。以吖啶酯或吖啶酯衍生物作为标记物，可以得到稳定、高强度的信号。
文档编号G01N33/544GK101419234SQ20081012176
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月17日 优先权日2008年10月17日
发明者厉永纲, 强 王 申请人:杭州博日科技有限公司