专利名称：脂连蛋白抗体和测量脂连蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及测量存在于人血浆/血清中的人脂连蛋白的不同形式的方法，并且更特别地，所述方法是基于ELISA测定法，其利用针对脂连蛋白的不同单克隆抗体，与针对人脂连蛋白的不同结构域的不同的多克隆抗体组合。
当单克隆和多克隆抗体的不同组合被组合以构造ELISA测定法时，不同ELISA形式可以测量不同分子形式的脂连蛋白。此外，脂连蛋白的这些不同分子形式的一些与不同的生理状态相关。不同脂连蛋白分子形式的水平可以与胰岛素敏感性或空腹血糖相关，或与其他生理状态如心血管疾病、皮脂腺病、炎症以及其他疾病相关。
本发明还提供了脂连蛋白的独特同种型和其抗体，包括多克隆和单克隆抗体。
本发明的方法是简单、可靠和可再现的，并且能够区分不同的脂连蛋白同种型，包括一些形式(M1球状、M1 N-末端、M24球状、M24 C-末端、A12820球状、A12820 N-末端、A12820 C-末端)，其显示了与糖尿病表型的显著程度的相关性。此外，本发明表明简单测量低或高分子量脂连蛋白同种型的先前方法不足以提供鉴定具有II型糖尿病形式的个体的能力。本发明的测定法也可以用于进一步定义脂连蛋白同种型与其他疾病的联系，所述其他疾病为诸如心血管疾病、代谢综合征、炎症、血脂异常、NASH等等。本发明的方法也可以用于监测疾病进展、对治疗的应答、预测治疗应答，以及诊断早期形式的疾病。
同样，这些测定法的效用，和所鉴定的新的脂连蛋白抗体和同种型可以用于监测疾病进展、对治疗的应答、预测治疗应答，以及诊断早期形式的疾病。
抗体开发和表征 开发了抗人脂连蛋白的球状结构域、N-末端结构域和C-末端结构域的多克隆抗体。这些多克隆抗体可以用于蛋白质印迹中和开发ELISA，所述ELISA用于在体液，如血浆、血清等等中发现的脂连蛋白的不同形式。多克隆抗体在兔中产生，并且程序由Pocono Rabbit Farm & Laboratory Inc，Canadensis，PA，按照标准方案进行。标准方案用于抗原注射、加强和取血。通过亲和层析用G蛋白琼脂糖(Protein G-Agarose)从血清纯化抗体。球状结构域的抗原是重组脂连蛋白蛋白，其编码氨基酸残基107-244。该蛋白质在大肠杆菌中产生，并且通过标准纯化技术纯化。N-末端肽抗原具有N-末端序列ETTTQGPGVLLPLPKGASTGC(Seq.Id.No.1)。C-末端肽抗体具有序列CYADNVNDSTFTGFLLYHDTN(Seq.Id.No.2)。
使用N-末端序列ETTQGPGVLLPLPKGAC(Seq.Id.No.3)产生针对人脂连蛋白N-末端的新的单克隆抗体(M1 Seq.Id.No 4和Seq.Id.No.5，分别是轻链和重链可变区，M24 Seq.Id.No.6和Seq.Id.No.7，分别是轻链和重链可变区)。由Antibody Solutions，Mountain View，CA 94043在小鼠中产生这些抗体。Antibody Solutions使用他们的标准方案(本领域中公知的技术)进行免疫(抗体对抗原应答的PolyExpress专有方案)，产生杂交瘤文库(免疫细胞的最后加强、与骨髓瘤细胞融合，和冷藏)，和单克隆培养物(使用流式细胞术细胞分选制备单克隆培养物)。
使用的方案是根据下面的一般程序方法的用于产生、制备和表征杂交瘤细胞的标准方案。(也见Oi.V.T..和L.A.Herzenberg.1979.在细胞免疫学中的选择的方法(In Selected Methods in Cellular Immunology).B.B.Mishell & S.M.Shiigi，eds.Freeman，San Francisco.p.351，Reik，L.M.，S.L.Maines.D.E.Ryan，W.Levin，S.Bandiera.和P.E.Thomas.1987.用于单克隆抗体的简单的非层析纯化程序(A simple.non-chromatographicpurification procedure for monoclonal antibodies).免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)100123，将所述参考文献并入本文作为参考)。杂交瘤上清液的初次筛选用于检测杂交瘤上清液中IgG与包被在96孔板上的N-末端肽的反应性。二次测定法涉及使用ELISA形式，捕获来自血浆的人类脂连蛋白，接着是与针对人类脂连蛋白的多克隆抗体的反应性。能够捕获人脂连蛋白的单克隆抗体被认为是有用的，并且随后通过ELISA分析并通过蛋白质印迹分析进一步表征。
ELISA测定法开发 用于测量人类脂连蛋白水平的ELISA测定法依赖于用针对脂连蛋白的特异性单克隆抗体捕获不同的脂连蛋白同种型，然后使用识别不同脂连蛋白表位的不同多克隆抗体鉴定所捕获的脂连蛋白同种型的能力。这些测定法的构造从而提供了特异识别不同脂连蛋白同种型的能力，其依赖于抗体对(单克隆抗体以及多克隆抗体)与独特的脂连蛋白同种型特异相互作用的能力。我们在该分析中使用了5种不同的单克隆抗体(MAB3604(Chemicon International)，A12820(611645)(BD Biosciences)，MAB10651(R&D Systems，Inc)，N-ADIP-M1(Roche)，和N-ADIP-M24(Roche))，加上三种不同的多克隆抗体(N-末端的、C-末端的和球状的)。从而，我们具有开发15种不同的测定法，和潜在鉴定15种不同的脂连蛋白同种型(M1球状、M1 N-末端、M1 C-末端、M24球状、M24 C-末端、M24 N-末端、A12820球状、A12820 N-末端、A12820 C-末端、MAB10651球状、MAB10651 N-末端、MAB10651 C-末端、MAB3604球状、MAB 3604 N末端)的潜能。MAB 3604 C-末端的组合不产生信号。通过使用额外的单克隆和多克隆抗体，可能鉴定更多数目的潜在脂连蛋白同种型。
产生兔多克隆抗体的程序 纯化的N-末端或C-末端脂连蛋白肽以1mg肽对1mg KLH的比例通过半胱氨酸残基偶联到KLH(缀合的肽)。将完全弗氏佐剂(CFA)中的100-200μg缀合的肽皮内注射到兔中。14天后，皮内注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的50-100μg缀合的肽。14天后，皮内注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的50-100μg缀合的肽。兔子在14天后取血得到用于分析目的的血清。之后，将兔子每30天用25-50μg缀合的肽皮下免疫，然后免疫后14天取血。收集血清，然后如下述纯化IgG，并用于测定法开发中(pAb生产参考Lui，F.T.，Sinnecker，M.，Hamaoka，J.，and Katz，D.(1979)生物化学(Biochemistry)18，690-697。这是本领域技术人员常规使用的许多方案之一)。使用的抗原是大肠杆菌中产生的N-末端脂连蛋白肽、C-末端脂连蛋白肽，和重组球状脂连蛋白，跨越氨基酸107-244。
上述方法导致产生三种不同的多克隆抗体，其被称作N-末端抗体、C-末端抗体和球状抗体，如上面在“抗体表征和开发”章节中所述。这些多克隆抗体的每一种与不同的单克隆抗体一起使用，以产生识别不同脂连蛋白同种型的独特ELISA测定法。
产生单克隆抗体的步骤 免疫方案和mAb产生 雌性BALB/c小鼠用CFA中的50μg缀合的N-末端肽腹膜内免疫，5周后用CFA中的50μg缀合的N-末端肽腹膜内加强。6周后，腹膜内注射PBS中的50μg缀合的N-末端肽，48小鼠后进行相同的加强。该最后加强后2天，除去脾脏，挑成(teased into)细胞悬液，如以前所述(19)的与HAT-敏感的鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。有许多相似的步骤，其是本领域技术人员常用的。杂交瘤在HAT培养基、HB 101培养基((Irvine Scientific，Irvine，CA)，7％FBS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1X HAT，和10％杂交瘤克隆因子(HCF；IGEN，Rockville，MD)(Kenney et al，生物技术(Biotechnology)，13787，1995)中选择。通过ELISA对10到14天后显示出生长的细胞上清液(50ul)的等分试样筛选抗脂连蛋白N-末端抗体。将N-末端肽包被在96孔板底部，并筛选与杂交瘤上清液的反应性。通过ELISA进一步筛选与N-末端肽反应的杂交瘤以确定它们是否与存在于人血浆中的天然脂连蛋白相互作用。通过在HAT培养基中有限稀释克隆目的杂交瘤(Kenney et al，生物技术(Biotechnology)，13787，1995)。
通过将克隆的杂交瘤注射到降植烷(pristane)预处理的BALB/c小鼠(1-2x 10E6细胞/小鼠，i.p.)中产生腹水。通过组合辛酸和硫酸铵沉淀从热灭活的腹水纯化mAb，如前述。通过大规模培养，接着通过G蛋白层析纯化IgG来产生mAb。
任选且优选地，这些方案的进一步改进涉及逆转用于该测定法中的抗体的顺序(order)。例如，多克隆抗体可以用于捕获不同的脂连蛋白同种型，然后进一步使用识别不同脂连蛋白表位的不同单克隆抗体鉴定捕获的脂连蛋白同种型。
以ELISA形式测量血浆/血清中和血浆级分中人类脂连蛋白的球状、N-末端和C-末端结构域的量。将免疫平板用下面的单克隆抗体之一包被1∶5000稀释度的MAB3604(Chemicon International)、0.5ug/ml的A12820(611645)(BD Biosciences)、0.25μg/ml的MAB10651(R&D Systems，Inc)、1ug/ml的N-ADIP-M1(Roche)，和1ug/ml的N-ADIP-M24(Roche)。具有100μg合适单克隆抗体的平板用平板密封器覆盖并在4℃温育16-20小时。然后用PBS-吐温200.05％洗涤平板3次，PBS-吐温200.05％用于所有随后的洗涤。将平板用300μl PBS缓冲液中的BSA 1％+吐温200.05％封闭1小时，并洗涤3次。向每个平板中加入最终体积50μl的合适的参考标准品(0.0195到10ng/孔)，其用于所有随后的温育。对于脂连蛋白检测的球状的和N-末端结构域，使用来自R&D Systems(cat#1065，在C-末端具有his-标记)的脂连蛋白(1-244)。对于C-末端脂连蛋白检测，使用来自Alexis Biochemicals的脂连蛋白(16-247)(cat#ALX-522-063，具有N-末端FLAG标记)。血浆/血清或血浆级分在具有BSA 0.1％+吐温200.05％的PBS中稀释并加入每个平板。将平板在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，然后洗涤4次。向每个平板中具有BSA 0.1％+吐温200.05的PBS中加入合适的检测抗体并在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，接着洗涤4次。加入显色抗体缀合到辣根过氧化物酶的驴抗兔抗体并在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，接着洗涤4次。在3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在下定量结合的缀合到辣根过氧化物酶的抗体。每孔加入50μl TMB溶液，平板用平板密封器盖上并在微型有轨平板摇床上摇动下在21-23℃下温育。在合适的时间加入50μl/孔0.5M磷酸终止反应。在450nm下读出OD并通过从合适的标准曲线插值(interpolation)确定脂连蛋白的量。反应在OD读数小于2的时间终止。该时间在2到10分钟，取决于捕获抗体和检测抗体。
筛选分级分离的血浆样品 使用10mM HEPES，pH 8中的5-20％蔗糖梯度分级分离来自三个正常供体的血浆级分，在2-ml的薄壁超速离心管(Becton Dickinson)中逐步倒入125mM NaCl，并允许在4℃过夜平衡。600ul总血浆以1∶10稀释，应用并梯度离心。样品在顶部分层(用10mM HEPES，pH 8，125mM NaCl以1∶10稀释)后，梯度在Beckman TL-100台式超速离心机中的TLS55转子中4℃下以55,000rpm离心4小时(Pajvani et al 2004)。从管的顶部取出150μl样品级分，并标记为1-20，级分1是梯度的顶层，级分20是梯度的底层。如下述将梯度级分顺序取回并通过蛋白质印迹或ELIAS分析。不同的抗体用于蛋白质印迹分析，并且为单克隆或多克隆抗体。对于ELISA分析，通过使用ELISA，用不同组合的单克隆抗体作为捕获试剂和不同多克隆抗体作为显色试剂，分析每个级分的脂连蛋白同种型的存在。该布局也可以反向，使得多克隆抗体用作捕获抗体，并且单克隆抗体用作显色抗体。商业化人脂连蛋白ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)用于比较目的。
筛选患者血浆收集物 人血浆样品的收集 募集男性和女性糖尿病和非糖尿病个体。过夜禁食后募集受试者并收集约50ml血液。受试者的身份保密(见知情同意表)。受试者包括糖尿病患者和非糖尿病的年龄匹配的对照。
排除标准病例和对照受试者都不能患有1型糖尿病或者糖尿病的继发形式(例如，库欣病、肢端肥大症)。经历类固醇治疗或患有炎性疾病(例如，皮肌炎)的受试者将被排除。具有小于1年的预期寿命的受试者(研究人员判断)将也被排除在外。除了这些标准外，对照受试者不能以前被诊断为2型糖尿病或者妊娠糖尿病，具有2型糖尿病家族史，或者具有空腹葡萄糖受损或者葡萄糖耐量受损(如上述)。
预期脂连蛋白同种型和这里公开和本发明ELISA方法中利用的抗体将导致更好地理解某些疾病(包括2型糖尿病)的病因，并且该理解将导致更好地治疗和预防措施。
关键物质和参数 对于具有已知糖尿病的个体，过夜禁食后收集总共约50ml血液。
如果个体以前没有被诊断为患有2型糖尿病，或者如果他们是饮食治疗的糖尿病患者，那么过夜禁食后收集总共约50ml血液。一些个体需要进行75g口服葡萄糖耐量测试。该测试需要过夜禁食(至少10小时)并且相对于施用口服葡萄糖0、30和120分钟时抽血。最多抽取共60mL血液。
血液收集和血浆制备步骤 根据标准方法从患者抽取静脉血。尽快地连续进行所有步骤以确保最好的样品质量和防止蛋白酶解。
每名患者收集约50ml血液(4×10ml真空管(vacutainer))。将每个真空管倒置两次以混合血液与抗凝剂并立即置于冰上(未冷冻)。
完成抽血后，所有真空管立即在4℃下以1500xg离心15分钟。
打开冷却(4℃或冰上)的真空管并使用1ml一次性吸管将上清液转移到10ml Falcon管(冰上)。留下约2mm上清液防止沉淀物移行。
4℃下以3000xg离心Falcon管30分钟。离心机制动器必须关闭。
用移液器回收Falcon管中的血浆上清液，留下所有沉淀。将所有血浆样品转移到一个50ml Falcon管并温和混合以确保样品均匀。
将样品在液氮中冷冻并保存在-80℃冰箱中。在干冰上运输。
筛选 将人血浆样品解冻并在制备中等分到96孔用于筛选。
如测定法开发章节和如下面简述的测定法步骤用于测定法的标准曲线图7-12，并用于血浆级分的测定法，
图13-18。测定法形式也用于测定人类血浆样品收集物中脂连蛋白的水平以与疾病状态相关，图19-31。
1)合适的捕获抗体加入免疫平板中100μl PBS体积中，在4℃下保持16-20小时。
2)吸出并洗涤平板3次。
3)平板用300μl体积的BSA 1％+吐温200.05％+PBS在300μl体积中21-23℃下封闭1小时。
4)吸出并洗涤平板3次。
5)合适的参考标准品以BSA 0.1％+吐温200.05％+PBS中的稀释液加入每个平板，最终体积50μl。
6)血浆/血清以BSA 0.1％+吐温200.05％+PBS中的稀释液加入每个平板，最终体积50μl。
7)将平板置于有轨摇床上并在21-23℃下温育1小时。
8)吸出并洗涤平板4次。
9)合适的检测抗体加入每个平板的BSA 0.1％+吐温200.05％+PBS中，终体积50μl，并置于有轨摇床上在21-23℃下温育1小时。
10)吸出并洗涤平板4次。
11)显色抗体驴抗兔-HRP加入每个平板的BSA 0.1％+吐温200.05％+PBS中，终体积50μl，并置于有轨摇床上在21-23℃下温育1小时。
12)吸出并洗涤平板4次。
13)将50μl TMB底物溶液加入平板中并置于有轨摇床上并在21-23℃下温育直到合适的显色时间。
14)通过加入50μl体积的0.5M磷酸终止反应。
15)在450nm读出OD并通过从标准曲线插值确定脂连蛋白的量。
以ELISA形式测量血浆/血清中和血浆级分中不同人类脂连蛋白同种型的量。将免疫平板用下面的单克隆抗体之一包被1∶5000稀释度的MAB3604(Chemicon International)、0.5ug/ml的A12820(611645)(BDBiosciences)、0.25μg/ml的MAB10651(R&D Systems，Inc)、1ug/ml的N-ADIP-M1(Roche)，和1ug/ml的N-ADIP-M24(Roche)。具有100μl合适单克隆抗体的平板用平板密封器覆盖并在4℃温育16-20小时。然后用PBS-吐温200.05％洗涤平板3次，PBS-吐温200.05％用于所有随后的洗涤。将平板用300μl PBS缓冲液中的BSA 1％+吐温200.05％封闭1小时，并洗涤3次。向每个平板中加入最终体积50μl的合适的参考标准品(0.0195到10ng/孔)，其用于所有随后的温育。对于脂连蛋白检测的球状的和N-末端结构域，使用来自R&D Systems(cat#1065，在C-末端具有his-标记)的脂连蛋白(1-244)。对于C-末端脂连蛋白检测，使用来自AlexisBiochemicals的脂连蛋白(16-247)(cat#ALX-522-063，具有N-末端FLAG标记)。血浆/血清或血浆级分在具有BSA 0.1％+吐温200.05％的PBS中稀释并加入每个平板。将平板在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，然后洗涤4次。向每个平板中具有BSA 0.1％+吐温200.05的PBS中加入合适的检测抗体并在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，接着洗涤4次。加入显色抗体缀合到辣根过氧化物酶的驴抗兔抗体并在有轨摇床上21-23℃下温育1小时，接着洗涤4次。在3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在下定量结合的缀合到辣根过氧化物酶的抗体。每孔加入50μl TMB溶液，平板用平板密封器盖上并在微型有轨平板摇床上摇动下在21-23℃下温育。在合适的时间加入50μl/孔0.5M磷酸终止反应。在450nm下读出OD并通过从合适的标准曲线插值确定脂连蛋白的量。反应在OD读数小于2的时间终止。该时间在2到10分钟，取决于捕获抗体和检测抗体和它们的浓度。
对脂连蛋白杂交瘤M1和M24的可变重链和轻链cDNA测序 材料和方法 培养杂交瘤细胞并通过标准步骤提取总RNA。见例如，“模拟肝素-诱导的血小板减少症抗体的鼠单克隆抗体的表征(Characterization of amurine monoclonal antibody that mimics heparin-induced thrombocytopeniaantibodies)”.G.M.Arepally，S.Kamei，K.S.Park，K.Kamei，Z.Q.Li，W.Liu，D.L.Siegel，W.Kisiel，D.B.Cines and M.Poncz BLOOD(March 1，2000)95卷No.51533-1540页，“来自任何免疫球蛋白家族的鼠可变区的有效扩增和直接测序(Efficient amplification and direct sequencing of mouse variableregions from any immunoglobulin family)”Thierry Chardes，Sylvie Villard，Gaelle Ferrieres，Marine Piechaczyk，Marine Cerutti，Gerard Devauchelle andBernard Pau FEBS Letters 452(1999)386-394页。
通过标准方法，使用寡聚dT或者反向PCR寡核苷酸作为引物合成第一链cDNA。使用下面的条件PCR扩增可变重链和轻链区cDNA 94C /5分钟 94C /30秒 55C /30秒 72C /90秒 30个循环 72C /10分钟 使用下面的PCR寡核苷酸 来自Ref 1 重链构架1(正向引物)(Seq.Id.No.8) GAG GTGAAG CTG GTG GAG(AT)C(AT)GG 重链恒定区(反向引物)(Seq.Id.No.9) GGG GCC AGT GGA TAG AC 轻链构架1(正向引物)(Seq.Id.No.10) CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGA CTC CA 轻链恒定区(反向引物)(Seq.Id.No.11) GTT GGT GCA GCA TCA GC 来自Ref 2 重链构架1(正向引物)(Seq.Id.No.12) CAG GT(GC)(AC)A(GA)CTG(GC)(A T)G(GC)AG(TA)C(AT)GG 重链恒定区(反向引物)(Seq.Id.No.13) CGA CAA GTC GAC TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC 轻链构架1(正向引物)(Seq.Id.No.14) GAC ATT(CG)AG CT(GC)ACC CAG TCT CCA 轻链恒定区(反向引物)(Seq.Id.No.15) CGA CTAGTC GAC TGG TGG GAAGAT GGATAC AG 通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。轻链扩增子通过凝胶分离并且不经克隆而测序。将重链扩增子亚克隆，并从克隆的质粒测定序列。
结果 测定法开发和标准化 开发了人脂连蛋白的不同测定法。使用的测定法形式是ELISA测定法，其利用特异单克隆抗体作为捕获抗体，含有脂连蛋白的溶液，如合适的标准品、或人血浆或血清，接着加入多克隆抗体(图4和5)。单克隆和多克隆抗体的每种组合代表不同的测定法形式。单克隆抗体加上多克隆抗体的特定组合提供了特定脂连蛋白测定法(图5)。在一些情况下，该特定组合将根本不能测量脂连蛋白(如MAB3604C-末端的组合)，而使用其他组合测量脂连蛋白的不同水平。
为了方便开发ELISA，我们开发了对脂连蛋白的N-末端特异的新的单克隆抗体。这些mAb与N-末端脂连蛋白肽特异反应，并且也与脂连蛋白特异反应，如通过ELISA、蛋白质印迹分析和免疫荧光所测定。这些mAb与多克隆抗体组合进一步用于用ELISA测定法测量人血浆中脂连蛋白水平。
该测定法的基本形式涉及在96孔板上固定特定抗脂连蛋白单克隆抗体(图4和5)。用于研究中的不同的抗脂连蛋白单克隆抗体包括A12820、MAB3604、MAB10651、M1和M24。ELISA测定法的第二种组分是针对脂连蛋白的多克隆抗体。使用了三种不同的多克隆抗体。这些包括N-末端、C-末端和球状多克隆抗体。这三种多克隆抗体识别不同的脂连蛋白结构域。在图6中给出了脂连蛋白ELISA测定法中不同步骤的图示。使用针对脂连蛋白的不同结构域的不同的单克隆抗体或多克隆抗体，可能设定额外的测定法。此类抗体的组合可以提供额外的测定形式，其对于与疾病状态相关的多种脂连蛋白同种型具有区别性质。
使用从商业来源得到的不同的重组脂连蛋白蛋白质将不同的测定法形式标准化(图7-12)。从而，所报告的脂连蛋白的绝对水平是基于相对于用于每种测定法的标准品的定量。
不是所有测定法都能够检测独特的脂连蛋白同种型。因此，对于与三种多克隆抗体的每一种组合的每种mAb，不是所有ELISA测定法都能够测量脂连蛋白，无论其是标准脂连蛋白还是人类血浆中的脂连蛋白。在一些情况下，仅仅两种多克隆抗体与一种单克隆抗体组合用于测量脂连蛋白水平。对于其他单克隆抗体，多克隆抗体的所有三种组合都能够检测脂连蛋白。我们已经观察到通过抗体组合检测到的脂连蛋白同种型水平可以在测定法之间显著改变。对于一些，可以检测为约0.05μg/ml(M24-N-末端pAb)的脂连蛋白水平，对于其他可以检测约15μg/ml(M24-C-末端pAb)的脂连蛋白水平，其它具有高达约60μg/ml(A12820-球状pAb)的水平。
通过不同测定法表征脂连蛋白同种型 一旦建立了不同测定法，我们注意到不同的测定法能够识别不同水平的脂连蛋白。我们然后试图确定测定法之间不同的本质。因为已经报导脂连蛋白以几种不同的分子形式存在，所以我们寻求确定所述测定法是否可以识别不同的脂连蛋白分子形式(Berg et al，内分泌转移倾向(TrendsEndocrinol Metab).2002 Mar；13(2)84-9.；Trujillo和Scherer，J Intern Med.2005Feb；257(2)167-75中的综述)。速度梯度沉降提供了基于大小分离分子的简单方法。已经报导了通过速度沉降分离脂连蛋白(Pajvani UB et al(2003).生物化学杂志(J.Biol.Chem).2789073-9085)。有额外的方法可基于大小分离分子，如凝胶过滤层析，其也可以用于该目的。
通过如所述的速度沉降分离人血浆样品，并收集级分。为了确定脂连蛋白分布，通过ELISA使用不同的测定法形式测定级分的等分试样。通过不同测定法形式测定每个级分中脂连蛋白的量，然后相对于来自速度梯度分级分离的级分数作图。数据在图13-18中给出。所观察到的图式表明脂连蛋白水平在测定法与测定法之间不同。MAB3604与球状或N-末端pAb组合主要识别存在于级分3-7中的仅较小分子量脂连蛋白同种型(图13)。另一方面，MAB10651与所有三种pAb组合主要识别存在于级分10-16中的较大分子量的脂连蛋白同种型(图15)。通过测定法测定的脂连蛋白的量不同，而MAB10651与球状pAb组合测量到最高水平，而MAB10651与N-末端pAb组合测量最少量的脂连蛋白。从而，这三种不同的测定法可以主要检测较大的脂连蛋白同种型，而检测的脂连蛋白蛋白质水平不同，提示抗体的不同组合识别了脂连蛋白分子中的一些差异。
当使用mAb A12820与三种不同的多克隆抗体组合对分级分离的人血浆样品测定脂连蛋白时，观察到非常不同的图式(图14)。在许多不同的级分中发现脂连蛋白水平，在级分5中的峰对应于较小分子量的脂连蛋白。也有来自级分7-17的脂连蛋白宽峰，其在级分13附近有一个峰。所有三种测定法观察到类似的图式，但是通过每种测定法检测到的脂连蛋白水平是不同的(图14)。从而，这三种不同的测定法可以检测不同的脂连蛋白同种型，并且通过测定法检测到的脂连蛋白蛋白质水平不同，提示在不同抗体组合识别的脂连蛋白分子中存在一定的差异。
当使用mAb脂连蛋白M1与三种不同的多克隆抗体组合对分级分离的人血浆样品测定脂连蛋白时，观察到非常不同的图式(图16)。mAb脂连蛋白M1与C-末端pAb组合产生最高水平的脂连蛋白。该形式识别的脂连蛋白广泛分布于级分3-20中。对于mAb脂连蛋白M1与球状和N-末端pAb组合也观察到脂连蛋白的可检测水平。该水平低得多，并且似乎在许多不同的级分中分布。
当使用mAb脂连蛋白M24与三种不同的多克隆抗体组合对分级分离的人血浆样品测定脂连蛋白时，观察到非常不同的图式(图17)。mAb脂连蛋白M24与C-末端pAb组合产生最高水平的脂连蛋白。该形式识别的脂连蛋白广泛分布于级分3-20中。对于mAb脂连蛋白M24与球状和N-末端pAb组合也观察到脂连蛋白的仅仅可检测的水平。该水平低得多，并且似乎在许多不同的级分中分布。
使用脂连蛋白R&D测定法测定分级分离的人血浆样品的脂连蛋白(图18)。发现脂连蛋白分布在级分3-20中，具有两个峰，一个在级分5中，第二个更丰富的峰在级分13中。所观察到的图式不同于其他脂连蛋白测定法。
速度沉降导致清楚地表明单克隆和多克隆抗体的不同组合识别不同分子量形式的脂连蛋白。不仅脂连蛋白的大小不同，如通过速度沉降不同确定，而且所检测到的脂连蛋白水平也是非常不同的。因此，不同的抗体组合代表不同的测定法形式，其特异识别不同的脂连蛋白分子形式(同种型)。这些测定法形式的可用性提供了评估脂连蛋白同种型是否与不同的生理或疾病状态相关的机会。
正常和糖尿病血浆样品的筛选 为由正常个体、糖尿病患者、葡萄糖耐受不良和空腹葡萄糖受损个体组成的个体群体测定每种脂连蛋白同种型水平。收集空腹血浆样品并保存在-80℃备用。然后测试样品等分试样以测定多种脂连蛋白同种型的水平。将通过不同ELISA测定法形式测定的脂连蛋白水平对空腹血糖水平作图，并在图19-24中给出。脂连蛋白水平相对于空腹血糖水平的分布在不同测定法之间不同。在下面给出统计学分析(表1中概述)。一些脂连蛋白测定法没有显示在脂连蛋白水平和空腹血糖之间的任何差别。这些测定法包括商业脂连蛋白R&D测定法(图24)、MAb 3604测定法(图19)、和MAB 10651测定法(图21)(表1中概述)。相反，使用脂连蛋白mAb M1(图22)、脂连蛋白mAb M24(图23)和mAb 12820(图20)的脂连蛋白测定法表明脂连蛋白水平与空腹葡萄糖值的显著相关性(表1中总结)。
结果的统计学分析 用Logistic回归模型，使用SAS 9.1(SAS Institute，Carey，NC)的logistic程序检查了多种脂连蛋白形式区分对照与II型糖尿病患者的能力。为每种脂连蛋白形式运行单独的模型。在每个模型中，组状态(即，对照或糖尿病)用作输出变量并且预测子变量包括一种脂连蛋白形式。年龄、人体质量指数(BMI)和胰岛素用作每个模型中的协变量。用SAS 9.1的freq和logistic程序计算脂连蛋白形式的灵敏性和特异性。为三种多克隆形式计算接收器运行特征(ROC)图以显示脂连蛋白浓度的多种截断点的灵敏性和特异性的变异性。提供曲线下面积(AUC)作为每个ROC曲线的总结性统计值。可以将AUC解释为将从正常患者正确鉴定真实病例(即II型糖尿病患者)的概率。例如，1.0的AUC将代表没有错误分类的完美测试，而AUC小于0.5的测定法将不比随机分配更好。具有AUC为0.65和更高的ROC图、更优选AUC为0.70和更高的ROC图的测定法表明显著相关性并且预测值作为对所研究的疾病状态如糖尿病(II型)的易感性的指标。所有不同测定法的结果在表1中总结。
表1基于126名II型糖尿病患者和124名正常对照对多种脂连蛋白形式的Logistic回归和相关性结果。为每种形式运行单独的回归模型，对年龄、体重指数(BMI)和胰岛素水平进行调节。为每种形式给出Pearson相关系数，表明其与空腹血糖关系的强度。
指出了M1和M24杂交瘤之间的差异 在分析前，筛选数据的正常性和异常值(outlier)的存在。这些数据遵循正态性假设并且因此不进行转化。在分析前用Grubb’s检验来检验异常值的存在并且将p＜0.05时显著异常的数据点去除。
群体样本特征如下检查了N＝126名II型糖尿病患者(T2D)和N＝124名正常个体。该样本中用于T2D的诊断标准是空腹血糖(FBG)＞126。
对M1球状形式的logistic回归结果表明球状形式是组状态的显著预测子(Wald卡方(Chi-square)＝7.26；p＜0.01)。球状形式的优势率(OR＝0.84，95％c.i.0.74-0.95)显著小于1，表明低水平的M1球状形式与II型糖尿病风险相关(图25)。图25中的ROC曲线显示了3.0，4.0，和5.0μg/ml的球状浓度截断值的灵敏性和特异性。M1球状形式的曲线下面积为0.731。
对M1N-末端形式的logistic回归结果表明N-末端形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝6.01；p＜0.01)。球状形式的优势率(OR＝0.53，95％c.i.0.32-0.88)显著小于1，表明低水平的M1N-末端形式与II型糖尿病风险相关(图26)。图26中的ROC曲线显示了0.8和1.0μg/ml的N-末端浓度截断值的灵敏性和特异性。N-末端形式的曲线下面积为0.705。
对M24球状形式的logistic回归结果表明球状形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝11.9；p＜0.0005)。球状形式的优势率(OR＝0.47，95％c.i.0.30-0.72)显著小于1，表明低水平的M24球状形式与II型糖尿病风险相关(图27)。图27中的ROC曲线显示了1.2和1.5μg/ml的球状浓度截断值的灵敏性和特异性。M1球状形式的曲线下面积为0.742。
对M24C-末端形式的logistic回归结果表明C-末端形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝15.9；p＜0.0001)。C-末端形式的优势率(OR＝0.87，95％c.i.0.80-0.92)显著小于1，表明低水平的M24C-末端形式与II型糖尿病风险相关(图28)。图28中的ROC曲线显示了10.0和15.0μg/ml的C-末端浓度截断值的灵敏性和特异性。M24C-末端形式的曲线下面积为0.740。
对A12820球状形式的logistic回归结果表明A12820球状形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝15.9；p＜0.0001)。A12820球状形式的优势率(OR＝0.87，95％c.i.0.80-0.92)显著小于1，表明低水平与II型糖尿病风险相关(图29)。图29中的ROC曲线显示了3.0，4.0和5.0μg/ml的A12820球状浓度截断值的灵敏性和特异性。M1球状形式的曲线下面积为0.714。
对A12820 N-末端形式的logistic回归结果表明A12820 N-末端形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝5.18；p＝0.02)。A12820 N-末端形式的优势率(OR＝0.97，95％c.i.0.95-0.99)显著小于1，表明低水平与II型糖尿病风险相关(图30)。图30中的ROC曲线显示了11.0和16.0μg/ml的A12820N-末端形式浓度截断值的灵敏性和特异性。M1 N-末端形式的曲线下面积为0.673。
对A12820 C-末端形式的logistic回归结果。A12820 C-末端形式是组状态的显著预测子(Wald卡方＝4.91；p＝0.03)。A12820 C-末端形式的优势率(OR＝0.97，95％c.i.0.93-0.99)显著小于1，表明低水平与II型糖尿病风险相关(图31)。图31中的ROC曲线显示了12.0和15.0μg/ml的A12820C-末端形式浓度截断值的灵敏性和特异性。M1球状形式的曲线下面积为0.663。
剩余测定法的统计学分析在表1中总结。这些似乎没有显示来自所进行的分析的显著性。
杂交瘤细胞系M1和M24的CDR的序列测定 测定mAb脂连蛋白M1和M24 IgG cDNA的CDR的序列并在图32和33中显示。两种IgG的序列非常相似，然而却不同。这两种IgG蛋白质都结合到N-末端脂连蛋白区，包含氨基酸19-34，ETTQGPGVLLPLPKGAC(SEQ ID NO.3)。
讨论 识别脂连蛋白的ELISA测定法 开发了识别脂连蛋白的ELISA测定法。不同的单克隆抗体用作捕获抗体，与三种不同的多克隆抗体组合。在多数情况下，抗体组合能够识别脂连蛋白，而一些组合不能检测脂连蛋白(MAB 3604 C-末端)。通过使用脂连蛋白的重组形式可以标准化所有测定法。标准化提供了测定发现于生物样品如血浆中的脂连蛋白水平的基础。然后ELISA测定法可以用于测量脂连蛋白水平，以确定脂连蛋白分子形式的大小分布，和确定特定脂连蛋白同种型的浓度是否与特定生理状态相关。重要的是注意到测量前，本发明的测定法不需要任何样品预处理，或者样品变性。同样，所述测定法测量脂连蛋白的天然形式。
不同的脂连蛋白分子形式 为了阐明不同的脂连蛋白分子形式被不同的ELISA测定法识别，将人类血浆通过速度沉降分级分离，并使用不同的ELISA测定法测定级分的脂连蛋白水平。图13-18清楚地表明脂连蛋白水平的分布是显著不同的，取决于使用的多克隆和单克隆抗体的组合。对于一些测定法，仅仅识别了低分子量脂连蛋白形式(图13，级分4、5、6)。对于其他测定法，识别了仅仅较高分子形式的脂连蛋白(图15，级分11-14)。最后，一些测定法识别较高和较低分子量形式的脂连蛋白(图14，16，17)。测定法不仅识别不同大小的脂连蛋白，如通过速度沉降图谱阐明(图13-18)，而且一些测定法(图14，15，16，17)识别不同水平的脂连蛋白，再次提示在被不同测定法识别的脂连蛋白分子类型中存在独特差异。所述测定法识别不同的脂连蛋白分子量形式这一事实提供的有力的简单工具来评估个体之间脂连蛋白的差异，和确定任一脂连蛋白形式是否与疾病状态相关。
脂连蛋白形式水平在个体之间不同 当用不同的测定法测定不同个体中脂连蛋白水平时，在所观察的脂连蛋白水平中有显著差异。对于一些测定法，脂连蛋白水平相差10-50倍。这些结果提示一些脂连蛋白测定法可以测量存在于人类血浆或血清中的多数脂连蛋白同种型，而其他测定法测量非常特异的脂连蛋白同种型。例如，mAb 12820与球状结构域pAb组合检测30-120μg/ml的脂连蛋白。相反，mAb脂连蛋白M24与N-末端多克隆抗体组合仅仅检测0.02-0.1μg/ml。该差异代表在人类血浆中检测的脂连蛋白水平中约1000倍差异。这些差异在图13-18中是显著的，其中测定分级分离的人类血浆中的脂连蛋白水平。这些差异也在图19-24中观察到。这些差异的一些在与表型的相关性方面是显著的(表1中总结)而其他的差异不是显著的。表征来自多种疾病状态的血浆样品的能力将提供显著的相关性。
某些脂连蛋白形式与葡萄糖水平相关 所有不同的脂连蛋白测定法用于筛选人类血浆样品收集物以寻找与葡萄糖的相关性。我们观察到某些脂连蛋白同种型显示出与葡萄糖的中等强度相关性。显示出与葡萄糖的显著相关性的测定法是mAb脂连蛋白M1球状和N-末端(图22，25，26)，mAb脂连蛋白M24球状和C-末端(图23，27，28)，mAb A12820球状、N-末端和C-末端(图20，29，30，31)，和MAB1051N-末端和C-末端(表1中总结)。其他测定法没有一种(包括R&D商业化脂连蛋白测定法)表明与葡萄糖的任何显著关联。
某些脂连蛋白形式预测糖尿病状态 mAb脂连蛋白M1球状和N-末端(图25，26)、mAb脂连蛋白M24球状和C-末端(图27，28)，和mAb 12820球状(图29)的低脂连蛋白水平是糖尿病的显著预测子(表1中总结)。该观察结果提示这些测定法对于确定哪些正常个体将患糖尿病、哪些个体将具有对特定糖尿病治疗的最佳应答，哪些个体将对于他们的糖尿病有最好的预后是重要的。ROC图表明特定形式对于临床中的应用具有良好水平的特异性和灵敏性。特别地，60％或更大的灵敏性/特异性水平可以用于临床。使用这些测定法得到进一步预测值的能力取决于收集纵向样品，以确定与疾病发展和与治疗结果的相关性。
上面的实施例不意在限制本发明的范围，这些实施例阐明了本发明的单克隆和多克隆抗体、本发明的ELISA方法和脂连蛋白形式/水平对某些疾病状态如糖尿病的预测/诊断方法。这些实施例被包括用于说明的目的并且本发明仅仅受到本文的权利要求范围的限制。
PA093338C.SEQ
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>脂连蛋白抗体和测量脂连蛋白的方法
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权利要求
1.针对脂连蛋白N-末端的单克隆抗体。
2.权利要求1的抗体，其中包含Seq.Id.No.3的脂连蛋白肽用于产生抗体。
3.权利要求1或2的抗体，其中它包含选自由Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的氨基酸21-36、氨基酸52-58和氨基酸91-99和Seq.Id.No.5或Seq.Id.No.7的氨基酸25-33、氨基酸48-64和氨基酸97-104组成的组的至少两个CDR序列。
4.权利要求3的抗体，其中它包含选自由Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的氨基酸21-36、氨基酸52-58和氨基酸91-99和Seq.Id.No.5或Seq.Id.No.7的氨基酸25-33、氨基酸48-64和氨基酸97-104组成的组的至少3个CDR序列，更优选至少4个、甚至更优选至少5个、最优选6个CDR序列。
5.权利要求1-4的抗体，其中该抗体包含选自Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的轻链可变区和选自Seq.Id.No.5或7的重链可变区。
6.权利要求1-5的抗体，其中该抗体包含Seq.Id.No.4中给出的轻链可变区和Seq.Id.No.5中给出的重链可变区。
7.权利要求1-5的抗体，其中该抗体包含Seq.Id.No.6中给出的轻链可变区和Seq.Id.No.7中给出的重链可变区。
8.多核苷酸序列，其包含编码选自Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的轻链可变区的序列。
9.多核苷酸序列，其包含编码选自Seq.Id.No.5或7的重链可变区的序列。
10.权利要求8或9的多核苷酸序列，其中所述序列选自由Seq.Id.No.16、Seq.Id.No.17和Seq.Id.No.18组成的组。
11.诊断人类受试者的糖尿病易感性的方法，其包括在测定法中至少一种脂连蛋白单克隆抗体和至少一种脂连蛋白多克隆抗体用于筛选患者样品的脂连蛋白，其中对应于具有0.65或更高值的AUC的接受者操作特征曲线(ROC)图的测定值表明糖尿病易感性。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一种单克隆抗体选自权利要求1到7的抗体和mAb A12820。
13.权利要求11或12的方法，其中所述至少一种单克隆抗体是mAb脂连蛋白M1并且至少一种多克隆抗体选自由球状和N-末端抗体组成的组。
14.权利要求11或12的方法，其中所述至少一种单克隆抗体是mAb脂连蛋白M24并且至少一种多克隆抗体选自由球状和C-末端抗体组成的组。
15.权利要求11或12的方法，其中所述至少一种单克隆抗体是mAbA12820并且至少一种多克隆抗体选自由球状，N-末端和C-末端抗体组成的组。
16.权利要求11-15的方法，其中所述测定法是ELISA。
17.权利要求11-16的方法，其中AUC值为0.70或更高。
18.权利要求1-7的抗体或mAb A12820与至少一种脂连蛋白多克隆抗体组合用于诊断人类受试者的糖尿病易感性的用途。
19.权利要求18的用途，其中所述多克隆抗体选自由球状，N-末端和C-末端脂连蛋白抗体组成的组。
20.针对脂连蛋白N-末端的多克隆抗体，其中包含Seq.Id.No.1的脂连蛋白肽用于产生抗体。
21.针对脂连蛋白C-末端的多克隆抗体，其中包含Seq.Id.No.2的脂连蛋白肽用于产生抗体。
22.针对脂连蛋白球状结构域的多克隆抗体，其中包含Seq.Id.No.19的氨基酸107-244的脂连蛋白肽用于产生抗体。
20.如前述的本发明。
全文摘要
本发明涉及测量存在于人类血浆/血清中的人类脂连蛋白的不同形式的方法，更具体地所述方法基于ELISA测定法，其利用针对脂连蛋白的不同的单克隆抗体，与针对人脂连蛋白的不同结构域的不同多克隆抗体组合。本发明还提供了脂连蛋白的独特同种型和其抗体，包括多克隆和单克隆抗体。
文档编号G01N33/68GK101583875SQ200880001713
公开日2009年11月18日 申请日期2008年1月3日 优先权日2007年1月8日
发明者查尔斯·布格哈特, 雅雷马·彼得·科汉, 埃里克·罗伊·拉斯马森 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司