专利名称：：通过spe-lc-ms-ms定量测定尿中的利塞膦酸盐的制作方法通过SPE-LC-MS-MS定量测定尿中的利塞膦酸盐发明领域本发明涉及用于定量测定尿样中的利塞膦酸盐的SPE-LC-MS-MS方法。
背景技术：
：的有效治疗药物(I.Elomaa，C.Blomqvist，L.Porkka，T.Holmstrom，T.Taube，C丄amberg-AUardt，G.H.Borgstrom.丄fl"cC1985;i:1155;J.P.Kosonen，//^r"r附^,V/weJ^wfl/.1992;10:881;J.A.Cantril，H.M.Buckler,D.C.Anderson,及/re"附flto/.D/y.1986;45:1012;H.Fleisch,//w肌及"1997;29:145)。骨吸收的预防是由对成熟的破骨细胞功能的抑制作用产生的。已经公开了数种二膦酸盐的生物分析方法。通常，那些方法主要基于具有UV、荧光(柱前或柱后衍生化)、电导率、火焰光度磷选择性、折射率和探索性光散射检测的离子交换和离子对色镨(V.Virtanen，L.H.J.Lajunen，/Oi/wmitogi*.1993;617:291;V.Virtanem，L.H.J.Lajunen，T"/aw似1993;40:661;S.E.Meek,D.J.PietrzykC7^附.1988;60:1397;M.J.Lovdahl，D.J.Pietrzyk，/.CAfwmitogr.A1999;850:143;R.Niemi，H.Taipale，M.Ahlmark，J.Vepsalainen，T.Jarvinen,/Orro附fltog/;B1997;701:97;T丄.Chester,爿w"/.C7^肌1980;52:1621)。GC-MS技术与酰化和硅烷化组合，已被用于测定人泉中的利塞膦酸盐(D.Y.Mitchell,R.A.Eusebio，L.E.Dunlap,K.A.Pallone，J.D.Nesbitt，D.A.Russell,M，E.Clay,P.J.Bekker，/%",附.及"1998;15:228)。应用酶联免疫吸附测定(ELISA)已实现了更灵敏的分析人泉中的利塞膦酸盐的方法(D.Y.Mitchell,M.A.Heise，K.A.Pallone，J.D.Nesbilt，M.E.Clay,J.D.Nesbitt，D.A.Russell,C.W.Melson，/.C7,Vi.i^ffAvwffco/.1999;48:536)。已经才艮道了具有UV检测的柱转换离子对HPLC定量人尿中的利塞膦酸盐(P.T.Vallano，S.B.Shugars，W.F.Kline,E.J.Woolf，B.K.Matuszewski,义(/wmitog/".B1003;794:23)。尽管这些方法中有一些表现出非常高的灵敏度，但却极为复杂和耗时。近来，更多研究已着手开发用萃取后或在柱上衍生化测定利塞膦酸盐的LC/MS/MS法(L.S.Zhu，V.N.Lapko，J.W.Lee,Y.J.Basir，C.Kafonek，R.Olsen,C.Briscoe,Rapidcommun.MassSpectrom.2006,20:3421;S.Turcotte，J.Couture,F.VaHee，AAPSPharmSciVol.5,No，4，AbstractM1357(2003)。发明概述本发明涉及定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将内标加入至尿样中；b)将尿样应用于OasisHLB柱，其中柱已经用曱醇预处理；c)用约1。/。(v/v)在水中的TEA和约1。/。(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；d)在真空下，用包含约3mMEDTA的约M。/o(v/v)甲醇和约40%(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐至少一次；e)将洗脱液蒸发并且用10%(v/v)甲醇和90%(v/v)0.05MNH4Ac-NH4OH緩冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和内标的样品混合物5和f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物。前述用于定量测定尿样中的利塞膦酸盐的SPE-LC-MS-MS方法相对简单、灵敏、精确和准确，并且将在以下附图和详细描述的帮助下更充分讨论。附图简述图1是利塞膦酸盐的ESI-MS图i普。图2，氧利塞膦酸盐的ESI-MS图镨。图3是小鼠尿中的利塞膦酸盐的色i普图(LLOQ10ng/mL)，其中在保留时间2.27分钟处的峰的强度大于空白小鼠尿样的HPLC图谱中相同峰的强度的3倍。这意味着可以定量小鼠尿中10ng/mL浓度的利塞膦酸盐。图4是小鼠对照尿的色谱图。图5是利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的典型色"^普图。图6是小鼠尿中的利塞膦酸盐的典型校正曲线。发明详述定义和缩略语上文和本发明说明书的通篇所用的以下缩略语，除非另外指明，应当理解为具有以下含义3mu原子质量单位Cps每秒计数CV%变异系数百分数Diff%理论浓度和测定浓度的差异百分数EDTA乙二胺四乙酸ESI电喷雾离子化HPLC高压液相色谱LC-MS高压液相色语-质谱IXOQ定量下限MRM多反应监测MS质i普m/z质量/电荷NH4Ac乙酸铵NH4OH氢氧化铵SD标准差SPE固相萃取TEA三乙胺v/v体积/体积上文和本发明说明书通篇所用的以下术语，除非另外指明，应当理解为具有以下含义。"脱氧利塞膦酸盐"指的是(l-膦酰基-2-吡咬-3-基-乙基)膦酸，具有以下化学结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>"InertsilPhenyl-3HPLC柱"由Varian，Inc生产和销售。"内标，，是分析中以恒定量加入至样品、空白和校正标准中的化学物质。通过将分析物信号与内标信号的比值作为标准的分析物浓度的函数绘图，可以将该化学物质用于校正。这用于测定和校正样品制备或样品进样过程中的分析物的损失。特别的是，内标是与分析物具有类似但又不同的化学结构的化合物。"OasisHLB柱"由WatersCorporation生产和销售。该柱的尺寸取决于尿样中的利塞膦酸盐的浓度。尿样中的利塞膦酸盐的浓度越低，柱的尺寸就应越大，并且尿样和洗涤该柱和洗脱物利塞膦酸盐的溶液的体积就应越大。"利塞膦酸盐"指的是(l-羟基-l-膦酰基-2-吡吱-3-基-乙基)膦酸，其具有以下化学结构"尿样"指的是哺乳动物尿样，包括人尿样。本发明具体实施方案本发明的一个特别的实施方案是用于定量测定^#中的利塞膦酸盐的方法，其中尿样是小鼠或大鼠尿样。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中内标pUt氧利塞膦酸盐。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中OasisHLB柱是30mgOasisHLB柱。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中内标是作为水溶液、更特别的是作为约10照/mL水溶液加入的脱氧利塞膦酸盐。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中尿样量为约0.4mL。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中柱已经用约lmL甲醇预处理。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mLl。/。(v/V)在水中的TEA预处理。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中柱用约0.5mL约1。/。(v/v)在水中的TEA和约0.5mL约l%(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中包含约3mMEDTA的约60y。(v/v)曱醇和约40。/。(v/v)水的混合物的量为约1.5mL。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中利塞膦酸盐用约0.75mL包含约3mMEDTA的约60V。(v/v)曱醇和约40。/)(v/v)水的混合物洗脱2次。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中10。/c(v/v)甲醇和90%(v/v)0.05MNH4Ac-NH4OH緩冲液的混合物的量为约100nL。本发明的另一个特别的实施方案是定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，其中内标是脱氧利塞膦酸盐，并且用LC-MS/MS系统分析样品混合物，包括通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v)，并且其中溶液A是约90Vo(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2。/。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩冲液。本发明的另一个特别的实施方案是用于定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将约100pL约10照/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液加入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；b)将小鼠或大鼠M应用至30mgOasisHLB柱上，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL1。/。(v/v)在水中的TEA预处理；c)用约0.5mL1。/。(v/v)在水中的TEA和约0.5mL1。/0(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；d)在真空下，用约1.5mL包含约3mMEDTA的约60。/。(v/v)甲醇和约40。/。(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐；e)蒸发洗脱液并且用约100约K)。/o(v/v)甲醇和约卯Q/o(v/v)约0.05MNH4Ac-NH40H緩冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v)，并且其中溶液A是约90。/。(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2。/。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩沖液。本发明的另一个特别的实施方案是用于定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将约100jaL约10|Lig/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液加入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；b)将小鼠或大鼠尿样应用至30ragOasisHLB柱上，其中柱已经用约1mL曱醇、随后用约0.5mL1%~)在水中的TEA预处理；c)用约0.5mL1。/。(v/v)在水中的TEA和约0.5mLP/o(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；d)在真空下，用约0/75mL包含约3mMEDTA的约60。/。(v/v)甲醇和约40Yo(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐2次；e)蒸发洗脱液并且用约100约10Vo(v/v)甲醇和约卯。/o(v/v)约0.05MNH4Ac-NH40H緩沖液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v)，并且其中溶液A是约卯。/。(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2。/。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩冲液。应当理解的是，本发明涵盖了上述特别的实施方案的所有适合的组合。本发明将在仅作为说明出现的以下实施例中得到更清晰的说明，并且不认为以下实施例限制本发明的范围。实施例步骤l:在小鼠或大鼠尿中制备利塞膦酸盐尿标准液通过将利塞膦酸盐溶于HPLC级水中制备1mg/mL利塞膦酸盐储备液。通过将250nL、100pL和50pL的1mg/mL利塞膦酸盐储备液用HPLC级水分别稀释至1mL制备250pg/mL、100吗/mL和50ng/mL利塞膦酸盐标准液。将250jng/mL、100照/mL和50吗/mL利塞膦酸盐标准液适当稀释以得到25照/mL、10|Hg/mL、5pg/mL、2.5pg/mL和1pg/mL利塞膦酸盐工作液。通过将4iaL每种工作液加入至0.4mL小鼠或大鼠对照尿(即没有施用利塞膦酸盐的小鼠或大鼠的尿)中制备范围为10ng/mL至2500ng/mL的利塞膦酸盐尿标准液。步骤2:样品制备将0.4mL收集自已经施用利塞膦酸盐的小鼠或大鼠的尿样转移至10x75mm玻璃培养管中。将100内标储备液(即10吗/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液)和1005%在水中的TEA分别加入至所有利塞膦酸盐尿标准液和^#中。样品提取是用30mgOasisHLB柱(lmL，由WatersCorporation生产和销售，目录号WAT094225)进行的。将柱用1mL甲醇、随后用0.5mL1%在水中的TEA处理。将尿样应用至柱上。用0.5mL1%在水中的TEA和0.5mL1%在甲醇中的甲酸洗涤柱，然后用0.75mL包含3mMEDTA的60%在水中的甲醇的混合物经两个连续洗脱步骤洗脱分析物和内标。在样品提取的过程中，每一步均应用真空(5-15Psi)以推动液体通过柱。将洗脱液在氮气、37。C下干燥70分钟，然后将残留物在100pL10%甲醇/卯％0.05MNH4Ac-NH4OH緩冲液(pH9.26)中重建。步骤3:LC-MS/MS分析应用API4000LC-MS/MS系统(由MDSSciex销售)分析利塞膦酸盐，该系统包括ShimadzuLC-10AD泵，SCL-10AVP系统控制器，LeapTechnologiesHTSPAL自动进样器和API4000三重四级杆质谱长。在6分钟内，在InertsilPhenyl-3HPLC柱(3^L，50x030mm,由Varian，Inc.生产和销售，目录号0408-050x030)上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和内标，其中溶液A的量从10%增加至95°/。。溶液A是卯。/。在水中的甲醇，并且溶液B是10mM含2。/。三乙胺的乙酸铵-乙酸緩沖液&11=5.0)。流速恒定保持在0.2mL/分钟。将样品(10nL重建液)直接注射至HPLC柱上。质i普仪程序设定为在负离子模式下以-58伏碰撞能量监测利塞膦酸盐的跃迁m/z281.9^63.1。m/z265.8+79.2用于测量脱氧利塞膦酸盐内标。离子源温度设定为350'C。应用6分钟的分析运行时间。结果线性利塞膦酸盐小鼠或大鼠尿标准液的测定从10至2500ng/mL呈线性，其LLOQ为10ng/mL。LLOQ测定准确度为14.8%，精密度为17.8%(n=3)。表1中给出了校正过程中获得的回归参数。日间分析获得利塞膦酸盐的相关系数为0.98或更高。图6显示了典型的校正曲线。表l.小鼠尿中的利塞膦酸盐的回归M<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>特异性在保留时间2.27分钟时，发现小鼠对照尿中一小峰，但是LLOQ(IOng/mL)的峰高大于小鼠对照尿中的峰强度的3倍(参见图3和图4)。因此，可以定量浓度在10ng/mL的利塞膦酸盐。精密度精密度以历经研究持续时间在每个对照水平处测量的浓度变异系数的百分数表示。小鼠尿中的对照的日内变异系数的范围为2.2至9.6%。3个浓度水平对照的日间精密度的范围为5.2至10.3%。标准液的日内和日间精密度的范围为0.3至26%。准确度测定准确度以平均测定的质量对照浓度和理论值之间的差异的百分数表示o小鼠尿对照的日内测定准确度的范围为-5.3至4.4%。应用3个浓度水平的对照测量历经3个分析日的日间准确度。日间准确度的范围为-4.0至6.0%。小鼠尿标准狄算(back画calculated)浓度的准确度位于士150/0内。表2.小鼠尿利塞膦酸盐校正标准液的准确度和精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3.小鼠尿利塞膦酸盐质量对照的准确度和精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>回收率与提取的具有添加的纯标准品(neatspiked)的小鼠尿空白相比，提取的小鼠尿中的利塞膦酸盐的回收率为约51.3%。表4.小鼠尿样的利塞膦酸盐的回收率(250ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本发明可以在其它特别形式中实施而不脱离本发明主旨或基本属性。权利要求1.定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将内标溶液加入至尿样中；b)将尿样应用于OasisHLB柱，其中柱已经用甲醇预处理；c)用约1％(v/v)在水中的TEA和约1％(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；d)在真空下，用包含约3mMEDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐至少一次；e)将洗脱液蒸发并且用10％(v/v)甲醇和90％(v/v)0.05MNH4Ac-NH4OH缓冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和内标的样品混合物；和f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物。2.权利要求l的方法，其中尿样是小鼠或大鼠尿样。3.权利要求1的方法，其中内标是脱氧利塞膦酸盐。4.权利要求l的方法，其中内标是作为水溶液加入的脱氧利塞膦酸盐。5.权利要求1的方法，其中内标是作为约10吗/mL水溶液加入的脱氧利塞膦酸盐。6.权利要求1的方法，其中OasisHLB柱是30mgOasisHLB柱。7.权利要求1的方法，其中尿样量为约0.4mL。8.权利要求1的方法，其中柱已经用约1mL甲醇预处理。9.权利要求l的方法，其中柱已经用约lmL甲醇、随后用约O.SmL1。/。(v/v)在水中的TEA预处理。10.权利要求1的方法，其中柱用约0.5mL约1。/。(v/v)在水中的TEA和约0.5mL约1。/。(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤。11.权利要求1的方法，其中包含约3mMEDTA的约60。/d(v/v)甲醇和约40。/。(v/v)水的混合物的量为约1.5mL。12.权利要求1的方法，其中利塞膦酸盐用约0.75mL包含约3mMEDTA的约60。/。(v/v)甲醇和约40。/。(v/v)水的混合物洗脱2次。13.权利要求1的方法，其中10。/0(v/v)曱醇和90%(v/v)0.0SMNH4Ac-NH4OH緩冲液的混合物的量为约100pL。14.权利要求1的方法，其中内标是脱氧利塞膦酸盐，并且用LC-MS/MS系统分析样品混合物，包括通过HPLC在InertsilPhenyl画3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v),并且其中溶液A是约90。/。(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2。/。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩冲液。15.定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将约100jaL约10|Hg/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液加入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；b)将小鼠或大鼠尿样应用至30mgOasisHLB柱上，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL1。/0(v/v)在水中的TEA预处理；c)用约0.5mL1%0)在水中的TEA和约0.5mLly。(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；d)用约1.5mL包含约3mMEDTA的约60。/。(v/v)甲醇和约40%(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐；e)蒸发洗脱液并且用约100jiL约lt)。/o(v/v)甲醇和约卯。/。(v/v)约0.05MNH4Ac-NH4OH緩冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v)，并且其中溶液A是约90。/。(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2V。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩冲液。16.定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括a)将约100pL约10]Lig/mL脱氧利塞膦酸盐水溶、;^>入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；b)将小鼠或大鼠^#应用至30mgOasisHLB柱上，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL1。/。(v/v)在水中的TEA预处理；c)用约0.5mL1。/0(v/v)在水中的TEA和约0.5mL1%~)在曱醇中的甲酸洗涤柱；d)用约0.75mL包含约3mMEDTA的约60%(v/v)曱醇和约40%(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐2次；e)蒸发洗脱液并且用约100nL约10。/。(v/v)甲醇和约卯。/。(v/v)约0.05MNH4Ac-NH40H緩冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和i)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10。/。(v/v)增加至约95%(v/v)，并且其中溶液A是约90。/。(v/v)在水中的曱醇，并且溶液B是约10mM含2。/。(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸緩冲液。全文摘要本发明涉及用于定量测定尿样中的利塞膦酸盐的SPE-LC-MS-MS方法。文档编号G01N33/52GK101657722SQ200880005036公开日2010年2月24日申请日期2008年3月5日优先权日2007年3月7日发明者沈力铎,罗永义申请人:塞诺菲-安万特美国有限责任公司